公开/公告号CN112626045A
专利类型发明专利
公开/公告日2021-04-09
原文格式PDF
申请/专利权人 华南农业大学;
申请/专利号CN202011393060.6
申请日2020-12-02
分类号C12N9/10(20060101);C12N15/54(20060101);C12N15/82(20060101);A01H6/46(20180101);A01H5/10(20180101);C12Q1/6895(20180101);C12Q1/6851(20180101);
代理机构32218 南京天华专利代理有限责任公司;
代理人傅婷婷;徐冬涛
地址 510642 广东省广州市天河区五山华南农业大学
入库时间 2023-06-19 10:33:45
技术领域
本发明公开了两种水稻粒型相关蛋白,属于水稻基因工程领域,涉及两个控制水稻粒型α-异丙基苹果酸合酶基因的分离克隆、功能验证和应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa L.)是我国最重要的粮食作物之一。水稻产量是由植株穗数、每穗粒数、粒重三大因素决定,其中粒重是影响产量最重要的因素。粒重主要受籽粒大小影响,包括粒长、粒宽、粒厚,以及灌浆程度。改良籽粒大小是提高水稻产量、品质的最有效途径之一,是当前水稻遗传育种改良的重要目标。
发明内容
本发明的目的是提供两种水稻粒型相关蛋白基因的分离克隆、功能验证和应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现:
本发明的两个来自水稻α-异丙基苹果酸合酶基因OsIPMS1、OsIPMS2,其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。
本发明所述的水稻α-异丙基苹果酸合酶基因OsIPMS1、OsIPMS2编码的蛋白,其氨基酸序列SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
本发明所述的水稻OsIPMS1、OsIPMS2基因或蛋白在筛选或培育大粒水稻品种中的应用。
本发明所述的水稻OsIPMS1、OsIPMS2基因突变体获得和基因功能验证,包括如下步骤:
(1)获得水稻OsIPMS1、OsIPMS2基因的核苷酸序列及氨基酸序列;
(2)用PCR获得OsIPMS1、OsIPMS2基因的目标片段,将基因的目标片段构建到CH载体中;
(3)将步骤(2)得到的带有OsIPMS1、OsIPMS2基因的目标片段的CH载体构建到pCAMBIA1300载体上,获得p1300-CH-Target载体;
(4)将步骤(3)得到的带有OsIPMS1、OsIPMS2基因目标片段的质粒转化农杆菌;将带有转化质粒的农杆菌转化水稻;
(5)水稻突变体筛选与鉴定,并对种子粒型进行鉴定。
进一步的,在步骤(1)中利用从水稻cDNA为模板PCR克隆出该基因的引物序列,所述上游引物序列如序列表SEQ ID NO.5所示,所述下游引物序列如序列表SEQ ID NO.6所示。
进一步的,在步骤(2)中将OsIPMS1、OsIPMS2基因中20bp的目标片段与CH载体相连,获得CH-Target重组载体。
在步骤(3)中,用EcoRI HF和Hind III分别酶切pCAMBIA1300和CH-target载体,酶切产物用1.2%的琼脂糖凝胶检测,分别切胶回收载体pCAMBIA1300和片段CH-target;利用T4 Ligase获得p1300-CH-Target载体。
在步骤(5)中构建的水稻OsIPMS1、OsIPMS2 CRISPR/Cas9突变体gRNA靶序列如序列表SEQ ID NO.7所示;筛选纯合突变体所用上游引物序列如序列表SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9所示,下游引物序列如序列表SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示。水稻种子粒型鉴定包括粒长、粒宽、粒厚和千粒重。
本发明所述的一种检测种子灌浆过程OsIPMS1、OsIPMS2基因表达水平的方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)取不同灌浆期水稻种子;
(2)用TransZol Plant kit(Transgen,www.transgen.com)试剂盒提取各个样的RNA;
(3)用
(4)用荧光定量PCR进行分析,荧光定量PCR检测引物序列,所述上游引物序列如序列表SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13所示,所述下游引物序列如序列表SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.15所示。
进一步的,在步骤(1)中水稻种子分别在开花后0、7、14、21、28、35、42d后取样;种子经液氮冷冻处理后迅速磨成粉末,样品贮存于-80℃,每个时间点取样三份。
在步骤(4)中,采用水稻内参基因18sRNA引物,所述上游引物的序列如序列表SEQID NO.16所示,所述下游引物的序列如序列表SEQ ID NO.17所示。
有益效果:
本发明从水稻中分离克隆了OsIPMS1、OsIPMS2基因,并鉴定了该基因在种子粒型调控方面的功能,对于改良水稻籽粒大小具有重要意义。
本发明具有如下优点:
(1)本发明从水稻中分离、克隆获得OsIPMS1、OsIPMS2基因,通过构建CRISPR/Cas9突变体首次证明了该基因参与水稻种子粒型调控。
(2)本发明为改良水稻品种籽粒大小提供了基础,也为改良提高水稻产量重要的基因资源,对生产具有重要意义。
附图说明
图1:水稻OsIPMS1、OsIPMS2基因在种子灌浆过程中的表达情况
图2:水稻OsIPMS1、OsIPMS2突变体籽粒大小表型
具体实施方式
本发明结合附图和具体实施例作进一步说明,实施例中所用方法无特别说明均为常规方法,所用引物、测序由广州天一辉远基因科技有限公司完成;实验中用到的各种限制性内切酶、连接酶、DNA Marker、Tag DNA聚合酶、dNTPs等购自宝日医生物技术(北京)有限公司;反转录试剂盒购于诺唯赞生物科技有限公司;质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒以及基因组提取试剂盒购于美基生物科技有限公司,方法均参照说明书进行。
实施例1:基因克隆和突变体构建
利用水稻日本晴cDNA为模板PCR克隆出OsIPMS1、OsIPMS2基因的引物序列,所述上游引物序列如序列表SEQ ID NO.5所示,所述下游引物序列如序列表SEQ ID NO.6所示。获得水稻OsIPMS1、OsIPMS2基因的核苷酸序列及氨基酸序列,其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2所示,其氨基酸序列SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
将OsIPMS1、OsIPMS2基因中20bp的目标片段与CH载体相连,获得CH-Target重组载体。用EcoRI HF和Hind III分别酶切pCAMBIA1300和CH-target载体,酶切产物用1.2%的琼脂糖凝胶检测,分别切胶回收载体pCAMBIA1300和片段CH-target;利用T4 Ligase获得p1300-CH-Target载体。
构建的水稻OsIPMS1、OsIPMS2 CRISPR/Cas9突变体gRNA靶序列如序列表SEQ IDNO.7所示;得到的带有OsIPMS1、OsIPMS2基因目标片段的质粒转化农杆菌;将带有转化质粒的农杆菌转化水稻;筛选纯合突变体所用上游引物序列如序列表SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9所示,下游引物序列如序列表SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示。
实施例2:基因突变体表型分析
利用构建的OsIPMS1、OsIPMS2 CRISPR/Cas9突变体osipms1-1、osipms1-2、osipms2-1、osipms2-2种子,以及野生型日本晴(WT)水稻品种,进行种子粒型比较。结果表明,与对照种子比较,突变体种子粒长显著变长,粒宽显著变宽(图1)。可见,突变该基因对提高籽粒大小具有重要作用。
实施例3:种子发育期基因表达分析
利用水稻日本晴品种,分别取开花后0、7、14、21、28、35、42d种子。不同时间样品经液氮冷冻处理后迅速磨成粉末,样品贮存于-80℃。用TransZol Plant kit(Transgen,www.transgen.com)试剂盒提取各个样的RNA;用
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 水稻苹果酸合酶基因在调控粒型中的应用
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1908
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
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tccactccac gcccacgcgc ccaaactctc tcccccttcc gcgccgccgc cccacgcttc 120
tcccatggcc tcgccaccgc cgccgccgcc gcaaacccta gcgcctcccg ccgctgctac 180
caccgcgcct tcgcccgccc cgtccgggcg tccatggcgc agccgcggcg cccggagtac 240
gtccccaacc gcatcgacga ccccaactac gtccgcatct tcgacaccac cctccgcgac 300
ggggagcagt cccccggggc caccatgacc agcgccgaga agctcgtcgt cgcgcgccag 360
ctcgcccgcc tcggcgtcga catcatcgag gccgggttcc cggcctcctc ccccgacgac 420
ctcgacgccg tgcgctccat cgccatcgag gtcgggaaca cgcccgtcgg ggaggacggc 480
cacgtgccgg tcatctgtgg cctctcgaga tgcaataagc gagacattga tgctgcctgg 540
gaggccgtgc ggcacgcgcg gcggccgcgc atccacacct tcattgccac cagcgagatc 600
catatgcagc acaagctaag gaagacgccc gagcaggtgg tggccattgc caaggaaatg 660
gtggcctacg cccgcagcct aggctgccct gatgtcgagt tcagccctga agacgctggc 720
aggtcaaaca gagagtttct atatcatatt ctagaggaag tcataaaagc tggagcaaca 780
acactcaata tcccagacac tgttggatac actcttcctt atgaatttgg gaagctaatt 840
gctgatataa aagcaaacac tccaggaatt gaaaatgcta ttatttctac tcattgccag 900
aatgaccttg gtctagcaac cgccaataca ttagcgggcg ctcatgcagg agcacggcaa 960
ttagaggtga ctatcaacgg tattggtgaa agggctggaa atgcttcttt ggaagaggtt 1020
gtgatggcaa ttaaatgtcg ccgagagctc ttaggaggtc tgtatactgg aatcaatacc 1080
caacatatca ctatgtcaag caaaatggta caagagcaca gtggacttca tgtacaacca 1140
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Ala Ala Ala Asn Pro Ser Ala Ser Arg Arg Cys Tyr His Arg Ala Phe
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Arg Ser Ile Ala Ile Glu Val Gly Asn Thr Pro Val Gly Glu Asp Gly
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cctatcaact ttcgatggta gg 22
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgttaaggga tttagattgt ac 22
机译: 水稻稻的OsPHYB OsPHYB基因在植物抗盐胁迫调控中的应用
机译: OsSRO1c基因在水稻抗旱性调控中的应用
机译: OSAO基因在提高水稻对水稻条纹病毒,水稻黑纹矮秆病毒或同一家族病毒的抗性中的应用