具生物活性和去除重金属的动物饲料添加剂及制备方法

摘要

本发明公开了一种具生物活性和去除重金属的动物饲料添加剂，由以下重量份的原料制备而成：竹叶炭黑20‑40份、白芍提取物浓缩液5‑15份、竹叶提取物浓缩液8‑10份、洋甘菊提取物浓缩液10‑60份、大青叶提取物浓缩液10‑20份、辛烯基琥珀酸淀粉钠10‑30份。本发明还公开了制备方法，具体为将上述各原料混合，超声，高压均质，获得分散相平均粒径300‑500µm的稳定微乳液。本发明以竹叶炭黑为基材，经复合改性并与多种天然产物，制备兼具重金属去除功能和生物活性功能的动物饲料添加剂，可用于饲养多种动物，去除重金属性能高、稳定性高，而且含有竹叶黄酮、芹菜素等营养物质和生物活性物质，增加动物的免疫力。

说明书

技术领域

本发明属于饲料添加剂技术领域，具体涉及一种具生物活性和去除重金属的动物饲料添加剂及制备方法。

背景技术

竹是一种多年生禾本科植物，竹子茎和叶中含有各种黄酮类化合物、酚类化合物，蛋白质和糖类、茶多酚、氨基酸等成分。竹叶中黄酮化合物主要以苷类的形式存在，主要存在四种碳苷黄酮，分别为异荭草苷、荭草苷、异牡荆苷和牡荆苷。黄酮类化合物（Flavonoids）是一类广泛存在于药用植物和植物果实的次级代谢产物，主要以苷元形式存在。类黄酮具有优良的天然抗氧化性及清除自由基特性。与普通黄酮相比，竹叶提取物有优良的抗自由基、抗氧化的特性。竹叶提取物对清除活性氧自由基有较强能力。而且，竹叶提取物对微生物具有广泛的抑菌作用，通过使微生物细胞壁和细胞膜被破坏而起到抑菌作用。竹叶提取物还可以阻断亚硝酸盐与胃中的次级胺发生亚硝化反应。洋甘菊(M

目前，饲料中普遍含有重金属且含量偏高，而利用饲料去除动物体内蓄积重金属的方法很少。已有的方法处理效率低，成本高，应用范围窄，具有局限性。镉(Cadmium)是一种常见的重金属，广泛运用在工业中,工农业生产所造成的环境污染会对机体产生危害，镉的毒性与氧化损伤密切相关。以往研究表明，在镉毒理损害的过程中，血清、肝脏、肾脏脂质过氧化代谢产物丙二醛(MDA)明显增加，同时抗脂质过氧化作用的酶如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性降低。

表面活性剂乳化体系是动力学稳定、热力学不稳定的亚稳定体系，固态颗粒稳定剂一旦进入界面就会形成不可逆的吸附，固体颗粒包裹液滴，有效的阻止了液滴的聚并、排水等失稳途径。植物炭黑（中国国家标准编号：08.138）被中华人民共和国卫生部批准作为食品添加剂使用，如工业生产、医学、食品添加、环保等。竹叶炭黑是一种不溶性的颗粒，通常以悬浮液的形式使用。适合作为颗粒稳定剂的天然材料非常有限，以黄酮类物质、淀粉颗粒对不溶性的颗粒制备稳定剂，满足不了日益增长的食品、医药、农业及化妆品的生产的需求。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明设计的目的在于提供一种具生物活性和去除重金属的动物饲料添加剂及制备方法。本发明采用天然产物为加工原料，无毒、无害、无残留危险，通过对竹叶炭黑进行乳化吸附得到含有黄酮类提取物，粒径均一、提高生物利用度的动物饲料添加剂。该动物饲料添加剂可用于食品、饲料、化妆品、医药、生物化工等领域，特别适合去除重金属等动物饲料的开发。有效降低动物在饲养过程中对体内蓄积重金属的富集，而且含有丰富的抗氧化成分黄酮、芹菜素等营养物质和生物活性物质，增加动物的免疫力。此外，原材料来源广泛，多数原料为生活废弃物，大大实现了废弃物的资源化利用。

本发明通过以下技术方案加以实现：

所述的具生物活性和去除重金属的动物饲料添加剂，其特征在于该饲料添加剂由以下重量份的原料制备而成：竹叶炭黑20-40份、白芍提取物浓缩液5-15份、竹叶提取物浓缩液8-10份、洋甘菊提取物浓缩液10-60 份、大青叶提取物浓缩液10-20 份、辛烯基琥珀酸淀粉钠10-30 份。

所述的具生物活性和去除重金属的动物饲料添加剂，其特征在于所述竹叶炭黑为竹经烘干、高温碳化、活化精制而成，其微结构为粒径300-1000µm的孔状。

所述的具生物活性和去除重金属的动物饲料添加剂，其特征在于所述洋甘菊提取物浓缩液是以洋甘菊、杭白菊、血菊为原料制得的。

所述的具生物活性和去除重金属的动物饲料添加剂，其特征在于该添加剂的使用量占动物饲料总量的1-15%。

所述的具生物活性和去除重金属的动物饲料添加剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）称取配方量竹叶炭黑加入到竹叶取物浓缩液，在温度40-70摄氏度，磁力搅拌条件下,依次滴加配方量的白芍提取物浓缩液、洋甘菊提取物浓缩液和大青叶提取物浓缩液，进行混合2-4h后，制得竹叶炭黑植物活性载体；

2）将步骤1）制得竹叶炭黑植物活性载体与配方量的辛烯基琥珀酸淀粉钠，在温度30-50℃下，超声，高压均质，获得分散相平均粒径300-500µm的稳定纳米粒子乳浊液；

3）将步骤2）所制得纳米粒子乳浊液，在-18℃预冻24小时，再经真空冷冻干燥，得到具生物活性和去除重金属的动物饲料添加剂纳米颗粒。

所述的具生物活性和去除重金属的动物饲料添加剂的制备方法，其特征在于步骤1）中磁力搅拌的转速为500-1000rpm。

所述的具生物活性和去除重金属的动物饲料添加剂的制备方法，其特征在于步骤2）中超声波功率为400-800W，高压均质条件为均质压力0.1～80MPa，均质时间2～10min

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

1）本发明以竹叶炭黑为基质，通过吸附天然黄酮类生物活性物质可有效避免动物饲养中重金属含量过高，并对家禽肉质品质具有提升作用；

2）本发明以竹叶炭黑为基材，经复合改性并与多种天然产物，制备成的具生物活性和去除重金属的动物饲料添加剂，可用于饲养多种动物，本发明的动物饲料不仅去除重金属性能高、稳定性高，而且含有竹叶黄酮、芹菜素等营养物质和生物活性物质，增加动物的免疫力。此外，原材料来源广泛，多数原料为生活废弃物，大大实现了废弃物的资源化利用；

3) 本发明利用竹叶炭黑的天然孔状结构体外作为生物活性物质，如黄酮、芹菜素等的载体。利用层层自组装，将辛烯基琥珀酸淀粉钠作为外层壁材制备可溶性纳米颗粒，解决竹叶炭黑不溶性，对肠道营养吸收的影响。满足天然材料作为生物活性物质载体在食品、医药、农业及化妆品的生产的需求；

4）本发明产品具有空间网状结构，稳定性强，经动物实验证明能有效降低重金属对机体的氧化应激、肝脏损伤等，用于各种动物，尤其用于家禽、鱼类。

附图说明

图1为小鼠饮水量变化（a）、进食量变化（b）、体重增长变化（c）、小鼠肝脏系数（d）变化图；

图2为竹叶炭黑对肝脏（a），肾脏（b）中重金属Cd含量的影响；

图3为竹叶炭黑对肝脏超氧化物歧化酶SOD（a）和丙二醛MDA（b）含量的影响；

图4为小鼠每日进食量（a）、饮水量（b）、体重变化（c）；

图5为竹叶炭黑对肝脏超氧化物歧化酶SOD（a），丙二醛MDA（b）的影响；

图6为竹叶炭黑对谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（AKP）的影响；

图7为竹叶炭黑对乳酸脱氢酶LDH含量（a）、过氧化脂LPO含量（b）的影响。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细描述，并给出具体实施方式。

实施例1

取干燥洋甘菊、杭白菊、雪菊按质量比1:2:1混合，粉碎，过40目，以料液比为10kg：40L的比例分别加入50%乙醇溶液，在温度50℃下，用超声波辅助萃取60分钟，得到含有洋甘菊提取液。

采用聚苯丙烯骨架的大孔吸附树脂吸附，用4倍柱体积75%乙醇洗脱。洗脱液经超滤膜膜分离，减压浓缩，得到提取浓缩液30L。

将竹叶炭黑20-40份，白芍提取物浓缩液5-15份，竹叶提取物浓缩液8-10份、洋甘菊提取物浓缩液10-60 份和大青叶提取物浓缩液10-20 份，辛烯基琥珀酸淀粉钠10-30份，在温度30-50℃下，超声，高压均质，获得分散相平均粒径300-500µm的稳定乳液。

其中，白芍提取物浓缩液、竹叶提取物浓缩液、大青叶提取物浓缩液的分离纯化条件为，采用聚苯丙烯骨架的大孔吸附树脂吸附，用5-10倍柱体积75%乙醇洗脱，洗脱液经超滤膜膜分离，减压浓缩，得到提取浓缩液。

实施例2

选择洋甘菊、杭白菊、雪菊为原料，按质量比1:1:1混合，将原料30-40℃烘干，粉碎，过30目。以料液比为1Kg∶15L-1Kg∶25L的比例与0-80%乙醇溶液，用超声波辅助萃取40-60分钟，得到含有洋甘菊总黄酮的萃取液。提取液通过160目过滤装置进行过滤，得到澄清的洋甘菊总黄酮提取液。大孔吸附树脂吸附、洗脱：洋甘菊总黄酮浓缩液在温度为20℃-40℃，流速为0.4-4BV/h条件下，大孔吸附树脂吸附，再用3-6倍柱体积蒸馏水洗杂，然后用3-10倍柱体积15-95%乙醇洗脱；洗脱液经超滤膜分离，得到透明澄清洋甘菊总黄酮提取液。

实验例 3

试剂：ICR小鼠，6周雄鼠，上海克莱斯实验动物中心提供；竹叶炭黑旺林生物科技有限公司提供；活性炭精细化工清洗剂；氯化镉、羧甲基纤维素钠、冰醋酸、双缩脲、牛血清蛋白、氢氧化钠、硫酸铜均来自国药集团化学试剂有限公司，分析纯；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、碱性磷酸酶（AKP）、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、乳酸脱氢酶（LDH）、过氧化脂（LPO）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。实验所有水均为去离子水。

仪器：SynergyH4酶标仪美国伯腾仪器有限公司；SUPER T21高速冷冻离心机上海精宏实验设备有限公司；旋转蒸发仪RE-2000 上海亚荣生化仪器厂；磁力搅拌器及匀浆机艾卡(广州)仪器设备有限公司；XPE-205电子天平梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司。

实验方法

溶液配制：重金属饮用水配制：称取0.0915g氯化镉，溶于800mL过膜水中并定容至1L。

动物饲养：6周ICR雄鼠，适应环境一周，密切观察小鼠生长情况，记录每日饮水量、进食量并称重。饲养温度20-25℃，湿度50%左右，通风良好，无已知污染物影响。

竹叶炭黑短期暴露重金属模型：实验分为5组每组各20只：空白对照（Water），重金属Cd（溶液浓度）....，重金属水处理（HM）；试验组（T3、T4、T5）分别按2.81、5.62、11.24 g/kg的剂量灌胃竹叶炭黑（BCP），体积按20mL/kg，连续灌胃1星期，末次灌胃后，进行一半样本的处理。另一半继续进行灌胃，再进行一周后，处理样本。

不同种类炭黑暴露动物模型：实验分为3组每组各10只：空白对照（Water），不做处理；活性炭对照（AC），灌胃活性炭（11.24g/Kg）（AC30ppm）；竹叶炭黑组（BCP）：灌胃竹叶炭黑（11.24g/Kg）（BCP30ppm），小鼠灌胃量为20mL/kg，连续灌胃30天，末次灌胃后，断粮18小时后解剖处理样本。

血清及肝肾指标：实验结束时，对麻醉动物眼眶取血，血样室温静置30min后3500r/min离心15min，分离血清并分装。分离肝脏、肾脏，称重并各取0.1g，加入900μl PBS，混匀制成匀浆。用于超氧化物歧化酶（SOD），丙二醛（MDA），谷胱甘肽（GSH）试剂盒的检测，具体操作参考试剂盒相关要求。取部分血清用于碱性磷酸酶（AKP），谷草转氨酶（AST），谷丙转氨酶（ALT），乳酸脱氢酶（LDH），过氧化脂（LPO）等试剂盒的测定，具体操作参考试剂盒相关要求。

重金属含量检测

电感耦合等离子质谱仪用于检测重金属含量。准确称取样品，加水溶解于100mL烧杯，加入2mL硝酸，再将溶液转移至100ml的容量瓶，并混合均匀，再用纯水稀释至刻度。将此溶液经水系0.22μm的混合纤维素膜过滤，置于聚丙烯离心管，调整仪器进行检测，具体参数见表1。同时检测标准品，与标准品对比得出样本重金属浓度。

表1电感耦合等离子质谱仪主要工作参数

蛋白质含量检测：双缩脲法测蛋白含量。标准曲线的测定：取18支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL的标准蛋白质溶液，水补足到1mL，之后加入4mL双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30min，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取三组测定的平均值，以蛋白质的含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。处理好的组织样本，3500r/min 离心 10min，取上清液待测，同标准曲线方法测定吸光度值，得出具体蛋白含量。用于超氧化物歧化酶（SOD），丙二醛（MDA）试剂盒的检测。

实验结果

竹叶炭黑对重金属暴露小鼠进食量、饮水量、体重及肝脏系数的影响，结果见图1。

重金属水暴露后会明显影响小鼠的正常生理指标及其生长发育，添加竹叶炭黑作为吸附剂后能改善重金属水带来的部分影响，使小鼠的生理指标向正常趋势转变。图1a可以看出在实验前期，暴露组普遍低于未暴露组，之后各组逐渐趋同。而图1b中在后期重金属暴露小鼠的进食量比对照组增加了65%，但通过竹叶炭黑保护后，进食量趋于正常，说明竹叶炭黑可以有效缓解Cd造成的食欲亢进。图1c可以明显看出，重金属会抑制小鼠的正常生长发育。而添加竹叶炭黑后，体重明显增加，并且生长情况趋于正常水平，接近于对照组。

第一周与第二周的空白对照组的肝脏系数为3.82%和3.62%，重金属暴露组的肝脏系数为5.2%和4.9%。与对照组相比，重金属组的肝脏系数明显增加（

竹叶炭黑对肝脏、肾脏组织中重金属含量的影响，结果见图2，其中图2（a）为竹叶炭黑对肝脏中重金属Cd含量的影响，图2（b）为竹叶炭黑对肾脏中重金属Cd含量的影响。

重金属会在肝脏与肾脏内堆积，对于重金属Cd来说，时间越久在体内堆积的越多。而竹叶炭黑能吸附重金属，减少重金属在体内的堆积。随着竹叶炭黑含量的增加，对重金属的吸附能力也在增加，在肝脏中减少25%在肾脏中减少33%的重金属含量。由此得出，竹叶炭黑在体内可以对重金属进行吸附，能改善重金属对机体的异常影响，减少重金属在体内的堆积。

竹叶炭黑对重金属氧化应激的影响，结果见图3，其中，图3（a）为竹叶炭黑对肝脏超氧化物歧化酶SOD含量的影响，图3（b）为竹叶炭黑对丙二醛MDA含量的影响。

当产生过量自由基时，氧化损伤会导致组织破坏，导致组织中MDA含量的增加，影响机体的抗氧化防御机制。实验结果表明竹叶炭黑处理组MDA含量明显降低，趋于正常组；第一周SOD含量趋于正常组，随着肝脏中竹叶炭黑（BCP）浓度的增加，第二周SOD含量增加，与对照组相比，SOD水平在7.5ppm,15ppm和30ppm组之间没有显示出明显差异，该结果可归因于竹叶炭黑对重金属的吸附，减少了对组织的氧化损伤

不同种类炭黑暴露动物实验

小鼠进食量、饮水量及体重变化见图4。

由进食量与饮水量可以看出，小鼠的生活环境可能存在一定的变化，图4c显示，空白对照组的30天体重增长量为5.96g，竹叶炭黑与活性炭组均比对照组增长的缓慢，竹叶炭黑相较于活性炭对小鼠体重的影响更小。

不同种类炭黑对氧化应激的影响，结果见图5，

图5a中SOD含量显示，不同组之间的区别极小在5%（

不同种类炭黑对肝功能指标的影响，结果图6。

图6中ALT、AST和AKP均处于正常范围内。竹叶炭黑组与对照组的AST/ALT的值小于1，表明机体健康、无肝脏损伤状况。活性炭组与对照组的AST/ALT的值大于1小于2，表明此时肝细胞受到损伤，机体可能处于慢性炎症状态。正常组AKP的含量在21.6U/L，而竹叶炭黑组AKP含量偏差在12.3%，在正常范围内，但活性炭组AKP含量明显偏高25%。高浓度的活性炭进入体内后，可能对机体造成损伤。当肝脏受到损伤或者障碍时经淋巴道和肝窦进入血液，同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍，反流入血而引起血清AKP明显升高。综上所述，竹叶炭黑组无明显的致病表现，作为食品添加剂，有一定的安全性。

不同种类炭黑对毒理指标的影响，结果见图7。

乳酸脱氢酶（LDH）几乎会存在于所有组织中，以心、肾脏和骨骼肌最丰富，其次为肝、胰腺、脾、脑、肺脏等。从图7a中，与对照组相比各组LDH的含量几乎相同，变化量在3%以内，无明显变化。当细胞损伤时，会产生LDH，使其含量增加。而试验中，各组的含量都处于正常范围内，无明显肝损伤表现。

过氧化脂质（LPO）是多聚不饱和脂肪酸与氧自由基反应的产物，在正常情况下，LPO的含量往往极低，但在病理情况下，脂质过氧化反应会增强这可导致LPO升高。LPO升高可对细胞及细胞膜的结构和功能造成种种损伤。而图7b中，竹叶炭黑组低于空白对照组，表明竹叶炭黑作为食品添加剂的安全性。而活性炭组明显高于对照组，表明其可能会对机体产生损伤，引起细胞及细胞膜结构功能的改变。竹叶炭黑在食品添加中，表现出的是对机体的保护作用，而使用活性炭则可能会带来损伤。