一种对腹泻有治疗效果的干酪乳杆菌L.Casei21及其应用

摘要

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种对腹泻有治疗效果的干酪乳杆菌L.Casei21及其应用，所述干酪乳杆菌L.Casei21的分类命名为干酪乳杆菌Lactobacillus casei，保藏编号为CGMCC NO.21373，保藏日期为2020年12月14日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，所述干酪乳杆菌L.Casei21可用于制备治疗腹泻的产品。本发明干酪乳杆菌L.Casei21所制成的产品经服用后，菌体可通过消化道进入肠道内，抑制致病菌，并定植肠道，保持环境菌群平衡，改善腹泻症状，降低腹泻复发风险。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种对腹泻有治疗效果的干酪乳杆菌L.Casei21及其应用。

背景技术

腹泻是一种常见症状，其是指排便次数明显超过平日习惯的频率，粪质稀薄，水分增加，每日排便量超过200g，或含未消化食物或脓血、黏液。腹泻常伴有排便急迫感、肛门不适、失禁等症状。腹泻可通过服用药物的方法治疗。药物治疗虽然效果明显，但缺点也很显著，例如使用含抗生素的药物会将致病菌和有益菌一同杀死，暂时缓解症状，不利于后期恢复，长期服用会让病原菌产生耐药性。且在对病人了解不全面的情况下，贸然采用药物治疗，还可能诱发其他的疾病。

基于此，为解决腹泻症状，避免使用药物导致的耐药性和不良反应，降低腹泻复发风险，本发明提供一种对腹泻有治疗效果的干酪乳杆菌L.Casei21及其应用。

发明内容

针对药物治疗可能导致的耐药性和不良反应问题，本发明提供一种对腹泻有治疗效果的干酪乳杆菌L.Casei21及其应用，利用保藏菌株干酪乳杆菌L.Casei21，制成可服用产品，服用后菌体可通过消化道进入肠道内，抑制致病菌，并定植肠道，保持环境菌群平衡，改善腹泻症状，降低腹泻复发风险。

第一方面，本发明提供一种干酪乳杆菌L.Casei21，所述干酪乳杆菌L.Casei21的分类命名为干酪乳杆菌

第二方面，本发明提供一种干酪乳杆菌L.Casei21在制备治疗腹泻的产品中的应用。

进一步的，所述产品包括干酪乳杆菌菌粉，所述干酪乳杆菌菌粉按照如下制备方法制得：

将干酪乳杆菌L.Casei21按体积分数1%接种量接种至MRS液体培养基中培养，对培养得到的L.Casei21菌液进行离心、真空冷冻干燥，获得干酪乳杆菌菌粉。

进一步的，所述干酪乳杆菌L.Casei21的培养温度为37℃。

进一步的，所述MRS液体培养基的成分及其含量如下：

蛋白胨10g、牛肉粉5g、酵母粉4g、K

进一步的，所述产品还包括低聚异麦芽糖。

进一步的，所述产品中干酪乳杆菌L.Casei21活菌数为50亿/g、100亿/g、150亿/g、250亿/g、500亿/g、1000亿/g。

本发明的有益效果在于，

本发明提供的干酪乳杆菌L.Casei21耐胃酸、胆盐性能好，在细胞定植方面也有较强的能力，该干酪乳杆菌L.Casei21本身能够大幅降低致病菌的黏附效果，其代谢产物对腹泻的三种致病菌也具有较好的抑菌效果，因此能够有效抑制腹泻的发生。由干酪乳杆菌L.Casei21制备治疗腹泻的产品也对腹泻患者有明显的积极治疗作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是菌株对Caco-2细胞的黏附率对比图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1 菌种分离纯化

对广西巴马瑶族自治县无家族遗传病史的哺乳期婴儿进行粪便采样，取样过程戴手套消毒操作，避免接触样品以防污染。取出样品后立即冷藏盒保存，并编号记录。

对样品液体做十倍梯度稀释，每个梯度取100μL均匀涂布于MRS固体平板培养基上，MRS固体平板培养基的成分及其含量如下：

蛋白胨10g、牛肉粉5g、酵母粉4g、K

随后取出置于厌氧罐中，37℃厌氧培养过夜，次日可见平板上长有形态大小各异的菌落，菌落呈乳白色，凸起，边缘不规则，菌落略透明。

挑取若干乳酸菌的特征菌落作二代划线纯化处理，平板厌氧活化1天，得培养物，随后做菌种鉴定。

实施例2 菌种鉴定

鉴定单位：生工生物工程（上海）股份有限公司。

引物序列：27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'），1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。

菌种序列：TGCAAGTCGAACGAGTTTTGGTCGATGAACGGTGCTTGCACTGAGATTCGACTTAAAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAAATCCAAGAACCGCATGGTTCTTGGCTGAAAGATGGCGCAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGCGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAAAATTTTCACAGGTCTTGACATCTTTTGATCACCTGAGAGATCAGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCCAGCATTGAGTTGGGCACTCTAGTAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGCGTAACCCTTTTAGGGAGCGAGCCGTCT。

鉴定结果：该菌株被鉴定为Lactobacillus casei（干酪乳杆菌）。其分类单元为：Bacteria；Firmicutes；Bacilli；Lactobacillales；Lactobacillaceae；Lactobacillus。

实施例3 产品制备

一种治疗腹泻的产品，包括干酪乳杆菌菌粉和低聚异麦芽糖，其中干酪乳杆菌菌粉按照如下制备方法制得：

（1）将干酪乳杆菌L.Casei21按体积分数1%接种量接种至MRS液体培养基中培养，培养温度为37℃，MRS液体培养基的成分及其含量如下：

蛋白胨10g、牛肉粉5g、酵母粉4g、K

（2）对培养得到的L.Casei21菌液进行离心、真空冷冻干燥，获得干酪乳杆菌菌粉；

调节干酪乳杆菌菌粉和低聚异麦芽糖比例，分别配制干酪乳杆菌L.Casei21活菌数为50亿/g、100亿/g、150亿/g、250亿/g、500亿/g、1000亿/g的产品。

实施例4 干酪乳杆菌L.Casei21耐胃酸能力实验

称取若干份实施例3制得的干酪乳杆菌L.Casei21活菌数为100亿/g的产品作为样品，每份样品重量为1g，转移至预热的装有9mL模拟胃液试管中，分别于37℃、80r/min下处理0.5h、1.5h、2h，每个处理3个重复。

模拟胃酸按照如下方法配制：取9.5%盐酸16.4mL，加蒸馏水稀释至pH值为2.0，每100mL加入1.0g胃蛋白酶，混匀后用0.22μm无菌滤膜过滤，现配现用。

取四种乳杆菌菌株ATCC334、ATCC11578、ATCC393、ATCC15008作为对照，实验方法与L.Casei21相同。

对处理后的样品溶液及对照菌株溶液进行梯度稀释，使用倾注法做活菌计数。菌株在体外模拟胃酸环境下的存活率数据如表1所示，可以看出干酪乳杆菌L.Casei21在体外模拟胃酸环境下的存活率明显高于其他测试菌株，耐胆盐性能更强。

表1 体外模拟胃酸环境下各菌株存活率数据表

实施例5 干酪乳杆菌L.Casei21耐胆盐能力实验

称取若干份实施例3制得的干酪乳杆菌L.Casei21活菌数为100亿/g的产品作为样品，每份样品重量为1g，转移至装有9mL模拟肠液试管中，分别于37℃、80r/min下处理0.5h、1.5h、2h，每个处理3个重复。

模拟肠液按照如下方法配制：将6.8g的KH

取四种乳杆菌菌株ATCC334、ATCC11578、ATCC393、ATCC15008作为对照，实验方法与L.Casei21相同。

对处理后的样品溶液及对照菌株溶液进行梯度稀释，使用倾注法做活菌计数。菌株在体外模拟肠液环境下的存活率数据如表2所示，可以看出干酪乳杆菌L.Casei21在体外模拟肠液环境下的存活率明显高于其他测试菌株，耐胆盐性能更强。

表2 体外模拟胃酸环境下各菌株存活率数据表

实施例6 干酪乳杆菌L.Casei21对Caco-2细胞的黏附率实验

将Caco-2细胞置于含10%热灭活新生牛血清和双抗（青霉素浓度100U/mL、链霉素1.0μg/mL）的DMEM培养液（购自Gibco公司）中，于37℃、5%CO

将活化好的L.Casei21按体积分数1%的接种量接种于MRS液体培养基（同实施例3）中，37℃培养12h。

离心收集菌体（4000g、4℃、10min），并用无菌PBS缓冲液洗涤3次，将菌体重悬于无菌PBS缓冲液中，得到浓度为2×10

KH

将已长成单层的Caco-2细胞用无菌PBS缓冲液漂洗2次，每孔加入0.5mL的L.Casei21菌悬液和0.5mL新鲜的DMEM培养液，于37℃、5%CO

取四种乳杆菌菌株ATCC334、ATCC11578、ATCC393、ATCC15008作为对照，实验方法与L.Casei21相同。

漂洗完后，用甲醛固定，革兰染色，镜检，倒置显微镜下计算20个随机视野下100个细胞上黏附的细菌数。以不加菌液细胞培养为对照。计算每个细胞黏附的平均细菌数。

菌株对Caco-2细胞的黏附率对比图如图1所示，可以看出干酪乳杆菌L.Casei21在细胞定植方面有较强的能力。

实施例7 干酪乳杆菌L.Casei21抑制致病菌黏附实验

将Caco-2细胞置于含10%热灭活新生牛血清和双抗（青霉素浓度100U/mL、链霉素1.0μg/mL）的DMEM培养液（购自Gibco公司）中，于37℃、5%CO

将活化好的L.Casei21按体积分数1%的接种量接种于MRS液体培养基（同实施例3）中，37℃培养12h。

离心收集菌体（4000g、4℃、10min），并用无菌PBS缓冲液（同实施例6）洗涤3次，将菌体重悬于无菌PBS缓冲液中，得到浓度为2×10

3株致病菌（艰难梭菌CICC22951、鼠伤寒沙门氏菌CICC21484、宋内志贺氏菌CICC21535，均购于中国工业微生物菌种保藏管理中心）分别接种于TSB液体培养基中，37℃厌氧培养24h。将三种致病菌菌液离心收集菌体（4000g、4℃、10min），并用无菌PBS缓冲液（同实施例6）洗涤3次，将菌体重悬于无菌PBS缓冲液中，得到浓度为2×10

胰蛋白胨17g、大豆蛋白胨3g、氯化钠5g、磷酸氢二钾2.5g、葡萄糖2.5g和蒸馏水1000mL。

L.Casei21组：将已长成单层的Caco-2细胞用无菌PBS缓冲液漂洗2次，将三种致病菌菌液按0.5mL的加入量分别加入到不同孔中，使每孔中仅含有一种致病菌，同时加入0.5mL新鲜的DMEM培养液（购自Gibco公司）于37℃、5%CO

空白组：将已长成单层的Caco-2细胞用无菌PBS缓冲液漂洗2次，将三种致病菌菌液0.5mL加入到不同孔中，并同时加入0.5mL新鲜的DMEM培养液（购自Gibco公司）于37℃、5%CO

空白组和L.Casei21组均用PBS缓冲液清洗3次后，加入1mL含有体积分数0.5%的聚乙二醇辛基苯基醚X-100（购自南通市谦和化工有限公司）的PBS缓冲液，使细胞分散溶解。取出溶解后所有细胞液，经过合适的梯度稀释，用BHI培养基（购自Oxoid公司）在37℃培养箱中培养48h后，计算孔中致病菌附着在Caco-2上的数量。

取四种乳杆菌菌株ATCC334、ATCC11578、ATCC393、ATCC15008作为对照，实验方法与L.Casei21相同。

每孔中致病菌的黏附数量统计结果如下表3所示，可以看出干酪乳杆菌L.Casei21在致病菌定植Caco-2细胞之后，依然能够大幅降低致病菌的黏附数量，从而有效抑制腹泻的发生。

表3 致病菌的黏附数量表（单位：×10

实施例8 干酪乳杆菌L.Casei21代谢产物抑制致病菌实验

将活化好的L.Casei21按体积分数1%的接种量接种于MRS液体培养基（同实施例3）中，37℃培养24h，将L.Casei21菌液在4℃下10000r/min离心30min，得到L.Casei21菌液上清，将上清用0.22μm的微孔滤膜进行过滤除菌。

将致病菌（艰难梭菌CICC22951、鼠伤寒沙门氏菌CICC21484、宋内志贺氏菌CICC23875，均购于中国工业微生物菌种保藏管理中心）接种于TSB液体培养基（同实施例7）中，并向TSB液体培养基中加入体积分数10%的L.Casei21菌液上清，37℃厌氧培养24h。

取四种乳杆菌菌株ATCC334、ATCC11578、ATCC393、ATCC15008作为对照，实验方法与L.Casei21相同。

设置空白对照，实验方法为将10%L.Casei21菌液上清替换为10%无菌水。

分别对上述实验组在600nm波长处的吸光值进行测定，根据吸光值大小分析不同乳酸菌上清液对致病菌的抑菌情况，结果如下表4所示，可以看出干酪乳杆菌L.Casei21代谢产物对三种致病菌有较好的抑菌效果。

表4 菌液上清对致病菌的抑菌情况（OD

实施例9 干酪乳杆菌L.Casei21对腹泻患者的治疗作用

选取有腹痛、腹泻、排便频繁、四肢不温等症状的患者100名，分为对照组和试验组，每组50人，试验进行30天。试验期间，每位患者生活饮食习惯不变，均按照医嘱每天服用一次马来酸曲美布丁片，实验组在服用马来酸曲美布丁片2小时后额外服用实施例3制得的干酪乳杆菌L.Casei21菌数为150亿/g的产品1g。30天后观察疗效并进行统计，统计结果如下表5所示，可以看出干酪乳杆菌L.Casei21及其产品对腹泻患者有明显的积极治疗作用。

表5 腹泻患者治疗效果统计表（单位：人）

尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求所述的保护范围为准。

序列表

<110> 山东中科嘉亿生物工程有限公司

<120> 一种对腹泻有治疗效果的干酪乳杆菌L.Casei21及其应用

<130> 2021

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

agagtttgat cmtggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 1442

<212> DNA

<213> Lactobacillus casei

<400> 3

tgcaagtcga acgagttttg gtcgatgaac ggtgcttgca ctgagattcg acttaaaacg 60

agtggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgccctt aagtggggga taacatttgg 120

aaacagatgc taataccgca taaatccaag aaccgcatgg ttcttggctg aaagatggcg 180

caagctatcg cttttggatg gacccgcggc gtattagcta gttggtgagg taacggctca 240

ccaaggcgat gatacgtagc cgaactgaga ggttgatcgg ccacattggg actgagacac 300

ggcccaaact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc acaatggacg caagtctgat 360

ggagcaacgc cgcgtgagtg aagaaggctt tcgggtcgta aaactctgtt gttggagaag 420

aatggtcggc agagtaactg ttgtcggcgt gacggtatcc aaccagaaag ccacggctaa 480

ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttatccggat ttattgggcg 540

taaagcgagc gcaggcggtt ttttaagtct gatgtgaaag ccctcggctt aaccgaggaa 600

gcgcatcgga aactgggaaa cttgagtgca gaagaggaca gtggaactcc atgtgtagcg 660

gtgaaatgcg tagatatatg gaagaacacc agtggcgaag gcggctgtct ggtctgtaac 720

tgacgctgag gctcgaaagc atgggtagcg aacaggatta gataccctgg tagtccatgc 780

cgtaaacgat gaatgctagg tgttggaggg tttccgccct tcagtgccgc agctaacgca 840

ttaagcattc cgcctgggga gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 900

cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaaa attttcacag 960

gtcttgacat cttttgatca cctgagagat caggtttccc cttcgggggc aaaatgacag 1020

gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080

gcaaccctta tgactagttg ccagcattga gttgggcact ctagtaagac tgccggtgac 1140

aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac 1200

acgtgctaca atggatggta caacgagttg cgagaccgcg aggtcaagct aatctcttaa 1260

agccattctc agttcggact gtaggctgca actcgcctac acgaagtcgg aatcgctagt 1320

aatcgcggat cagcacgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1380

caccatgaga gtttgtaaca cccgaagccg gtggcgtaac ccttttaggg agcgagccgt 1440

ct 1442