针对螯合的放射性核素的抗体和清除剂

摘要

本申请涉及特异性结合螯合的放射性核素的抗体,包括双特异性抗体。本申请进一步涉及此类双特异性抗体在诸如放射性免疫成像和放射性免疫疗法等应用中的用途。本申请另外涉及在此类方法中有用的清除剂。

说明书

发明领域

本申请涉及特异性结合螯合的放射性核素的抗体，包括双特异性抗体。本申请进一步涉及此类双特异性抗体在诸如放射性免疫成像和放射性免疫疗法等应用中的用途。本申请另外涉及在此类方法中有用的清除剂和组合物。

发明背景

已经开发了单克隆抗体将药物靶向癌细胞。通过将毒性剂与结合肿瘤相关抗原的抗体缀合，有潜力提供更多的特异性肿瘤杀伤及更少的对周围组织的损伤。

在预靶向的放射性免疫疗法(PRIT)中，使用具有一方面对肿瘤相关抗原和另一方面对带放射性标记物的化合物的亲和力的抗体构建物。第一步，施用抗体并定位在肿瘤内。随后，施用带放射性标记物的化合物。因为带放射性标记物的化合物较小，所以它能快速投递至肿瘤并快速清除，这降低肿瘤以外的辐射暴露(Goldenberg et al.，Theranostics2012，2(5)：523-540)。在直接细胞杀伤效果以外，PRIT还可以起免疫原性细胞死亡的诱导剂和癌症免疫疗法和内源疫苗接种办法的潜在组合配偶的作用。还可以对成像使用类似的过程。预靶向可以利用双特异性抗体或使用亲合素-生物素的系统，尽管后者具有亲合素/链霉亲合素具有免疫原性的缺点。

供PRIT中使用的放射性核素通常是加载有感兴趣放射性核素的螯合物的形式。

Su et al.，Nucl Med Biol 2005，32：741-747评估了具有单抗-链霉亲合素和DOTA-生物素的一种抗体预靶向系统。发现了带放射性标记物的

WO2010/099536描述了能够结合钇，镏和钆的DOTA复合物的一种双特异性抗体。然而，DOTA并不稳定结合所有放射性核素，而且可以展现较慢的复合物形成速率(Yong andBrechbiel，Dalton Trans 2001 June 21，40(23)：6068-6076)。螯合剂不能稳定结合放射性核素则产生降低对肿瘤的辐射投递同时提高毒性的风险。

发明概述

本发明提供结合包含DOTAM和铅(Pb)的金属螯合物的抗体。DOTAM能够以稳定的方式螯合Pb以形成Pb[DOTAM]复合物。

本发明的抗体结合包含DOTAM和Pb的螯合物，其中Pb可以或是稳定(非放射性)同位素或是放射性同位素。铅的放射性同位素是在诸如放射性免疫成像和放射性免疫疗法等应用中有用的。

优选地，本发明的抗体具有极其高的针对Pb-DOTAM螯合物的亲和力，在pM至fM范围中。

抗体另外结合由DOTAM螯合的铋(Bi)。

而且，本抗体任选地或优选地是与其它螯合剂-金属复合物，诸如Cu-DOTAM螯合物相比对Bi-DOTAM螯合物和Pb-DOTAM螯合物选择性的。

在一个实施方案中，本发明提供一种包含对Pb-DOTAM螯合物特异性的抗原结合位点的抗体，其中所述抗原结合位点包含包含至少一种，两种或三种重链CDR序列的重链，其中：

a)重链CDR1包含氨基酸序列GFSLSTYSMS(SEQ ID NO：1)；

b)重链CDR2包含氨基酸序列FIGSRGDTYYASWAKG(SEQ ID NO：2)；

c)重链CDR3包含氨基酸序列ERDPYGGGAYPPHL(SEQ ID NO：3)；和/或其中抗原结合位点包含包含至少一种，两种或三种轻链CDR序列的轻链，其中：

d)轻链CDR1包含氨基酸序列QSSHSVYSDNDLA(SEQ ID NO：4)；

e)轻链CDR2包含氨基酸序列QASKLAS(SEQ ID NO：5)；

f)轻链CDR3包含氨基酸序列LGGYDDESDTYG(SEQ ID NO：6)。

在一些实施方案中，抗原结合位点包含如上文定义的轻链和重链二者。

在另一个实施方案中，本发明提供一种包含对Pb-DOTAM螯合物特异性的抗原结合位点的抗体，其中所述抗原结合位点至少包含：

a)包含氨基酸序列FIGSRGDTYYASWAKG(SEQ ID NO：2)的重链CDR2，或其具有SEQID NO：2中多至1，2，或3处替代的变体，其中这些替代不包括Phe50，Asp56和/或Tyr58，且任选也不包括Gly52和/或Arg54；

b)包含氨基酸序列ERDPYGGGAYPPHL(SEQ ID NO：3)的重链CDR3，或其具有SEQ IDNO：3中多至1，2，或3处替代的变体，其中这些替代不包括Glu95，Arg96，Asp97，Pro98，且任选也不包括Ala100C，Tyr100D，和/或Pro100E，和/或任选也不包括Tyr99；

c)包含氨基酸序列QSSHSVYSDNDLA(SEQ ID NO：4)的轻链CDR1，或其具有SEQ IDNO：4中多至1，2，或3处替代的变体，其中这些替代不包括Tyr28和Asp32；

d)包含氨基酸序列LGGYDDESDTYG(SEQ ID NO：6)的轻链CDR3，或其具有SEQ IDNO：6中多至1，2，或3处替代的变体，其中这些替代不包括Gly91，Tyr92，Asp93，Thr95c和Tyr96。

残基编号方式依照Kabat。

在一些实施方案中，抗体另外包括重链CDR1和轻链CDR2，其任选地是：

i)包含氨基酸序列GFSLSTYSMS(SEQ ID NO：1)的重链CDR1，或其具有SEQ ID NO：1中多至1，2，或3处替代的变体；

ii)包含氨基酸序列QASKLAS(SEQ ID NO：5)的轻链CDR2，或其具有SEQ ID NO：5中至少1，2或3处替代的变体，任选不包括Gln50。

在本发明的涉及构成如上文列出的CDR的序列的变体的任何实施方案中，蛋白质可以是在如上文列出的残基一个或多个中不变的。

在一些实施方案中，依照本发明的抗体结合与受到本文中公开的抗体结合的表位相同或交叠的螯合的放射性核素的表位。

在一些实施方案中，抗体结合与受到Fab PRIT-0213或PRIT-0214结合的表位相同或交叠的表位。例如，抗体可以与下述各项结合相同或交叠的表位：

i)具有包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变域的抗体；或

ii)具有包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链可变域的抗体。

在一个实施方案中，抗原结合位点包含至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种选自下述各项的CDR：

a)包含氨基酸序列GFSLSTYSMS(SEQ ID NO：1)的重链CDR1；

b)包含氨基酸序列FIGSRGDTYYASWAKG(SEQ ID NO：2)的重链CDR2；

c)包含氨基酸序列ERDPYGGGAYPPHL(SEQ ID NO：3)的重链CDR3；

d)包含氨基酸序列QSSHSVYSDNDLA(SEQ ID NO：4)的轻链CDR1；

e)包含氨基酸序列QASKLAS(SEQ ID NO：5)的轻链CDR2；

f)包含氨基酸序列LGGYDDESDTYG(SEQ ID NO：6)的轻链CDR3。

任选地，上文描述的方面任一中的抗体是人，嵌合或人源化的。

任选地，抗原结合位点可以包含包含选自由SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9组成的组的氨基酸序列的重链可变域，或其包含与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，或99％同一性的氨基酸序列的变体。

任选地，抗原结合位点可以包含包含选自由SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10组成的组的氨基酸序列的轻链可变域，或其包含与SEQ ID NO：8或10具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，或99％同一性的氨基酸序列的变体。

任选地，对Pb-DOTAM螯合物特异性的抗原结合位点可以包含包含选自由SEQ IDNO：7或SEQ ID NO：9组成的组的氨基酸序列的重链可变域，或其如上文定义的变体，和包含选自由SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10组成的组的氨基酸序列的轻链可变域，或其如上文定义的变体。例如，对Pb-DOTAM螯合物特异性的抗原结合位点可以包含包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的重链可变域或其变体，和包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变域或其变体。在另一个实施方案中，它可以包含包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链可变域或其变体，和包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链可变域或其变体。

抗体可以是任何型式的，包括完整抗体和抗体片段。抗体可以是单特异性的。以这种形式，抗体例如在分选和纯化方案中找到效用，例如用于成功分开放射性标记的模块。

在一些方面，特异性结合Pb-DOTAM螯合物的抗体与细胞结合剂/靶向模块偶联以生成靶向剂。此类药剂例如在预靶向的放射性免疫疗法或预靶向的放射性免疫成像中是有用的。

偶联可以优选地是通过作为融合多肽或蛋白质的表达。融合可以是直接的或经由接头的。融合多肽或蛋白质可以重组生成，避免任何对缀合化学的需要。

在一些实施方案中，(包含针对靶物的抗原结合位点的)靶向模块是抗体或其片段。就是说，在一些实施方案中，上文描述的抗体可以是多特异性(例如双特异性)抗体的形式的，如下文进一步讨论的。

在另一个方面，本发明进一步涉及一种适合于将Pb-DOTAM螯合物靶向靶细胞的多特异性抗体/抗体复合物。

因而，在另一个方面，本发明涉及一种双特异性或多特异性抗体，其特异性结合Pb-DOTAM螯合物和靶抗原(例如在靶细胞的表面上表达的抗原)二者。双特异性抗体包含至少一个对DOTAM螯合的铅特异性的抗原结合位点和至少一个针对靶抗原的抗原结合位点。

在一些实施方案中，对Pb-DOTAM螯合物特异性的抗原结合位点可以是依照上文描述的实施方案任一的。

靶抗原可以是如本文中进一步讨论的任何抗原，例如任何肿瘤特异性抗原。在一些实施方案中，它可以是由病原体，诸如原核生物或病毒表达的蛋白质或多肽。

在一些实施方案中，肿瘤相关抗原可以是CEA(癌胚抗原)。就是说，在一些实施方案中，双特异性抗体可以包含至少一个对Pb-DOTAM螯合物特异性的抗原结合位点和至少一个对CEA特异性的抗原结合位点。CEA在本发明的语境中是有利的，因为它内在化相对较慢，因而高百分比的双特异性抗体在初始治疗之后会在细胞的表面上保持可及，供结合放射性核素。其它慢内在化靶物/肿瘤相关抗原也可以是优选的和本文中描述的。可能在本发明中有用的肿瘤相关抗原的其它例子包括CD20或HER2。

在其中靶抗原是CEA的一些实施方案中，对CEA特异性的抗原结合位点可以包含包含至少一种，两种或三种重链CDR的重链，其中：

d)重链CDR1包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列；

e)重链CDR2包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列；

f)重链CDR3包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列；和/或

对CEA特异性的抗原结合位点可以包含包含至少一种，两种或三种轻链CDR的轻链，其中：

a)轻链CDR1包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列；

b)轻链CDR2包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列；

c)轻链CDR3包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列。

在一些实施方案中，针对CEA的抗原结合位点可以包含至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种(即所有)选自下述各项的CDR：

a)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的重链CDR1；

b)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的重链CDR2；

c)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链CDR3；

d)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链CDR1；

e)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的轻链CDR2；

f)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链CDR3。

在一些实施方案中，针对CEA的抗原结合位点可以包含包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链可变域，或其包含与SEQ ID NO：17具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，或99％同一性的氨基酸序列的变体。

任选地，抗原结合位点可以包含包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的轻链可变域，或其包含与SEQ ID NO：18具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，或99％同一性的氨基酸序列的变体。

任选地，对CEA特异性的抗原结合位点可以包含包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链可变域或其变体，和包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的轻链可变域或其变体。

双特异性抗体或多特异性抗体的多种可能型式是本领域已知的，包括本文中进一步描述的那些。本发明的抗体可以采取这些型式任一。例如，在一些实施方案中，双特异性抗体可以是二价，三价或四价的。

可能优选的是，本抗体包括Fc区。Fc区的存在在放射性免疫疗法和放射性成像的语境中具有益处，例如与用更小的片段可以观察到的相比延长蛋白质的循环半衰期和/或导致更高的肿瘤摄取。

在其中存在Fc区的一些实施方案中，可能优选的是，Fc区改造成降低效应器功能。这可以包括Fc区残基234，235，238，265，269，270，297，327和/或329中一个或多个，例如234，235和/或329中一个或多个的替代。在一些实施方案中，Fc区可以改造成包括Pro 329变成Gly，Leu 234变成Ala和/或Leu 235变成Ala的替代(编号方式依照EU索引)。

多种型式的包括Fc域的多特异性抗体是已知的。

在一个实施方案中，双特异性或多特异性抗体可以包含i)Fc域，ii)至少一个包含对Pb-DOTAM螯合物特异性的抗原结合位点的Fab，交叉Fab，Fv，scFab，或scFv片段或单域抗体(VHH)，和iii)至少一个包含对靶抗原特异性的抗原结合位点的Fab，交叉Fab，Fv，scFab或scFv片段或单域抗体(VHH)。

在一些实施方案中，可能优选的是，双特异性或多特异性抗体对于靶抗原(例如肿瘤相关抗原)是多价，例如二价的。这具有提高亲合力的优点。

在一些实施方案中，可能优选的是，双特异性或多特异性抗体对于Pb-DOTAM是单价的。这降低使用清除剂时高分子量复合物形成的风险(见下文的进一步讨论)。

如此，在一些实施方案中，抗体可以是三价的：就是说，对靶抗原的二价和对Pb-DOTAM的单价。

在一种例示性型式中，双特异性或多特异性抗体可以包含包含第一和第二抗体重链和第一和第二抗体轻链的全长抗体(例如IgG)，其中第一重链和第一轻链组装成形成针对第一抗原的抗原结合位点，且其中第二重链和第二轻链组装成形成针对第二抗原的抗原结合位点。任选地，别的抗原结合模块可以例如经由多肽接头融合至第一和/或第二重链的N或C端以提高对两种抗原之一或二者的效价。例如，针对第一抗原的别的抗原结合模块可以融合至两个重链分子之一或二者的N端。

在另一种例示性型式中，双特异性或多特异性抗体可以包含包含针对第一抗原的抗原结合位点的全长抗体(例如IgG)(例如，其对于第一抗原可以是二价的)，且进一步包含至少一个对第二抗原特异性的抗原结合模块。在各种实施方案中，抗原结合模块可以是Fab片段，交换Fab分子，scFab，Fv分子，scFv，或单域抗体(VHH)或可以是第二全长抗体的一部分。例如，抗体可以包含包含针对第一抗原的抗原结合位点的全长抗体，且进一步至少包含一起形成针对第二抗原的抗原结合位点的第二重链可变域和第二轻链可变域。或是第一或是第二抗原是Pb-DOTAM螯合物，且另一抗原是靶抗原。

在本文中的各型式的一些实施方案中，第二抗原是Pb-DOTAM螯合物且第一抗原是靶物，例如肿瘤相关抗原(在一些实施方案中，CEA，CD20或ERBB2)。

在另一种例示性型式中，双特异性或多特异性抗体可以包含包含针对第一抗原的抗原结合位点的全长抗体(例如，其对于第一抗原可以是二价的)，其中重链之一的N或C端经由多肽接头与第一多肽连接且其中第一多肽与第二多肽联合以形成包含针对第二抗原的结合位点的Fab或交叉Fab。例如，这种型式可以包含：

i)由VH域和CH1域组成的第一多肽，其与由VL和CL域组成的第二多肽联合；或

ii)由VL域和CH1域组成的第一多肽，其与由VH和CL域组成的第二多肽联合；或

iii)由VH域和CL域组成的第一多肽，其与由VL和CH1域组成的第二多肽联合；

使得第一和第二多肽一起形成针对第二抗原的抗原结合位点。

在一些实施方案中，融合可以在全长抗体的重链之一的N端。

在另一个特定实施方案中，抗体可以是双特异性抗体，其包含：

a)特异性结合第一抗原且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成的全长抗体；

b)由下述各项组成的多肽：

i)抗体重链可变域(VH)；或

ii)抗体重链可变域(VH)和抗体重链恒定域(CH1)；或

iii)抗体重链可变域(VH)和抗体轻链恒定域(CL)；

其中所述多肽以VH域的N端经由肽接头与所述全长抗体的两条重链之一的C端融合；

c)由下述各项组成的多肽：

i)抗体轻链可变域(VL)；或

ii)抗体轻链可变域(VL)和抗体轻链恒定域(CL)；或

iii)抗体轻链可变域(VL)和抗体重链恒定域(CH1)；

其中所述多肽以VL域的N端经由肽接头与所述全长抗体的两条重链之另一的C端融合；且

其中(b)下的肽的抗体重链可变域和(c)下的肽的抗体轻链可变域一起形成针对第二抗原的抗原结合位点。

在这种型式中，或是第一或是第二抗原可以是Pb-DOTAM螯合物。另一会是靶抗原，例如肿瘤相关抗原。

在一些实施方案中，第二抗原是Pb-DOTAM螯合物且第一抗原是靶物，例如肿瘤相关抗原(在一些实施方案中，CEA，CD20或ERBB2)。

上文描述的抗体可以是三价的。在另一个可能实施方案中，可以融合别的抗原结合模块以提高针对两种抗原之一或二者的效价，如本文中进一步讨论的。

任选地，所述接头(和如本文中讨论的任何接头)可以是至少5个氨基酸，优选25至50个氨基酸的肽。接头可以是刚性接头或柔性接头。在一些实施方案中，它是包含Thr，Ser，Gly和/或Ala残基或由Thr，Ser，Gly和/或Ala残基组成的柔性接头。例如，它可以包含Gly和Ser残基或由Gly和Ser残基组成。在一些实施方案中，它可以具有重复基序，诸如(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n是例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10。在一些实施方案中，接头可以是或可以包含序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：26)。本领域技术人员可以使用且能鉴定其它接头。

WO2010/115589 A1(Roche Glycart AG)中提供了这种抗体型式的别的细节，通过援引将其完整收入本文中。

任选地，

i)在a)下的全长抗体的第一轻链的恒定域CL中位置124处的氨基酸独立用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)(在一个优选实施方案中，独立用赖氨酸(K)或精氨酸(R))替代(编号方式依照Kabat)，且在a)下的第一重链的恒定域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸独立用谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；或

ii)在b)下的第二轻链的恒定域CL中位置124处的氨基酸独立用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)(在一个优选实施方案中，独立用赖氨酸(K)或精氨酸(R))替代(编号方式依照Kabat)，且在b)下的第二重链的恒定域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸独立用谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)替代(编号方式依照Kabat EU索引)。

在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体可以具有如上文列出的三价结构，且可以包含：

a)特异性结合CEA且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成的全长抗体；

其中重链与SEQ ID NO：22或23的氨基酸1-450(含，使用顺序编号方式)(即序列中在接头前的部分)的重链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性；且

其中轻链与SEQ ID NO：21的轻链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性；和/或

b)由下述各项组成的多肽：

i)与SEQ ID NO∶7的重链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体重链可变域(VH)；或

ii)所述与SEQ ID NO：7的重链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体重链可变域(VH)和抗体重链恒定域(CH1)；或

iii)所述与SEQ ID NO：7的重链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体重链可变域(VH)和抗体轻链恒定域；

其中所述多肽以VH域的N端经由肽接头与所述全长抗体的两条重链之一的C端融合；和/或

c)由下述各项组成的多肽：

i)与SEQ ID NO：8的轻链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体轻链可变域(VL)；或

ii)所述与SEQ ID NO：8的轻链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体轻链可变域(VL)和抗体轻链恒定域(CL)；或

iii)所述与SEQ ID NO：8的轻链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体轻链可变域(VL)和抗体重链恒定域(CH1)；

其中所述多肽以VL域的N端经由肽接头与所述全长抗体的两条重链之另一的C端融合；

其中(b)下的肽的抗体重链可变域和(c)下的肽的抗体轻链可变域一起形成针对Pb-DOTAM螯合物的抗原结合位点。

在一个例子中，全长抗体的重链之一包含所谓的“节突变”(T366W和任选地S354C或Y349C之一，优选S354C)且另一包含所谓的“穴突变”(T366S，L368A和Y407V和任选地Y349C或S354C，优选Y349C)(见例如Carter，P.et al.，Immunotechnol.2(1996)73)，依照EU索引编号方式。

在一些实施方案中，(a)下的两条抗体重链包含

i)与SEQ ID NO：23的氨基酸1-450(含，使用顺序编号方式)(即在接头前的序列)的重链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的第一抗体重链，其具有位置349处的C，位置366处的S，位置368处的A和位置407处的V(EU编号方式)；和

ii)与SEQ ID NO：22的氨基酸1-450(含，使用顺序编号方式)的重链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的第二抗体重链，其具有位置354处的C和位置366处的W(EU编号方式)。

本文中提到的“固定的”残基是CH3中的“节-入-穴”突变或其它残基，诸如二硫桥形成残基，其与另一重链的CH3上的对应残基配对以有利于形成期望的分子。另一重链上可以存在的可能残基可以衍生自表2的序列(例如序列19和20或22和23)。例如，在一个实施方案中，如果第一抗体重链具有位置349处的C，那么第二抗体重链具有位置354处的C。

任选地，接头是如上文描述的。

在另一个实施方案中，本发明的双特异性抗体可以具有如上文列出的三价结构，且可以包含：

a)特异性结合CEA且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成的全长抗体；

其中重链与SEQ ID NO：19或20的氨基酸1-450(含且基于顺序编号方式：即在接头前的序列)的重链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性，且

其中轻链与SEQ ID NO：21的轻链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性；

b)由下述各项组成的多肽：

i)与SEQ ID NO：9的重链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体重链可变域(VH)；或

ii)所述与SEQ ID NO：9的重链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体重链可变域(VH)和抗体重链恒定域(CH1)；或

iii)所述与SEQ ID NO：9的重链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体重链可变域(VH)和抗体轻链恒定域；

其中所述多肽以VH域的N端经由肽接头与所述全长抗体的两条重链之一的C端融合；

c)由下述各项组成的多肽：

i)与SEQ ID NO：10的轻链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体轻链可变域(VL)；或

ii)所述与SEQ ID NO：10的轻链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体轻链可变域(VL)和抗体轻链恒定域(CL)；或

iii)所述与SEQ ID NO：10的轻链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体轻链可变域(VL)和抗体重链恒定域(CH1)，

其中所述多肽以VL域的N端经由肽接头与所述全长抗体的两条重链之另一的C端融合；且

其中(b)下的肽的抗体重链可变域和(c)下的肽的抗体轻链可变域一起形成针对Pb-DOTAM螯合物的抗原结合位点。

如上文描述的，在任何上文实施方案中，全长抗体的重链之一可以包含所谓的“节突变”(T366W和任选地S354C或Y349C之一，优选S354C)且另一包含所谓的“穴突变”(T366S，L368A和Y407V和任选地Y349C或S354C，优选Y349C)(见例如Carter，P.et al.，Immunotechnol.2(1996)73)，依照EU索引编号方式。

在一个实施方案中，(a)下的两条抗体重链可以包含

i)与SEQ ID NO：22的氨基酸1-450的重链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的第一抗体重链，其具有位置354处的C和位置366处的W(EU编号方式)；和

ii)与SEQ ID NO：23的氨基酸1-450的重链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的第二抗体重链，其具有位置349处的C，位置366处的S，位置368处的A和位置407处的V(EU编号方式)。

任选地，接头是如上文描述的。

在另一个实施方案中，双特异性抗体包含：

i)具有与SEQ ID NO：22的重链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的氨基酸序列的第一重链，

ii)与SEQ ID NO：23的重链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的第二重链，

iii)两条与SEQ ID NO：21的轻链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体轻链。

在还有另一个实施方案中，双特异性抗体是本文中称作PRIT-0213的分子，其包含

i)具有SEQ ID NO：22的氨基酸序列的第一重链；

ii)具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的第二重链；和

iii)两条具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的抗体轻链。

在另一个实施方案中，双特异性抗体包含：

i)具有与SEQ ID NO：19的重链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的氨基酸序列的第一重链，

ii)与SEQ ID NO：20的重链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的第二重链，

iii)两条与SEQ ID NO：21的轻链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体轻链。

在还有另一个实施方案中，双特异性抗体是本文中称作PRIT-0214的分子，其包含

i)具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的第一重链；

ii)具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的第二重链；和

iii)两条具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的抗体轻链。

在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体可以具有如上文列出的三价结构，且可以包含：

a)特异性结合ERBB2且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成的全长抗体；

其中重链与SEQ ID NO：36或37的氨基酸1-449(含，使用顺序编号方式)(即序列中在接头前的部分)的重链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性；且

其中轻链与SEQ ID NO：38的轻链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性；和/或

b)由下述各项组成的多肽：

i)与SEQ ID NO：7或9(在一些实施方案中，优选7)的重链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体重链可变域(VH)；或

ii)所述与SEQ ID NO：7或9(在一些实施方案中，优选7)的重链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体重链可变域(VH)和抗体重链恒定域(CH1)；或

iii)所述与SEQ ID NO：7或9(在一些实施方案中，优选7)的重链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体重链可变域(VH)和抗体轻链恒定域(CL)，

其中所述多肽以VH域的N端经由肽接头与所述全长抗体的两条重链之一的C端融合；和/或

c)由下述各项组成的多肽：

i)与SEQ ID NO∶8或10(在一些实施方案中，优选8)的轻链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体轻链可变域(VL)；或

ii)所述与SEQ ID NO：8或10(在一些实施方案中，优选8)的轻链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体轻链可变域(VL)和抗体轻链恒定域(CL)；或

iii)所述与SEQ ID NO：8或10(在一些实施方案中，优选8)的轻链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体轻链可变域(VL)和抗体重链恒定域(CH1)；

其中所述多肽以VL域的N端经由肽接头与所述全长抗体的两条重链之另一的C端融合；

其中(b)下的肽的抗体重链可变域和(c)下的肽的抗体轻链可变域一起形成针对Pb-DOTAM螯合物的抗原结合位点。

在一个例子中，全长抗体的重链之一包含所谓的“节突变”(T366W和任选地S354C或Y349C之一，优选S354C)且另一包含所谓的“穴突变”(T366S，L368A和Y407V和任选地S354C或Y349C，优选Y349C)(见例如Carter，P.et al.，Immunotechnol.2(1996)73)，依照EU索引编号方式。

在一些实施方案中，(a)下的两条抗体重链包含

i)与SEQ ID NO：37的氨基酸1-449(含，使用顺序编号方式)(即在接头前的序列)的重链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的第一抗体重链，其具有位置349处的C，位置366处的S，位置368处的A和位置407处的V(EU编号方式)；和

ii)与SEQ ID NO：36的氨基酸1-449(含，使用顺序编号方式)的重链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的第二抗体重链，其具有位置354处的C和位置366处的W(EU编号方式)。

任选地，接头是如上文描述的。

在另一个实施方案中，双特异性抗体包含：

i)具有与SEQ ID NO：36的重链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的氨基酸序列的第一重链，

ii)与SEQ ID NO：37的重链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的第二重链，

iii)两条与SEQ ID NO：38的轻链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体轻链。

在还有另一个实施方案中，双特异性抗体是本文中称作P1AD9827的分子，其包含

i)具有SEQ ID NO：36的氨基酸序列的第一重链；

ii)具有SEQ ID NO：37的氨基酸序列的第二重链；和

iii)两条具有SEQ ID NO：38的氨基酸序列的抗体轻链。

在另一个实施方案中，本发明的双特异性抗体可以具有如上文列出的三价结构，且可以包含：

a)特异性结合CD20且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成的全长抗体；

其中重链与SEQ ID NO：47或48的氨基酸1-448(含，使用顺序编号方式)(即序列中在接头前的部分)的重链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性；且

其中轻链与SEQ ID NO：49的轻链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性；和/或

b)由下述各项组成的多肽：

i)与SEQ ID NO：7或9(在一些实施方案中，优选7)的重链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体重链可变域(VH)；或

ii)所述与SEQ ID NO：7或9(在一些实施方案中，优选7)的重链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体重链可变域(VH)和抗体重链恒定域(CH1)，

iii)所述与SEQ ID NO：7或9(在一些实施方案中，优选7)的重链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体重链可变域(VH)和抗体轻链恒定域(CL)，

其中所述多肽以VH域的N端经由肽接头与所述全长抗体的两条重链之一的C端融合；和/或

c)由下述各项组成的多肽：

i)与SEQ ID NO：8或10(在一些实施方案中，优选8)的轻链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体轻链可变域(VL)；或

ii)所述与SEQ ID NO：8或10(在一些实施方案中，优选8)的轻链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体轻链可变域(VL)和抗体轻链恒定域；或

iii)所述与SEQ ID NO：8或10(在一些实施方案中，优选8)的轻链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体轻链可变域(VL)和抗体重链恒定域，

其中所述多肽以VL域的N端经由肽接头与所述全长抗体的两条重链之另一的C端融合；

其中(b)下的肽的抗体重链可变域和(c)下的肽的抗体轻链可变域一起形成针对Pb-DOTAM螯合物的抗原结合位点。

在一个例子中，全长抗体的重链之一包含所谓的“节突变”(T366W和任选地S354C或Y349C之一，优选S354C)且另一包含所谓的“穴突变”(T366S，L3 68A和Y407V和任选地Y349C或S354C，优选Y349C)(见例如Carter，P.et al.，Immunotechnol.2(1996)73)，依照EU索引编号方式。

在一些实施方案中，(a)下的两条抗体重链包含

i)与SEQ ID NO：48的氨基酸1-448(含，使用顺序编号方式)(即在接头前的序列)的重链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的第一抗体重链，其具有位置349处的C，位置366处的S，位置368处的A和位置407处的V(EU编号方式)；和

ii)与SEQ ID NO：47的氨基酸1-448(含，使用顺序编号方式)的重链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的第二抗体重链，其具有位置354处的C和位置366处的W(EU编号方式)。

任选地，接头是如上文描述的。

在另一个实施方案中，双特异性抗体包含：

i)具有与SEQ ID NO：47的重链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的氨基酸序列的第一重链，

ii)与SEQ ID NO：48的重链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的第二重链，

iii)两条与SEQ ID NO：49的轻链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体轻链。

在还有另一个实施方案中，双特异性抗体是本文中称作P1AD9826的分子，其包含

i)具有SEQ ID NO：47的氨基酸序列的第一重链；

ii)具有SEQ ID NO：48的氨基酸序列的第二重链；和

iii)两条具有SEQ ID NO：49的氨基酸序列的抗体轻链。

在又一个方面，本发明涉及一种多核苷酸或多核苷酸套组，其编码本文中描述的任何抗体。在又一些实施方案中，本发明涉及一种载体或载体套组，其包含所述多核苷酸或多核苷酸套组，任选表达载体。在又一些方面，本发明涉及一种原核或真核宿主细胞，其包含本发明的载体。另外，提供了一种生成抗体的方法，其包括培养宿主细胞，使得抗体生成。

如本文中描述的双特异性或多特异性抗体可以在多种应用中找到用途，包括治疗性和诊断性应用，诸如预靶向的放射性免疫疗法和预靶向的放射性免疫成像。

如此，在又一个方面，本发明涉及如本文中描述的任何双特异性或多特异性抗体，供预靶向的放射性成像中使用。在此类实施方案中，螯合的Pb优选是

一种将放射性同位素靶向至组织或器官进行成像的方法可以包括：

i)对受试者施用如本文中描述的多特异性或双特异性抗体，其中抗体结合靶抗原并定位于表达靶抗原的细胞的表面；并

ii)随后将与DOTAM或其功能性变体螯合的Pb放射性核素施用于个体，其中与DOTAM或其功能性变体螯合的Pb放射性核素结合定位于靶细胞的表面的抗体。

任选地，在步骤(i)和(ii)之间施用清除剂，其中清除剂结合对Pb-DOTAM螯合物特异性的抗原结合位点。清除剂封闭针对Pb-DOTAM的抗原结合位点，阻止循环抗体结合螯合的Pb放射性核素。或者/另外，清除剂可以提高抗体自身体清除的速率。“清除剂”可以备选地称作“封闭剂”：这些术语可以在下面的讨论中彼此替代。

清除剂可以包含金属离子与DOTAM或其功能性变体的复合物，其中所述复合物受到针对Pb-DOTAM的抗原结合位点识别。优选地，金属离子是稳定的同位素或本质上稳定的同位素。“稳定的同位素”意指并不经历放射性衰变的同位素。“本质上稳定的同位素”意指以非常长的半衰期经历放射性衰变，使得它对于使用是安全的同位素。优选地，金属离子选自Pb，Ca和Bi的离子。例如，清除剂可以包含与DOTAM或其功能性变体复合的Pb的稳定的同位素，与DOTAM或其功能性变体复合的Ca，或与DOTAM或其功能性变体复合的

DOTAM或其功能性变体是与清除模块缀合的。这种模块提供进入肿瘤的摄取较低的清除剂，例如凭借它的尺寸和/或高流体力学半径。下文进一步讨论了合适的清除模块。在一些实施方案中，清除剂可以包含与右旋糖酐或其衍生物缀合的DOTAM或其功能性变体。

在成像方法的另一个实施方案中，多特异性或双特异性抗体可以是在施用时结合螯合的Pb放射性核素的。

任选地，在任何实施方案中，该方法可以进一步包括：

iii)对与DOTAM或其功能性变体螯合的Pb放射性核素定位其中的组织或器官成像。

在一些实施方案中，靶抗原可以是肿瘤特异性抗原，而且成像可以是一种对一个或多个肿瘤成像的方法。

在仍有又一个方面，本发明涉及如本文中描述的抗体，供一种预靶向的放射性免疫疗法的方法中使用。在此类实施方案中，螯合的Pb优选是

一种将放射性同位素靶向至组织或器官进行疗法的方法可以包括：

i)对受试者施用如本文中描述的多特异性或双特异性抗体，其中抗体结合靶抗原并定位于表达靶抗原的细胞的表面；并

ii)随后施用与DOTAM或其功能性变体螯合的Pb放射性核素，其中与DOTAM或其功能性变体螯合的Pb放射性核素结合定位于细胞的表面的抗体。

任选地，在步骤(i)和(ii)之间施用清除剂，如上文描述的。

在一些实施方案中，靶抗原是肿瘤相关抗原，而且该方法是一种治疗癌症的方法。在其它实施方案中，靶抗原可以是与感染有关的抗原，例如由原核生物或受到病毒感染的细胞表达的蛋白质。

在一些实施方案中，可以作为组合疗法的一部分施用本文中描述的抗体。例如，它们可以与一种或多种放射性敏化剂和/或化疗剂组合施用：可以同时或顺序(以任一次序)施用放射性敏化剂或化疗剂和抗体。

可以任选组合本文中描述的放射性成像和放射性免疫疗法的方法，例如通过施用抗体和

本发明还进一步涉及包含本发明的抗体和药学可接受赋形剂的药学组合物。

在又一些实施方案中，本发明涉及一种试剂盒，其包含本发明的抗体和一种，两种，三种，四种或所有下述各项：

i)药学可接受赋形剂；

ii)与DOTAM或其功能性变体螯合的Pb放射性核素；

iii)如本文中描述的清除剂；

iv)一种或多种另外的化疗剂；和/或

v)一种或多种放射性敏化剂。

在本发明的仍有又一个方面，本发明人开发了一种新颖的清除剂。此类清除剂可以在如本文中描述的任何诊断，成像或治疗方法中使用。

在一个方面，本发明涉及一种包含与选自DOTAM和DOTAM的功能性变体的螯合剂缀合的右旋糖酐或其衍生物的清除剂，其中所述螯合剂与Pb，Zn，Ca或Bi形成复合物。清除剂典型地包括螯合的金属离子，诸如Pb，Zn，Ca或Bi离子。

清除剂可以包含与DOTAM或DOTAM的功能性变体偶联的氨基右旋糖酐。例如，清除剂可以包含以异硫氰酸偶联与氨基右旋糖酐偶联的DOTAM(例如，可通过使氨基右旋糖酐与p-SCN-Bn-TCMC反应获得的化合物)。

使用清除剂的一项潜在困难是它们可能进入肿瘤，负面影响随后放射性配体结合的可能性。

本发明人进一步发现了当使用如下的基于右旋糖酐的清除剂时，能与清除剂渗透入肿瘤较低一起实现自血液清除较好：i)具有高平均分子量和ii)服从分子量截留，使得已经去除低于某种尺寸的片段。

如此，优选的清除剂可以是如下的一种，其中：i)清除剂中的右旋糖酐或其衍生物的平均分子量是200-800kDa，任选大于300，350，400或450kDa，且任选小于700，650，600或550kDa，任选约500kDa，和ii)已经去除小于规定分子量截留的右旋糖酐，右旋糖酐衍生物或清除剂，其中分子量截留是50kDa或以上，100kDa或以上，或200kDa或以上，任选在范围50kDa-250kDa或50kDa-200kDa，任选100kDa-200kDa中且任选约100kDa，150kDa或200kDa。

在又一个方面，本发明涉及制备清除剂的方法，和在放射性免疫疗法或放射性免疫成像的方法中使用清除剂的方法。

下文进一步讨论本发明的这些和其它方面。

附图简述

图1显示一种可能的双特异性抗体型式的示意图。这种型式包含两个针对一种靶物(A)的抗原结合位点和一个针对第二靶物(B)的抗原结合位点(2：1型式)。

图2显示与Pb-DOTAM复合的PRIT-0213的结构。

图3显示与Pb-DOTAM复合的PRIT-0213的相互作用位点的视图，依照Kabat编号。

图4显示在注射放射性标记的DOTAM之后24小时

图5显示在注射与放射性标记的DOTAM预结合的PRIT抗体之后96小时

图6显示在注射与放射性标记的DOTAM预结合的PRIT抗体之后多个时间点BxPC3肿瘤和血液中

图7显示在MKN45荷瘤小鼠中在注射

图8显示在MKN45荷瘤小鼠中在注射

图9显示在MKN45荷瘤小鼠中在注射

图10显示在无肿瘤小鼠中在注射

图11显示在无肿瘤小鼠中在注射

图12显示在注射

图13显示在注射

图14显示在注射

图15显示在注射放射性标记的DOTAM之后24小时

图16显示提高清除剂的量(0-100μg)对血液和肿瘤中

图17显示在注射

图18显示在注射

图19显示在注射

图20显示在注射放射性标记的DOTAM之后24小时

图21显示对于BxPC3模型中的处理周期1和2，在注射

图22显示在BxPC3模型中在CEA-PRIT之后组A-G(n＝8)中的平均体重。在每个组中在第一例死亡处截断曲线。垂直点线指示一些或所有组的

图23显示在BxPC3模型中在CEA-PRIT之后组A-G(n＝8)中的平均重量变化，表述为初始体重的百分比。在每个组中在第一例死亡处截断曲线。垂直点线指示一些或所有组的

图24显示在BxPC3模型中组A-G(n＝8)的肿瘤生长平均值及标准误差。在每个组中在第一例死亡处截断曲线。垂直点线指示一些或所有组的

图25显示在BxPC3模型中组A-G的个体肿瘤生长曲线。垂直点线指示

图26显示Kaplan-Meier曲线，显示在BxPC3模型中组A-G(n＝8)中的存活。垂直点线指示

图27显示对于LS174T模型中的处理周期1和2，在注射

图28显示在LS174T模型中在CEA-PRIT之后组A-G(n＝8)中的平均体重。在每个组中在第一例死亡处截断曲线。垂直点线指示一些或所有组的

图29显示在LS174T模型中在CEA-PRIT之后组A-G(n＝8)中的平均重量变化，表述为初始体重的百分比。在每个组中在第一例死亡处截断曲线。垂直点线指示一些或所有组的

图30显示在LS174T模型中组A-G(n＝8)的肿瘤生长平均值及标准误差。在每个组中在第一例死亡处截断曲线。垂直点线指示一些或所有组的2

图31显示在LS174T模型中组A-G的个体肿瘤生长曲线。垂直点线指示2

图32显示Kaplan-Meier曲线，显示在LS174T模型中组A-G(n＝8)中的存活。垂直点线指示

图33显示在注射

图34显示在注射

图35显示在注射

图36显示一种抗体(PRIT-0165)对MKN-45细胞的结合，使用或是二级检测(右边小图，Alexa 488)或是DOTAM FITC(左边小图，FITC-A)检测它。

图37显示双特异性抗体的可能型式，使用CEA作为例示性靶抗原。也可以使用其它靶抗原。

图38显示P1AD8927对KPL-4细胞的结合以证明Her2结合能力：使用人IgG特异性二抗检测抗体。

图39显示P1AD8927对KPL-4细胞的结合以证明DOTAM结合能力：使用Pb-DOTAM-FITC进行同种型校正检测。

图40显示P1AD8926对Raji细胞的结合以证明CD20结合能力：使用人IgG特异性二抗检测抗体。

图41显示P1AD8926对Raji细胞的结合以证明DOTAM结合能力：使用Pb-DOTAM-FITC进行同种型校正检测。

图42显示方案103的研究大纲，在SCID小鼠中的皮下BxPC3肿瘤上评估CEA-PRIT(h＝小时，d＝天，w＝周)。

图43：小图A显示在两个处理周期之后收集的组织中

图44显示在BxPC3模型中组A-G(n＝10)的平均肿瘤生长曲线及标准误差。在n＜5时截断曲线。垂直点线指示一些或所有组的

图45显示在BxPC3模型中组A-G(n＝10)的个体肿瘤生长曲线。垂直点线指示

图46显示Kaplan-Meier曲线，显示在BxPC3模型中组A-G(n＝10)中的存活。垂直点线指示

图47显示在BxPC3模型中在CEA PRIT之后组A-G(n＝10)中的平均体重损失。在n＜5时截断曲线。垂直点线指示一些或所有组的

图48显示皮下BxPC3荷瘤SCID小鼠中

图49显示在注射20μCi/100μg预结合的

图50显示皮下BxPC3荷瘤SCID小鼠中

图51显示方案131的研究大纲，评估在皮下BxPC3荷瘤SCID小鼠中使用用5种不同金属(Zn，Gd，Cu，Ca，或Pb)任一淬灭的CEA-DOTAM BsAb，Pb-DOTAM-右旋糖酐-500CA，和

图52显示在注射CEA-DOTAM预靶向的

图53显示在注射用不同金属淬灭的

图54显示在注射通过CD20-DOTAM BsAb或阴性对照DIG-DOTAM预靶向的

图55显示在注射通过HER2-DOTAM BsAb或阴性对照DIG-DOTAM预靶向的

图56显示方案154的研究大纲，评估在皮下HPAF-II荷瘤SCID小鼠中使用各种BsAb构建物在CEA-PRIT之后

图57显示在注射通过阴性对照DIG-DOTAM，标准CEA-DOTAM BsAb，或备选BsAb构建物之一预靶向的

图58显示在注射通过阴性对照DIG-DOTAM，标准CEA-DOTAM BsAb，或备选BsAb构建物之一预靶向的

图59显示方案162的实验进度表。在皮下WSU-DLCL2荷瘤SCID小鼠中使用CD20-DOTAM BsAb，Ca-DOTAM-右旋糖酐-500CA，和

图60显示在注射CD20-DOTAM预靶向的

图61显示组A-G的平均WSU-DLCL2皮下肿瘤生长，以mm

图62显示在各种处理之后小鼠体重的平均变化，表述为初始体重的％±SEM。点线指示

发明详述

出于本文中的目的，“受体人框架”指包含自人免疫球蛋白框架或如下文定义的人共有框架衍生的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少，9或更少，8或更少，7或更少，6或更少，5或更少，4或更少，3或更少，或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。

“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)来表述。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和例示性的实施方案。

“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中具有一处或多处改变的抗体，与不拥有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。

术语“抗Pb-DOTAM抗体”，“结合Pb-DOTAM的抗体”，“结合Pb-DOTAM螯合物的抗体”和等同术语指能够以足够亲和力结合Pb-DOTAM螯合物，使得该抗体在用于分离Pb-DOTAM标记的模块的分选和/或纯化方案中是有用的，和/或使得该抗体能够将Pb-DOTAM定位于抗体的部位(例如为了将Pb-DOTAM靶向细胞的目的)的抗体。术语“抗靶物抗体”和“结合靶物的抗体”指能够以足够亲和力结合靶物，使得该抗体在牵涉抗体定位于靶物(例如如细胞的表面上表达的)的治疗性和/或诊断性应用中是有用的抗体。在一个实施方案中，根据例如通过放射免疫测定法(RIA)的测量，抗体结合无关模块和/或无关靶蛋白质的程度小于该抗体对Pb-DOTAM或靶物的结合的约10％。在某些实施方案中，抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10

本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。

“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体中结合完整抗体结合的抗原的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv，Fab，Fab’，Fab’SH，F(ab’)

与参照抗体“结合相同表位的抗体”可以指在竞争测定法中将参照抗体对其抗原的结合阻断50％或更多的抗体，且相反，参照抗体在竞争测定法中将该抗体对其抗原的结合阻断50％或更多。本文中提供了一种例示性竞争测定法。

术语“嵌合”抗体指其中的重和/或轻链的一部分自特定的来源或物种衍生，而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体。

抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5大类：IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM，并且这些中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgG

在用于本文时，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于：放射性同位素(例如

“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。

药剂(例如药学配制剂)的“有效量”指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。

本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区一部分的C端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区自Cys226，或自Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，又称作EU索引，如记载于Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991。

“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。一般地，可变域的FR由4个FR域组成：FR1，FR2，FR3，和FR4。因而，HVR和FR序列在VH(或VL)中一般以如下的顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

术语“全长抗体”，“完整抗体”，和“全抗体”在本文中可互换使用，指与天然抗体结构具有基本上类似的结构或者具有含有如本文中所限定的Fc区的重链的抗体。全长抗体可以是例如IgG。

术语“宿主细胞”，“宿主细胞系”，和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已经导入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。

“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。通常，序列亚组是如Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIHPublication 91-3242，Bethesda MD(1991)，第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组III。

“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。

如本文中使用的，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上限定的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触”)的每个区。一般地，抗体包含6个HVR：三个在VH中(H1，H2，H3)，且三个在VL中(L1，L2，L3)。例示性HVR包括：

(a)高变环，存在于氨基酸残基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)，26-32(H1)，53-55(H2)，和96-101(H3)(Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))；

(b)CDR，存在于氨基酸残基24-34(L1)，50-56(L2)，89-97(L3)，31-35b(H1)，50-65(H2)，和95-102(H3)(Kabat et al.，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，5th Ed.Public Health Service，Naional Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))；

(c)抗原接触，存在于氨基酸残基27c-36(L1)，46-55(L2)，89-96(L3)，30-35b(H1)，47-58(H2)，和93-101(H3)(MacCallum et al.J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；和

(d)(a)，(b)，和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)，47-56(L2)，48-56(L2)，49-56(L2)，26-35(H1)，26-35b(H1)，49-65(H2)，93-102(H3)，和94-102(H3)。

代替上文，如本文中描述的CDR-H1的序列可以自Kabat26延伸至Kabat35。

在一个实施方案中，HVR或CDR残基包含表2中或说明书中别处鉴定的那些。

除非另有指示，可变域中的HVR/CDR残基和其它残基(例如FR残基)在本文中依照Kabat等，见上文编号。

“免疫缀合物”指与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒剂)缀合的抗体。

“个体”或“受试者”指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛，绵羊，猫，犬，和马)，灵长类(例如人和非人灵长类诸如猴)，家兔，和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。

如本文中描述的分子可以是“分离的”。“分离的”抗体指已经与其天然环境的组分分开的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如离子交换或反相HPLC方法)测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述，见例如Flatman et al.，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。

术语“核酸分子”或“多核苷酸”包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基(具体是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)，鸟嘌呤(G)，腺嘌呤(A)，胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))，糖(即脱氧核糖或核糖)，和磷酸基团构成。常常，核酸分子通过碱基序列来描述，由此所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基序列典型地以5’至3’呈现。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)(包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA)，核糖核酸(RNA)(特别是信使RNA(mRNA))，合成形式的DNA或RNA，和包含这些分子中的两种或更多种的混合聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。另外，术语核酸分子包括有义和反义链二者，以及单链和双链形式。此外，本文中描述的核酸分子可含有天然发生的或非天然发生的核苷酸。非天然发生的核苷酸的例子包括具有衍生化的糖或磷酸主链连接的经修饰核苷酸碱基或经化学修饰的残基。核酸分子还涵盖适合作为用于在体外和/或在体内(例如在宿主或患者中)直接表达本发明的抗体的载体的DNA和RNA分子。此类DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可以是未修饰的或经修饰的。例如，可以化学修饰mRNA以增强RNA载体的稳定性和/或编码分子的表达，使得能将mRNA注射入受试者以在体内生成抗体(见例如Stadler et al.，Nature Medicine 2017，2017年6月12日在线发表，doi：10.1038/nm.4356或EP 2 101 823 B1)。

“分离的”核酸指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但是核酸分子在染色体外或在与其天然染色体位置不同的染色体位置处存在。

“编码抗体的分离的核酸”指编码抗体重和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括单一载体或不同载体中的此类核酸分子，和存在于宿主细胞中的一个或多个位置的此类核酸分子。

在用于本文时，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特征，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法，重组DNA方法，噬菌体展示方法，和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。

“裸抗体”指未与异源模块(例如细胞毒性模块)或放射性标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药学配制剂中。

“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由二硫化物键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，又称作可变重域或重链可变域，接着是三个恒定域(CH1，CH2，和CH3)。类似地，从N至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，又称作可变轻域或轻链可变域，接着是一个恒定轻(CL)域。根据其恒定域氨基酸序列，抗体轻链可归入两种类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。

术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的用法说明书，其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症，用法，剂量，施用，联合疗法，禁忌症和/或警告的信息。

就参照多肽序列而言的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性之后，而且在任何保守替代不作为序列同一性的一部分考虑的情况下，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为了确定百分比氨基酸序列同一性目的的比对可以以本领域技能内的多种方式实现，例如使用公众可得的计算机软件，诸如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能确定用于比对序列的适宜参数，包括对所比较的序列的全长实现最大比对需要的任何算法。然而，为了本文中的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，而且源代码已经与用户文档一起提交美国版权局(Washington D.C.，20559)，以美国版权注册号TXU510087注册。公众经由Genentech公司(South San Francisco，California)可得到ALIGN-2程序，或者可以自源代码汇编。ALIGN-2程序应当编译成在UNIX操作系统，包括数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设置且不变。

在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)，与(with)，或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为给定氨基酸序列A具有或包含相对于，与，或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性)如下计算：

100乘分数X/Y

其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B的比对中打分为相同匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。会领会的是，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况中，A相对于B的％氨基酸序列同一性会不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有具体说明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值是如上一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得的。

术语“药学配制剂”指处于如下形式的制剂，该形式容许其中含有的活性成分的生物学活性是有效的，且不含对会接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的别的组分。

“药学可接受载剂”指药学配制剂中与活性成分不同的，且对受试者无毒的成分。药学可接受载剂包括但不限于缓冲剂，赋形剂，稳定剂，或防腐剂。

在用于本文时，“治疗/处理”(及其语法变型)指试图改变所治疗个体的天然过程的临床干预，并且可以为了预防或者在临床病理学的过程期间实施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或再发生，减轻症状，减轻/减少疾病的任何直接或间接病理后果，预防转移，降低疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和消退或改善的预后。在一些实施方案中，使用本发明的抗体来延迟疾病的形成或减缓疾病的进展。

术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构，其中每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)(见例如Kindt et al.，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freemanand Co.，第91页(2007))。单个VH或VL域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL域筛选互补VL或VH域的文库来分离结合特定抗原的抗体。见例如Portolano et al.，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson et al.，Nature352：624-628(1991)。

在用于本文时，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及并入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。

如本文中使用的，术语“Pb”或“铅”包括其离子，例如Pb(II)。如此，技术人员理解，例如，术语铅，Pb，

“DOTAM”具有化学名：

1，4，7，10-四(氨甲酰基甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷，

它是下式的化合物：

本发明在某些方面和实施方案还可以使用并入金属离子的DOTAM的功能性变体或衍生物。合适的DOTAM的变体/衍生物具有以某种有限程度与DOTAM的结构不同并保留发挥功能的能力(即保留用于本文中描述的一种或多种目的的足够活性)的结构。在此类方面和实施方案，DOTAM或DOTAM的功能性变体/衍生物可以是WO2010/099536中公开的活性变体之一。

合适的功能性变体/衍生物可以是下式的化合物：

或其药学可接受盐，其中

R

L

L

R

每一个D

每一个D

每一个D

每一个R

每一个R

每一个R

每一个R

每一个R

每一个R’，R

每一个R”，R

合适地，上式的功能性变体/衍生物具有与DOTAM的亲和力相当或大于DOTAM的亲和力的对本发明的抗体的亲和力，且具有与DOTAM的结合强度相当或大于DOTAM的结合强度的对Pb的结合强度(“亲和力”是通过解离常数测量的，如上文描述的)。例如，功能性变体/衍生物与本发明的抗体和/或Pb的解离常数可以是DOTAM与相同抗体/Pb的解离常数的1.1倍或更小，1.2倍或更小，1.3倍或更小，1.4倍或更小，1.5倍或更小，或2倍或更小。

每一个R

对于DOTAM变体，优选的是，1，2，3个或最优选每一个L

任选地，每一个L

每一个L

功能性变体/衍生物可以还包括与一个或多个另外的模块，例如小分子，多肽或碳水化合物缀合的DOTAM或如上文描述的化合物。这种附着可以经由大环环的主链中的碳之一发生。小分子可以是例如染料(诸如Alexa 647或Alexa 488)，生物素或生物素模块。多肽可以是例如寡肽，例如治疗性肽或多肽，诸如抗体。例示性碳水化合物包括右旋糖酐，线性或分支聚合物或共聚物(例如聚亚烷基，聚(亚乙基-赖氨酸)，聚甲基丙烯酸酯，聚氨基酸，多或寡糖，树状聚物)。

DOTAM的功能性变体/衍生物可以是下式的化合物：

其中每一个Z独立是如上文定义的R

在一个方面，本发明部分基于特异性结合Pb-DOTAM(即包含与Pb复合的DOTAM的螯合物，在本文中还称作“Pb-DOTAM螯合物”)的抗体的提供。

在某些实施方案中，特异性结合Pb-DOTAM的抗体可以具有下面的特性中一项或多项：

·特异性结合Pb-DOTAM和Bi-DOTAM；

·与其它螯合金属，诸如Cu-DOTAM相比，是对Pb-DOTAM选择性的；

·以非常高的亲和力结合Pb-DOTAM；

·与本文中描述的抗体，例如PRIT-0213或PRIT-0214结合Pb-DOTAM上的相同表位和/或与所述抗体具有相同的接触残基。

Pb的放射性同位素是在诊断和治疗方法中有用的。可以在本发明中使用的铅的特定放射性同位素包括

由于短路径长度和高线性能量转移的组合，作为α粒子发射体的放射性核素具有比β发射体更多的特异性肿瘤细胞杀伤及更少的对周围组织的损伤的潜力。

一般地，以螯合形式使用放射性金属。在本发明的各方面，作为螯合剂使用DOTAM。DOTAM是Pb(II)的稳定螯合剂(Yong and Brechbiel，Dalton Trans 2001 June 21，40(23)：6068-6076；Chappell et al.，Nuclear Medicine and Biology，Vol.27，pp.93-100，2000)。如此，DOTAM在与如上文讨论的铅的同位素，诸如

如上文讨论的，依照本发明的抗体结合Pb-DOTAM。在一些实施方案中，可能优选的是，抗体以100pM，50pM，20pM，10pM，5pM，1pM或更小，例如0.9pM或更小，0.8pM或更小，0.7pM或更小，0.6pM或更小，或0.5pM或更小的结合亲和力的Kd值结合Pb-DOTAM。

抗体另外结合与DOTAM螯合的Bi。在一些实施方案中，可能优选的是，抗体以1nM，500pM，200pM，100pM，50pM，10pM或更小，例如9pM，8pM，7pM，6pM，5pM或更小的结合亲和力的Kd值结合Bi-DOTAM(即包含与铋复合的DOTAM的螯合物，在本文中还称作“Bi-DOTAM螯合物”)。

在一些实施方案中，抗体可以以相似的亲和力结合Bi-DOTAM和Pb-DOTAM。例如，可能优选的是，对Bi-DOTAM/Pb-DOTAM的亲和力之比，例如Kd值之比在0.1-10，例如1-10的范围中。

下文提供了依照本发明的一种例示性抗体(PRIT-0213)的样品亲和力值：CEA-DOTAM BsAb的金属-DOTAM螯合物亲和力

亲和力是通过KinExA平衡测量测定的。

而且，与其它螯合金属，诸如Cu-DOTAM相比，本抗体优选是对Bi-DOTAM和/或Pb-DOTAM选择性的。例如，对Pb-DOTAM/Cu-DOTAM的亲和力之比，例如Kd值之比可以是至少100,000。

在一些实施方案中，可能优选的是，抗体以等于或大于具有下述各项的双特异性抗体(本文中称作PRIT-0213)的亲和力的亲和力(例如亲和力的Kd值)结合Pb-DOTAM和/或Bi-DOTAM：

i)具有SEQ ID NO：22的氨基酸序列的第一重链；

ii)具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的第二重链；和

iii)两条具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的抗体轻链。

在一些实施方案中，可能优选的是，抗体以等于或大于具有下述各项的双特异性抗体(本文中称作PRIT-0214)的亲和力的亲和力(例如亲和力的KD值)结合DOTAM螯合的Pb和/或DOTAM螯合的Bi：

i)具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的第一重链；

ii)具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的第二重链；和

iii)两条具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的抗体轻链。

在一些实施方案中，依照本发明的抗体与本文中公开的抗体结合相同或交叠的螯合的放射性核素表位。

在一些实施方案中，抗体与具有下述各项的Fab PRIT-0213结合相同或交叠的Pb-DOTAM螯合物(Pb-DOTAM)表位：

i)具有SEQ ID NO：22的氨基酸序列的第一重链；

ii)具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的第二重链；和

iii)两条具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的抗体轻链。

可以确定受到给定抗体结合的螯合的放射性核素(例如Pb-DOTAM)的表位，而且这可以与受到本文中公开的抗体(例如Fab PRIT-0213)结合的螯合的放射性核素的表位比较。

基于以

在一些实施方案中，依照本发明的抗体可以展示与就Pb-DOTAM而言下面的位点中一个或多个的相互作用，例如如通过与Pb-DOTAM复合的抗体的结构的PISA分析测定的：对氮杂环十二烷环(例如四环十二烷环)下面的氮杂环十二烷环区的边缘至面，N6，N7，N8，N5和/或C12。在一些实施方案中，抗体可以展示与就Pb-DOTAM而言下面的位点中一个或多个的相互作用：N7，N8，对氮杂环十二烷环的边缘对面，四环十二烷环和/或N6。

在一些实施方案中，抗体可以展示就Pb-DOTAM而言下面的相互作用中一项或多项，例如如通过与Pb-DOTAM复合的抗体的结构的PISA分析测定的：对氮杂环十二烷环的非极性相互作用边缘对面，与N8的极性相互作用，与N7的氢键，与N8的氢键，与N5的极性相互作用，与C12的非极性相互作用，与N7的极性相互作用，与N6的极性(氢)键，和/或与四环十二烷环的非极性相互作用。

在一些实施方案中，抗体可以展示就Pb-DOTAM而言下面的相互作用中一项或多项，例如如通过与Pb-DOTAM复合的抗体的结构的PISA分析测定的：抗体重链CDR3的一个或多个残基和N7之间的氢键，抗体重链CDR3的一个或多个残基和N8之间的氢键，抗体重链CDR2边缘对面的一个或多个残基对氮杂环十二烷环之间的非极性相互作用，抗体轻链CDR3和四环十二烷环之间的非极性相互作用，和/或抗体轻链CDR1和N6之间的非极性相互作用。

在其它实施方案中，抗体可以与本文中描述的分享相同的接触残基：例如，这些残基可以是不变的。这些残基可以包括下述：

a)在重链CDR2中：Phe50，Asp56和/或Tyr58，而且任选还有Gly52和/或Arg54；

b)在重链CDR3中：Glu95，Arg96，Asp97，Pro98，Tyr99，Ala100C和/或Tyr100D，而且任选还有Pro100E；

c)在轻链CDR1中：Tyr28和/或Asp32；

d)在轻链CDR3中：Gly91，Tyr92，Asp93，Thr95c和/或Tyr96；

e)在轻链CDR2中：任选Gln50。

上文讨论了依照本发明的抗体的某些方面和实施方案。下面讨论依照本发明的别的合适的方面和实施方案。在所有实施方案中，抗体保留结合Pb-DOTAM，和优选还有Bi-DOTAM的能力，仍然更优选以如上文讨论的亲和力和/或选择性。

在一个实施方案中，本发明可以提供一种包含至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种选自下述的CDR的抗Pb-DOTAM抗体：(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR-L3。

在一个实施方案中，本发明提供一种包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH CDR序列的抗体：(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-H3。在一个实施方案中，抗体包含包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-H3。在另一个实施方案中，抗体包含包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-H3和包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR-L3。在又一个实施方案中，抗体包含包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-H3，包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR-L3，和包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDR-H2。在又一个实施方案中，抗体包含包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-H3，包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR-L3，包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR-L1。在又一个实施方案中，抗体包含(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQID NO：2的氨基酸序列的CDR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-H3。

在另一个方面，本发明提供一种包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL CDR序列的抗体：(a)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR-L3。在一个实施方案中，抗体包含(a)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR-L3。

在另一个方面，本发明的抗体包含(a)包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH CDR序列的VH域：(i)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ IDNO：2的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-H3；和(b包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL CDR序列的VL域：(i)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR-L2，和(c)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR-L3。

在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR-L3。

在一些实施方案中，抗体可以包含CDR-H1，CDR-H2，CDR-H3，CDR-L1，CDR-L2和/或CDR-L3中一种或多种，分别与SEQ ID NO：1-6的氨基酸序列相比具有替代，例如1，2或3处替代。可能优选的是，这些替代并不存在于如上文列出的不变位置。

例如，在一些实施方案中，CDR-H2可以包含氨基酸序列FIGSRGDTYYASWAKG(SEQ IDNO：2)，或其具有SEQ ID NO：2中多至1，2，或3处替代的变体，其中这些替代不包括Phe50，Asp56和/或Tyr58，且任选也不包括Gly52和/或Arg54，均依照Kabat编号。

在一些实施方案中，CDR-H2可以是在如下文显示的一个或多个位置处替代的。这里和在下面的替代表中，替代基于种系残基(标有下划线的)或理论上在空间上贴合且也存在于结晶全集中该位点处的氨基酸。在一些实施方案中，如上文提到的残基可以是固定的且其它残基可以是依照下文的表替代的：在其它实施方案中，可以依照下文的表进行任何残基的替代。

任选地，CDR-H3可以包含氨基酸序列ERDPYGGGAYPPHL(SEQ ID NO：3)，或其具有SEQ ID NO：3中多至1，2，或3处替代的变体，其中这些替代不包括Glu95，Arg96，Asp97，Pro98，且任选也不包括Alal00C，Tyr100D，和/或Pro100E，和/或任选也不包括Tyr99。例如，在一些实施方案中，替代不包括Glu95，Arg96，Asp97，Pro98，Tyr99 Ala100C和Tyr100D。

在某些实施方案中，CDR-H3可以是在如下文显示的一个或多个位置处替代的。在一些实施方案中，如上文提到的残基可以是固定的且其它残基可以是依照下文的表替代的：在其它实施方案中，可以依照下文的表进行任何残基的替代。

任选地，CDR-L1可以包含氨基酸序列QSSHSVYSDNDLA(SEQ ID NO：4)，或其具有SEQID NO：4中多至1，2，或3处替代的变体，其中这些替代不包括Tyr28和/或Asp32(Kabat编号方式)。

在某些实施方案中，CDR-L1可以是在如下文显示的一个或多个位置处替代的。再次，在一些实施方案中，如上文提到的残基可以是固定的且其它残基可以是依照下文的表替代的：在其它实施方案中，可以依照下文的表进行任何残基的替代。

任选地，CDR-L3可以包含氨基酸序列LGGYDDESDTYG(SEQ ID NO：6)，或其具有SEQID NO：6中多至1，2，或3处替代的变体，其中这些替代不包括Gly91，Tyr92，Asp93，Thr95c和/或Tyr96(Kabat)。

在某些实施方案中，CDR-L3可以是在如下文显示的位置处替代的。(由于大多数残基是溶剂暴露的且没有抗原接触，因此可以想到许多替代)。再次，在一些实施方案中，如上文提到的残基可以是固定的且其它残基可以是依照下文的表替代的：在其它实施方案中，可以依照下文的表进行任何残基的替代。

抗体可以进一步包含CDR-H1和CDR-L2，任选分别具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5的序列，或其相对于其具有至少1，2或3处替代的变体，任选保守替代。

在任何上文实施方案中，抗Pb-DOTAM抗体可以是人源化的。在一个实施方案中，抗Pb-DOTAM抗体包含如任何上文实施方案中的CDR，且进一步包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在另一个实施方案中，抗Pb-DOTAM抗体包含如任何上文实施方案中的CDR，且进一步包含自vk 1 39和/或vh 2 26衍生的框架区。对于vk 1 39，在一些实施方案中，可以没有回复突变。对于vh 2 26，可以将种系Ala49残基回复突变成Gly49。

任选地，抗原结合位点可以包含包含选自由SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9组成的组的氨基酸序列的重链可变域(VH)，或其包含与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，或99％同一性的氨基酸序列的变体。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的抗体保留结合Pb-DOTAM的能力，优选以如本文中描述的的亲和力。VH序列可以保留如上文列出的不变残基。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9中替代，插入和/或删除总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，替代，插入，或删除发生在CDR以外的区域中(即在FR中)。任选地，抗体包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，VH包含一种，两种或三种选自下述的CDR：(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDR-H1，(b)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-H3。

在另一个方面，提供了一种抗Pb-DOTAM抗体，其中抗体包含与SEQ ID NO：8或SEQID NO：10的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的抗Pb-DOTAM抗体保留结合Pb-DOTAM的能力，优选以如本文中描述的亲和力。VL序列可以保留如上文列出的不变残基。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10中替代，插入和/或删除总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，替代，插入，或删除发生在CDR以外的区域中(即在FR中)。任选地，抗Pb-DOTAM抗体包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，VL包含一种，两种或三种选自下述的CDR：(a)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR-L3。

在另一个方面，提供了一种抗Pb-DOTAM抗体，其中抗体包含如上文提供的任何实施方案中的VH和如上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在另一个实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。

在本发明的又一个方面，依照任何上文实施方案的抗体是单克隆抗体，包括嵌合，人源化的或人抗体。在一个实施方案中，抗体是抗体片段，例如Fv，Fab，Fab’，scFab，scFv，双抗体，或F(ab’)

双抗体是有两个抗原结合位点的抗体片段，可以是二价的或双特异性的。见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson et al.，Nat.Med.9：129-134(2003)；和Hollinger etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。Hudson et al.，Nat.Med.9：129-134(2003)中还描述了三抗体和四抗体。

单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域，或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；见例如美国专利No.6,248,516 B1)。

可以通过多种技术来生成抗体片段，包括但不限于蛋白水解消化完整抗体以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)生成，如本文中描述的。

在另一个实施方案中，抗体是全长抗体，例如如本文中定义的完整IgG抗体或其它抗体类或同种型。

在一些方面，特异性结合DOTAM螯合的Pb的抗体是与细胞结合剂/靶向模块偶联以生成靶向剂的。任选地，特异性结合DOTAM螯合的Pb的抗体可以是依照上文描述的任何实施方案的抗体。

偶联可以优选地是通过作为融合多肽或蛋白质的表达。融合可以是直接的或经由接头的。融合多肽或蛋白质可以重组生成，避免任何对缀合化学的需要。任选地，所述接头可以是至少5个氨基酸，优选25至50个氨基酸的肽。接头可以是刚性接头或柔性接头。在一些实施方案中，它是包含Thr，Ser，Gly和/或Ala残基或由Thr，Ser，Gly和/或Ala残基组成的柔性接头。例如，它可以包含Gly和Ser残基或由Gly和Ser残基组成。在一些实施方案中，它可以具有重复基序，诸如(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n是例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10。在一些实施方案中，接头可以是或可以包含序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：26)。技术人员可以使用且能鉴定其它接头。

如此，有提供一种多特异性(例如双特异性)抗体复合物，其特异性结合Pb-DOTAM螯合物和另一种靶抗原，例如靶细胞的表面上存在的抗原二者。

就本发明涉及治疗方法和供治疗方法中使用的产品而言，它适用于通过靶向患者的患病细胞的细胞毒性活性可治疗的任何状况。治疗优选是肿瘤或癌症(例如胰腺，乳腺或前列腺癌)的。然而，本发明的适用性不限于肿瘤和癌症。例如，治疗还可以是病毒感染的。已经对针对在受感染细胞的表面上表达的病毒抗原的免疫毒素调查多种病毒感染，诸如HIV，狂犬病和EBV。Cai and Berger，2011，Antiviral Research 90(3)：143-50使用含有PE38来靶向杀伤受到卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染的细胞的一种免疫毒素。另外，

如此，合适的靶抗原可以包括癌细胞抗原，特别是人癌细胞抗原，病毒抗原或微生物抗原。

本文中描述的靶向性抗体设计为经由它们的细胞表面抗原结合患病细胞，诸如肿瘤细胞。抗原通常是或是过表达或是在异常时间表达的正常细胞表面抗原。理想地，靶抗原只在患病细胞(诸如肿瘤细胞)上表达，然而这在实践中罕见观察到。作为结果，通常基于患病和健康组织之间的差异表达选择靶抗原。

如此，靶向性抗体可以特异性结合任何合适的细胞表面标志物。可以根据要靶向的特定细胞群体选择特定靶向模块和/或细胞表面标志物的选择。细胞表面标志物是本领域已知的(见例如Mufson et al.，Front.Biosci.，11：337-43(2006)；Frankel et al.，Clin.Cancer Res.，6：326-334(2000)；和Kreitman et al.，AAPS Journal，8(3)：E532-E551(2006))，而且可以是例如蛋白质或碳水化合物。在本发明的一个实施方案中，靶向模块(细胞结合剂)是特异性结合细胞表面上的受体的配体。例示性配体包括但不限于血管内皮生长因子(VEGF)，Fas，TNF相关凋亡诱导性配体(TRAIL)，细胞因子(例如IL-2，IL-15，IL-4，IL-13)，淋巴因子，激素，和生长因子(例如转化生长因子(TGFa)，神经元生长因子，表皮生长因子)。

细胞表面标志物可以是例如肿瘤相关抗原。

如本文中使用的，术语“肿瘤相关抗原”或“肿瘤特异性抗原”指唯独或主要由肿瘤细胞和/或癌细胞表达或过表达，使得抗原与肿瘤和/或癌症联合的任何分子(例如蛋白质，肽，脂质，碳水化合物，等)。肿瘤相关抗原可以另外由正常，非肿瘤，或非癌性细胞表达。然而，在此类情况中，正常，非肿瘤，或非癌性细胞的肿瘤相关抗原的表达不如肿瘤或癌细胞的表达强健。在这点上，与正常，非肿瘤，或非癌性细胞的抗原的表达相比，肿瘤或癌细胞可以过表达抗原或以显著更高的水平表达抗原。还有，肿瘤相关抗原可以另外由不同发育或成熟状态的细胞表达。例如，肿瘤相关抗原可以另外由胚胎或胎儿阶段的细胞表达，在正常情况下在成年宿主中找不到这些细胞。或者，肿瘤相关抗原可以另外由干细胞或前体细胞表达，在正常情况下在成年宿主中找不到这些细胞。

肿瘤相关抗原可以是由任何癌症或肿瘤的任何细胞表达的抗原，包括本文中描述的癌症和肿瘤。肿瘤相关抗原可以是仅仅一种类型的癌症或肿瘤的肿瘤相关抗原，使得肿瘤相关抗原与仅仅一种类型的癌症或肿瘤相关或是仅仅一种类型的癌症或肿瘤特征性的。或者，肿瘤相关抗原可以是多于一种类型的癌症或肿瘤的肿瘤相关抗原(例如可以是特征性的)。例如，肿瘤相关抗原可以由乳腺和前列腺癌细胞二者表达且根本不由正常，非肿瘤，或非癌细胞表达。

细胞结合剂可以特异性结合的例示性肿瘤相关抗原包括但不限于粘蛋白1(MUCl；肿瘤相关上皮粘蛋白)，黑素瘤的优先表达抗原(PRAME)，癌胚抗原(CEA)，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，PSCA，EpCAM，Trop2，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体(GM-CSFR)，CD56，人表皮生长因子受体2(HER2/neu)(还称作erbB-2)，CDS，CD7，酪氨酸酶相关蛋白(TRP)I，和TRP2。在一个优选实施方案中，靶向模块(细胞结合剂)特异性结合的细胞表面标志物选自由分化簇(CD)19，CD20，CD21，CD22，CD25，CD30，CD33(唾液酸结合性Ig样凝集素3，髓样细胞表面抗原)，CD79b，CD123(白介素3受体α)，转铁蛋白受体，EGF受体，间皮素，钙粘蛋白，Lewis Y，Glypican-3，FAP(成纤维细胞活化蛋白α)，PSMA(前列腺特异性膜抗原)，CA9＝CAIX(碳酸酐酶IX)，L1 CAM(神经细胞粘附分子L1)，内皮唾液酸蛋白，HER3(表皮生长因子受体家族成员3的活化构象)，Alkl/BMP9复合物(间变性淋巴瘤激酶1/骨形态发生蛋白9)，TPBG＝5T4(滋养细胞糖蛋白)，ROR1(受体酪氨酸激酶样表面抗原)，HER1(表皮生长因子受体的活化构象)，和CLL1(C型凝集素域家族12，成员A)组成的组。间皮素在例如卵巢癌，间皮瘤，非小细胞肺癌，肺腺癌，输卵管癌，头和颈癌，宫颈癌，和胰腺癌中表达。CD22在例如毛细胞白血病，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，前淋巴细胞性白血病(PLL)，非霍奇金氏淋巴瘤，小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)，和急性淋巴性白血病(ALL)中表达。CD25在例如白血病和淋巴瘤，包括毛细胞白血病和霍奇金氏淋巴瘤中表达。Lewis Y抗原在例如膀胱癌，乳腺癌，卵巢癌，结肠直肠癌，食管癌，胃癌，肺癌，和胰腺癌中表达。CD33在例如急性髓样白血病(AML)，慢性骨髓单核细胞性白血病(CML)，和骨髓增殖性病症中表达。

在本发明的一个实施方案中，靶向模块是特异性结合例如肿瘤相关抗原等靶物的抗体(包括抗体片段)。在此类实施方案中，药剂可以称作双特异性或多特异性抗体。

特异性结合肿瘤相关抗原的例示性抗体包括但不限于针对转铁蛋白受体的抗体(例如HB21和其变体)，针对CD22的抗体(例如RFB4和其变体)，针对CD25的抗体(例如抗Tac和其变体)，针对间皮素的抗体(例如SS1，MORAb-009，SS，HN1，HN2，MN，MB，和其变体)和针对Lewis Y抗原的抗体(例如B3和其变体)。在这点上，靶向模块(细胞结合剂)可以是选自由B3，RFB4，SS，SS1，MN，MB，HN1，HN2，HB21，和MORAb-009组成的组的抗体，和其抗原结合部分。适合供本发明嵌合分子中使用的别的例示性靶向模块在例如美国专利No.5,242,824(抗转铁蛋白受体)；5,846,535(抗CD25)；5,889,157(抗Lewis Y)；5,981,726(抗Lewis Y)；5,990,296(抗Lewis Y)；7,081,518(抗间皮素)；7,355,012(抗CD22和抗CD25)；7,368,110(抗间皮素)；7,470,775(抗CD30)；7,521,054(抗CD25)；和7,541,034(抗CD22)；美国专利申请公开文本No.2007/0189962(抗CD22)；Frankel et al.，Clin.Cancer Res.，6：326-334(2000)；和Kreitman et al.，AAPS Journal，8(3)：E532-E551(2006)中公开，通过援引将它们每一项收入本文中。

已经生成抗体来靶向特定肿瘤相关抗原，包括：Cripto，CD30，CD19，CD33，糖蛋白NMB，CanAg，Her2(ErbB2/Neu)，CD56(NCAM)，CD22(Siglec2)，CD33(Siglec3)，CD79，CD138，PSCA，PSMA(前列腺特异性膜抗原)，BCMA，CD20，CD70，E-选择蛋白，EphB2，黑素转铁蛋白，Muc16和TMEFF2。

在本发明的一些实施方案中，可能优选的是，肿瘤相关抗原是癌胚抗原(CEA)。CEA可以具有人CEA的氨基酸序列，特别是癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5)，其是显示于UniProt(www.uniprot.org)登录号P06731(版本119)，或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_004354.2。已经生成抗体来针对CEA，包括T84.66和其人源化和嵌合型式，诸如如WO2016/075278 A1和/或WO2017/055389中描述的T84.66-LCHA，CH1A1a，如WO2011/034660中描述的一种抗CEA抗体，和如下文表2中描述的CEA hMN-14(还见US 6,676,924和US 5,874,540)。

CEA在本发明的语境中是有利的，因为它相对较慢内在化，而且因而高百分比的抗体会在初始治疗之后在细胞的表面上保留可得，用于结合放射性核素。其它低内在化靶物/肿瘤相关抗原也可能是优选的。例如，在一些实施方案中，肿瘤相关抗原可以是CD20或HER2。GenBank登录号：NP_001005862，NP_004439，XP_005257196，和XP_005257197公开Her2蛋白质序列，如由GenBank在2013年10月4日提供的，而且SWissProt数据库条目P11836公开CD20序列。在仍有又一些实施方案中，靶物可以是EGP-1(上皮糖蛋白-1，还称作滋养细胞-2)，结肠特异性抗原p(CSAp)或胰腺粘蛋白MUC1。见例如Goldenberg et al.，2012，Theranostics，2(5)，通过援引将其收入本文中。此参考文献还描述诸如结合CSAp的Mu-9(还见Sharkey et al.，Cancer Res.2003，63：354-63)，结合MUC1的hPAM4(还见Gold etal.，Cancer Res.2008，68：4819-26)，结合至CD20的valtuzumab(还见Sharkey et al.，Cancer Res.2008，68：5282-90)和结合EGP-1的hRS7(还见Cubas et al.，Biochim BiophysActa 2009，1796：309-14)等抗体。任何这些或其抗原结合部分在本发明中可能是有用的，即可以并入本文中描述的抗体。

如上文讨论的，在某些实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两种不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。可以作为全长抗体或抗体片段制备双特异性抗体。

最近已经开发了多种多样的重组抗体型式，例如通过融合例如IgG抗体型式和单链域的四价双特异性抗体(见例如Coloma，M.J.，et al.，Nature Biotech 15(1997)159-163；WO 2001/077342；和Morrison，S.L.，Nature Biotech 25(2007)1233-1234)。

已经开发了还有数种其它新型式，其中不再保留抗体核心结构(IgA，IgD，IgE，IgG或IgM)，诸如双，三或四抗体，微型抗体，数种单链型式(scFv，Bis-scFv)，它们能够结合两种或更多种抗原(Holliger，P.，et al.，Nature Biotech 23(2005)1126-1136；Fischer，N.，Leger，O.，Pathobiology 74(2007)3-14；Shen，J.，et al.，Journal of ImmunologicalMethods 318(2007)65-74；Wu，C.，et al.，Nature Biotech.25(2007)1290-1297)。

所有此类型式使用接头，或是用于融合抗体核心(IgA，IgD，IgE，IgG或IgM)与别的结合蛋白(例如scFv)或是用于融合例如两种/两个Fab片段或scFv(Fischer，N.，Leger，O.，Pathobiology 74(2007)3-14)。必须记住，可能想要通过维持高程度的与天然发生抗体的相似性，保留效应器功能，诸如例如补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)，它们是经由Fc受体结合介导的。

作为工程化多价和多特异性结合蛋白质，在WO 2007/024715中报告了双重可变域免疫球蛋白。在US 6,897,044中报告了一种用于制备生物学活性抗体二聚体的工艺。在US7,129,330中报告了具有经由肽接头彼此连接的至少四个可变域的多价Fv抗体构建物。在US 2005/0079170中报告了二聚体和多聚体抗原结合结构。在US 6,511,663中报告了包含通过连接结构彼此共价结合的三个或四个Fab片段的三或四价单特异性抗原结合蛋白质，这种蛋白质不是天然免疫球蛋白。在WO 2006/020258中报告了四价双特异性抗体，它们能在原核和真核细胞中有效表达，而且在治疗性和诊断性方法中是有用的。在US 2005/0163782中报告了一种自包含两种类型的多肽二聚体的混合物自不是经由至少一个链间二硫化物连接的连接的二聚体分离或优先合成经由至少一个链间二硫化物连接连接的二聚体的方法。在US 5,959,083中报告了双特异性四价受体。在WO 2001/077342中报告了具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体。

在WO 1997/001580中报告了多特异性和多价抗原结合多肽。WO 1992/004053报告了通过合成交联共价连接的典型地自结合相同抗原性决定簇的IgG类的单克隆抗体制备的同缀合物。在WO 1991/06305中报告了对抗原具有高亲合力的寡聚体单克隆抗体，由此分泌典型地IgG类的寡聚体，其中两个或更多个免疫球蛋白单体联合到一起以形成四价或六价IgG分子。在US 6,350,860中报告了绵羊衍生的抗体和工程化抗体构建物，它们可用于治疗其中干扰素γ活性是致病性的疾病。在US 2005/0100543中报告了作为双特异性抗体的多价运载体的可靶向构建物，即可靶向构建物的每一个分子可充当两个或更多个双特异性抗体的运载体。在WO 1995/009917中报告了遗传工程双特异性四价抗体。在WO 2007/109254中报告了由稳定化scFv组成或包含的稳定化结合分子。

还可以以具有相同抗原特异性的一个或多个结合臂中的域交换的不对称形式提供多特异性抗体，即通过交换VH/VL域(见例如WO 2009/080252和WO 2015/150447)，CH1/CL域(见例如WO 2009/080253)或整个Fab臂(见例如WO 2009/080251；WO 2016/016299；还见Schaefer et al.，PNAS，108(2011)1187-1191；和Klein et al.，MAbs 8(2016)1010-20)。在一个方面，多特异性抗体包含交叉Fab片段。术语“交叉Fab片段”或“xFab片段”或“交换Fab片段”指Fab片段，其中或是重和轻链的可变区或是恒定区是交换的。交叉Fab片段包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区1(CH1)构成的多肽链，和由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)构成的多肽链。还可以通过将带电荷或不带电荷的氨基酸突变引入域界面以指导正确Fab配对来改造不对称Fab臂。见例如WO 2016/172485。

任何上文型式可以用于依照本发明的多特异性抗体。

在一种例示性型式中，双特异性抗体是“三聚化体(trimerizer)”，例如如WO214/180754中描述的。这指包含三个融合多肽的三聚体抗原结合分子，每个融合多肽包含至少一个与自人软骨基质蛋白(CMP)衍生的三聚化域融合的抗原结合模块，其中所述三聚化域能够介导三聚体抗原结合分子的稳定联合。抗原结合模块可以是例如Fab分子，交换Fab分子，scFab，Fv分子，scFv，或单域抗体(VHH)。在一些实施方案中，融合蛋白质每一个包含两个(第一和第二)抗原结合模块，例如其中第一抗原结合模块与所述三聚化域的N端氨基酸融合且第二抗原结合模块与所述三聚化域的C端氨基酸融合，均任选经由肽接头。在这种型式中，或是第一或是第二抗原结合模块可以结合Pb-DOTAM螯合物。另一会结合靶抗原，例如肿瘤相关抗原。与C端融合的三个抗原结合分子可以是每一个对相同抗原特异性的；与N端融合的三个抗原结合分子可以每一个是对另一种特异性的。

在其中有用的CMP三聚化域衍生自如下文显示的人软骨蛋白，而且在一个实施方案中包含与下文显示的三聚化域的序列具有至少95％同一性和最优选至少98％同一性的序列。在一个实施方案中，所述三聚化域包含所述三聚化域的序列。

人软骨蛋白质的序列(496aa)

三聚化域的例示性序列(39aa)

另一种例示性型式包含包含第一和第二抗体重链和第一和第二抗体轻链的全长抗体(例如IgG)，其中第一重链和第一轻链组装成形成针对第一抗原的抗原结合位点，且其中第二重链和第二轻链组装成形成针对第二抗原的抗原结合位点。

例如通过使用如下文进一步讨论的节入穴突变和/或其它修饰能帮助异二聚体重链的正确组装。

通过使用crossMab技术能帮助轻链与它们各自重链的正确组装。在这种办法中，或是第一重链和第一轻链或是第二重链和第二轻链能组装成形成交叉Fab片段(而另一组装成形成常规Fab)。如此，在一个实施方案中，第一重链可以包含VL域，替换VH域(例如VL-CH1-铰链-CH2-CH3)且第一轻链可以包含VH域，交换VL域(例如VH-CL)，或者，第一重链可以包含CL域，替换HC1域(例如VH-CL-铰链-CH2-CH3)且第一轻链可以包含CH1域，替换CL域(例如VL-CH1)。在这个实施方案中，第二重链和第二轻链具有常规域结构(例如分别是VH-CH1-铰链-CH2-CH3和VL-CL)。在一个备选实施方案中，第二重链可以包含VL域，替换VH域(例如VL-CH1-铰链-CH2-CH3)且第二轻链可以包含VH域，交换VL域(例如VH-CL)，或者，第二重链可以包含CL域，替换HC1域(例如VH-CL-铰链-CH2-CH3)且第二轻链可以包含CH1域，替换CL域(例如VL-CH1)。在这个实施方案中，第一重链和第一轻链具有常规域结构。

在一些实施方案中，另外/或者通过使用如下文进一步讨论的电荷修饰能帮助轻链与它们各自重链的正确组装。

在图37中作为P1AE1768显示了一种此类抗体。这里，第二重链包含CL域，替换HC1域(例如VH-CL-铰链-CH2-CH3)且第二轻链包含CH1域，替换该CL域(例如VL-CH1)；第一重链和第一轻链具有常规域结构。具有常规结构的Fab包含电荷修饰。如此，在一个实施方案中，本发明的抗体包含分别是SEQ ID NO：59和58的第一和第二重链和分别是SEQ ID NO：57和60的第一和第二轻链。

在上文型式的一些实施方案中，型式可以是二价的。在另一个可能的实施方案中，别的抗原结合模块可以融合于例如第一和/或第二重链以提高针对两种抗原之一或二者的效价。例如，别的针对第一抗原的抗原结合模块可以融合于重链分子中两个之一或二者的N端。抗体可以是对于第一抗原(例如肿瘤相关抗原)多价的，例如二价的，且对于第二抗原(例如DOTAM螯合的Pb)单价的。

别的抗原结合模块可以例如是scFab，例如包含针对第一抗原(例如肿瘤相关抗原)的抗原结合位点的。scFab包含经由多肽接头与VL和CL域连接的VH和CH1域，从而作为单链表达。换言之，scFab包含Fd和轻链之间的多肽接头。

在另一个实施方案中，别的抗原结合模块是Fab或交叉Fab。例如，重链之一的N或C端可以经由多肽接头与由VH域和CH1域组成的第一多肽连接，第一多肽与由VL和CL域组成的第二多肽联合以形成Fab。在另一个实施方案中，重链之一的N或C端可以经由多肽接头与由VL域和CH1域组成的第一多肽连接，第一多肽与由VH和CL域组成的第二多肽联合。在另一个实施方案中，重链之一的N或C端可以经由多肽接头与由VH域和CL域组成的第一多肽连接，第一多肽与由VL和CH1域组成的第二多肽联合。

在这种型式中，可能优选的是，通过与相同轻链联合形成相同抗原特异性的结合臂。如此，针对第一抗原的抗原结合模块/臂可以是交叉Fab，而且针对第二抗原的抗原结合模块/臂可以是常规Fab。或者，针对第一抗原的抗原结合模块/臂可以是常规Fab，而且针对第二抗原的抗原结合模块/臂可以是交叉Fab。

该型式还可以并入如下文进一步讨论的电荷修饰。

在这种型式的一个实施方案中，有提供一种多价抗体，其包含包含第一和第二抗体重链和第一和第二抗体轻链的全长抗体，其中第一重链和第一轻链组装成形成包含针对第一抗原(例如肿瘤特异性抗原，例如CEA)的抗原结合位点的Fab，且其中第二重链和第二轻链组装成形成包含针对第二抗原(例如DOTAM螯合的Pb)的抗原结合位点的交叉Fab(例如，第二重链具有VL域，替换VH域，而且第二轻链具有VH域，替换VL域)；且

其中或是第一或是第二抗体重链经由接头与包含CH1和VH域的多肽融合，且所述第一多肽与包含CL和VL的第二多肽组装，使得第一和第二多肽组装成形成包含针对第一抗原的抗原结合位点的Fab。

融合可以在全长抗体的重链之一，任选第二重链的N端。

任选地，还可以使用电荷修饰。例如，包含针对第一抗原的抗原结合位点的Fab可以包含如下文讨论的电荷修饰性替代。

此类型式的一个例子是图37中显示的P1AE1769。如此，在一个实施方案中，本发明的抗体包含分别是SEQ ID NO：64和63的第一和第二重链和分别是SEQ ID NO：62和61的第一和第二轻链。

另一种例示性型式包含包含针对第一抗原的抗原结合位点的全长抗体，诸如IgG(例如它可以是对于第一抗原二价的)，其与针对第二抗原的抗原结合模块连接。

例如，针对第二抗原的抗原结合模块可以是包含针对第二抗原(例如Pb-DOTAM螯合物)的抗原结合位点的scFab。在一些实施方案中，scFab可以融合至全长抗体的两条重链之一的C端，例如在它的CH3域的C端。例如通过使用如下文进一步讨论的节入穴突变和/或其它修饰可以帮助异二聚体重链的正确组装。在图37中作为P1AE1770例示一种此类抗体。如此，在一个实施方案中，本发明的抗体包含SEQ ID NO：66和67的重链和SEQ ID NO：65的轻链。

另一种例示性型式包含包含针对第一抗原的抗原结合位点的全长抗体(例如，它可以是对于第一抗原二价的)，其中重链之一的N或C端经由多肽接头与第一多肽连接且其中第一多肽与第二多肽联合以形成包含针对第二抗原的结合位点的Fab或交叉Fab。例如，这种型式可以包含：

i)由VH域和CH1域组成的第一多肽，其与由VL和CL域组成的第二多肽联合；或

ii)由VL域和CH1域组成的第一多肽，其与由VH和CL域组成的第二多肽联合；或

iii)由VH域和CL域组成的第一多肽，其与由VL和CH1域组成的第二多肽联合；

使得第一和第二多肽一起形成针对第二抗原的抗原结合位点。

例如通过使用如下文进一步讨论的节入穴突变和/或其它修饰，包括电荷修饰可以帮助异二聚体重链的正确组装。例如，全长抗体的Fab域可以包括电荷修饰。

在一个实施方案中，第一多肽经由多肽接头连接至重链之一的C端，例如在它的CH3域的C端。第一多肽可以包含N端VL域和C端CH1域。如此，具有融合的重链可以自N至C端包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3-接头-VL-CH1。轻链可以包含VH-CL。全长抗体的Fab可以包括电荷修饰性替代。在图37中作为P1AE1767显示一种此类实施方案。如此，在一个实施方案中，本发明的抗体包含SEQ ID NO：63和64的重链和SEQ ID NO：61和62的轻链。

在另一个实施方案中，第一多肽经由多肽接头连接至重链的VH域的N端。第一多肽可以包含N端VL域和C端CH1域。如此，具有融合的重链可以自N至C端包含VL-CH1-接头-VH-CH1-铰链-CH2-CH3。轻链可以包含VH-CL。

在另一种例示性型式中，抗体可以包含特异性结合第一抗原且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成的全长抗体，其中重链每一个的C端与特异性结合第二抗原的抗原结合模块融合。

在一个实施方案中，第一抗原是靶物，例如肿瘤特异性抗原，而且第二抗原是Pb-DOTAM螯合物，但是这些还可以倒转。

在另一种例示性型式中，抗体可以是一种双特异性抗体，其包含：

a)特异性结合第一抗原且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成的全长抗体；

b)由下述各项组成的多肽：

i)抗体重链可变域(VH)；或

ii)抗体重链可变域(VH)和抗体重链恒定域(CH1)；或

iii)抗体重链可变域(VH)和抗体轻链恒定域(CL)；

其中所述多肽以VH域的N端经由肽接头与所述全长抗体的两条重链之一的C端融合；

c)由下述各项组成的多肽：

i)抗体轻链可变域(VL)；或

ii)抗体轻链可变域(VL)和抗体轻链恒定域(CL)；或

iii)抗体轻链可变域(VL)和抗体重链恒定域(CH1)；

其中所述多肽以VL域的N端经由肽接头与所述全长抗体的两条重链之另一的C端融合；且

其中(b)下的肽的抗体重链可变域(VL)和(c)下的肽的抗体轻链可变域一起形成针对第二抗原的抗原结合位点。

在这种型式中，如果第一多肽是如b(i)中列出的，那么第二多肽是如c(i)中列出的；如果第一多肽是如b(ii)中列出的，那么第二多肽是如c(ii)中列出的；而且如果第一多肽是如b(iii)中列出的，那么第二多肽是如c(iii)中列出的。还可以使用电荷修饰性替代，例如在全长抗体的Fab中。

在这种型式中，或是第一或是第二抗原可以是DOTAM螯合的Pb。另一可以是靶物，例如肿瘤相关抗原，例如CEA，CD20或ERBB2。在一些实施方案中，第二抗原是DOTAM螯合的Pb且第一抗原是靶物。

上文描述的抗体可以是三价的。在另一个可能的实施方案中，可以融合别的抗原结合模块以提高针对两种抗原之一或二者的效价。例如，针对第一抗原的别的抗原结合模块可以融合至全长抗体(例如肿瘤相关抗原)的重链任一或二者的羧基末端，例如使得抗体具有针对第一抗原的效价4(其中，它融合至重链二者的羧基末端)和针对第二抗原的效价1。

其中(b)的抗体由VH域组成且(c)的抗体由VL域组成的上文型式的例子是PRIT-213和PRIT214。其中(b)由VH域和CL域组成且(c)由VL域和CH1域组成的上文型式的一个例子是如图37中显示的P1AE1766。如此，在一个实施方案中，本发明的抗体包含分别是SEQ IDNO：51和52的第一和第二重链和SEQ ID NO：50的轻链。

任选地，用于本发明的多特异性抗体的型式可以是如WO2010/115589 A1(RocheGlycart AG)中描述的三价型式，通过援引将其完整收入本文中。

WO2010/115589描述了结构的任选稳定化，由此(b)下的多肽的抗体重链可变区(VH)和(c)下的多肽的抗体轻链可变域(VL)经由链间二硫桥连接和稳定化，例如通过引入下面的位置之间的二硫键：

i)重链可变域位置44与轻链可变域位置100，

ii)重链可变域位置105与轻链可变域位置43，或

iii)重链可变域位置101与轻链可变域位置100(编号方式始终依照Kabat的EU索引)。

WO2010/115589还描述了可以通过例如WO 96/027011；Ridgway，J.B.，et al.，Protein Eng 9(1996)617-621；和Merchant，A.M.，et al.，Nat Biotechnol 16(1998)677-681中以数个实施例详细描述的″节-入-穴″技术改变依照本发明的所述全长抗体的CH3域。

如此，在一些实施方案中，所述三价双特异性抗体进一步特征在于：全长抗体的一条重链的CH3域和全长抗体的另一条重链的CH3域每一个在构成抗体CH3域之间的原始界面的界面处相遇；其中改变所述界面以促进三价双特异性抗体的形成，其中改变特征在于：

a)改变一条重链的CH3域，使得在一条重链的CH3域遇到三价双特异性抗体内的另一条重链的CH3域的原始界面的原始界面内，氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此生成一条重链的CH3域的界面内的隆起，其可放置在另一条重链的CH3域的界面内的空腔中，和

b)改变另一条重链的CH3域，使得在第二CH3域遇到三价双特异性抗体内的第一CH3域的原始界面的原始界面内氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此生成第二CH3域的界面内的空腔，在其内可放置第一CH3域的界面内的隆起。

所述具有更大侧链体积的氨基酸残基可以任选选自由精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)组成的组。所述具有更小侧链体积的氨基酸残基可以任选选自由丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，缬氨酸(V)组成的组。

任选地，在一些实施方案中，进一步改变两个CH3域，其通过引入半胱氨酸(C)作为每一个CH3域的相应位置中的氨基酸，使得能形成两个CH3域之间的二硫桥。

可以在本发明中利用如WO2010/115589 A1中描述的双特异性三价抗体型式的这些和其它细节。

如本文中使用的，术语″全长抗体″表示由两条″全长抗体重链″和两条″全长抗体轻链″组成的抗体。″全长抗体重链″可以是以N端至C端方向由抗体重链可变域(VH)，抗体重链恒定域1(CH1)，抗体铰链区(HR)，抗体重链恒定域2(CH2)，和抗体重链恒定域3(CH3)组成的多肽，缩写为VH-CH1-HR-CH2-CH3；和在亚类IgE的抗体的情况中任选的抗体重链恒定域4(CH4)。优选地，″全长抗体重链″是以N端至C端方向由VH，CH1，HR，CH2和CH3组成的多肽。提及“全长”并不意图排除crossMab形成的可能性-如此，重链可以具有交换VL域的VH域，或交换CL域的CH1域。″全长抗体轻链″可以是以N端至C端方向由抗体轻链可变域(VL)和抗体轻链恒定域(CL)组成的多肽，缩写为VL-CL。或者，在交叉Mab的情况中，VL域可以交换VH域或CL域可以交换CH1域。抗体轻链恒定域(CL)可以是κ(卡帕)或λ(拉姆达)。两条全长抗体链经由CL域和CH1域之间和全长抗体重链的铰链区之间的多肽间二硫键连接到一起。典型的全长抗体的例子是天然抗体，像IgG(例如IgG1和IgG2)，IgM，IgA，IgD，和IgE。依照本发明的全长抗体可以来自单一物种，例如人，或者它们可以是嵌合化或人源化抗体。如本文中描述的全长抗体包含两个抗原结合位点，每一个由一对VH和VL形成。所述全长抗体的重或轻链的C端表示所述重或轻链的C端处的最后一个氨基酸。

b)下的多肽的抗体重链可变域(VH)和c)下的多肽的抗体轻链可变域(VL)的N端表示VH或VL域的N端处的最后一个氨基酸。

在上文描述的任何型式中，第一抗原可以是肿瘤相关抗原且第二抗原可以是Pb-DOTAM，(但是，这些在一些实施方案中也可以倒转)。

在上文描述的任何型式中，通过修饰重链的序列可以帮助重链异二聚体的正确组装。在一个实施方案中，使用节-入-穴技术。可以改变两个CH3域的相互作用表面以提高含有这两个CH3域的两条重链的异二聚化。(两条重链的)两个CH3域每一个可以是″节″，而另一个是″穴″。例如，一个包含所谓的“节突变”(T366W和任选地S354C或Y349C之一，优选S354C)且另一个包含所谓的“穴突变”(T366S，L368A和Y407V和任选地Y349C或S354C，优选Y349C)(见例如Carter，P.et al.，Immunotechnol.2(1996)73)，依照EU索引编号方式。

可以另外/或者使用引入二硫桥来稳定化异二聚体(Merchant，A.M.，et al.，Nature Biotech 16(1998)677-681；和Atwell，S.，et al.，J.Mol.Biol.270(1997)26-35)和提高产率。例子包括引入下面的位置之间的二硫键：

i)重链可变域位置44与轻链可变域位置100，

ii)重链可变域位置105与轻链可变域位置43，或

iii)重链可变域位置101与轻链可变域位置100(编号方式始终依照Kabat的EU索引)。

本发明的多特异性抗体可以包含其中包含的Fab分子中的氨基酸替代，它们在降低轻链与非匹配重链的错配(Bence-Jones型副产物)中特别有效，所述错配可以在具有它们的结合臂中一个(或多个，在包含多于两个抗原结合性Fab分子的分子的情况中)中的VH/VL交换的基于Fab的双/多特异性抗原结合分子的生成中发生(还见PCT公开号WO 2015/150447，特别是其中的实施例，通过援引完整收入本文中)。通过引入Fab分子的CH1和CL域中的特定氨基酸位置处具有相反电荷的带电荷氨基酸(在本文中有时称作“电荷修饰”)，可以改善期望的多特异性抗体与不想要的副产物，特别是它们的结合臂之一中发生的BenceJones型副产物之比。

因此，在一些实施方案中，本发明的包含Fab分子的抗体包含至少一个具有包含如本文中描述的电荷修饰的重链恒定域CH1域和包含如本文中描述的电荷修饰的轻链恒定CL域的Fab。

或是在本发明的抗体(诸如例如图37中显示的：P1AE1766，P1AE1767，P1AE1768，P1AE1769)中包含的常规Fab分子中或是在本发明的抗体中包含的交换Fab分子中(但是并非在二者中)进行电荷修饰。在特定实施方案中，在本发明的抗体中包含的(在特定实施方案中，特异性结合靶细胞抗原的)常规Fab分子中进行电荷修饰。

因而，在一些实施方案中，本发明的抗体包含a)结合第一抗原(例如肿瘤相关抗原)的第一抗原结合模块和b)结合第二抗原(例如Dotam-Pb)的第二结合模块，其中双特异性抗原结合分子的第一和第二抗原结合模块均是Fab分子，且抗原结合模块之一(在一些实施方案中，特别是第二抗原结合模块)是交叉Fab片段，Fab分子之一包含包含如本文中描述的电荷修饰的CH1域，和包含如本文中描述的电荷修饰的CL域。可能优选的是，包含电荷修饰的Fab是常规(非交叉)Fab，例如在一些实施方案中是结合第一抗原的抗原结合模块。

依照本发明的抗体可以进一步包含特异性结合第一抗原的第三Fab分子。在特定实施方案中，所述第三Fab分子与a)下的第一Fab分子相同。在这些实施方案中，可以在第一Fab分子和第三Fab分子每一个的恒定域CL和恒定域CH1中进行依照下面的实施方案的氨基酸替代(电荷修饰)。或者，可以在b)下的第二Fab分子的恒定域CL和恒定域CH1中，而非在第一Fab分子和第三Fab分子的恒定域CL和恒定域CH1中进行依照下面的实施方案的氨基酸替代。

在一些实施方案中，在包含包含电荷修饰的轻链恒定域CL和包含电荷修饰的重链恒定域CH1的Fab分子中，轻链恒定域CL中的电荷修饰在位置124处和任选在位置123处(编号方式依照Kabat)，且重链恒定域CH1中的电荷修饰在位置147和/或213处(编号方式依照Kabat)。

在一些实施方案中，在轻链恒定域CL中位置124处的氨基酸独立用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)(在一个优选实施方案中，独立用赖氨酸(K))替代(编号方式依照Kabat)，且

在重链恒定域CH1中位置147处的氨基酸和/或位置213处的氨基酸独立用谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)替代(编号方式依照Kabat EU索引)。

在另一个实施方案中，在轻链恒定域CL中位置124处的氨基酸独立用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)(在一个优选实施方案中，独立用赖氨酸(K)或精氨酸(R))替代(编号方式依照Kabat)，且在重链恒定域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸独立用谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)替代(编号方式依照Kabat EU索引)。

在又一个实施方案中，在轻链恒定域CL中位置124处的氨基酸独立用赖氨酸(K)或精氨酸(R)(在一个优选实施方案中，独立用赖氨酸(K)或精氨酸(R))替代(编号方式依照Kabat)，且在重链恒定域CH1中位置213处的氨基酸独立用谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)替代(编号方式依照Kabat EU索引)。

在又一个实施方案中，在轻链恒定域CL中位置124处的氨基酸独立用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)(在一个优选实施方案中，独立用赖氨酸(K)或精氨酸(R))替代(编号方式依照Kabat)，且在重链恒定域CH1中位置147处的氨基酸独立用谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)替代(编号方式依照Kabat EU索引)。

在又一个实施方案中，在轻链恒定域中位置124处的氨基酸独立用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)(在一个优选实施方案中，独立用赖氨酸(K)或精氨酸(R))替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸独立用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)(在一个优选实施方案中，独立用赖氨酸(K)或精氨酸(R))替代(编号方式依照Kabat)，且

在重链恒定域CH1中位置147处的氨基酸独立用谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸独立用谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)替代(编号方式依照Kabat EU索引)。

在又一个实施方案中，在轻链恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)，且

在重链恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)。

在又一个实施方案中，在轻链恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)，且

在重链恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)。

在又一个实施方案中，在轻链恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)，且

在重链恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)且位置213处的氨基酸用天冬氨酸(D)替代(编号方式依照Kabat EU索引)。

在又一个实施方案中，在轻链恒定域中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)，且

在重链恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)且位置213处的氨基酸用天冬氨酸(D)替代(编号方式依照Kabat EU索引)。

在一个实施方案中，抗体包含特异性结合第一抗原的第一重链和第一轻链和特异性结合第二抗原的第二重链和第二轻链，其中

a)第一轻链的恒定域CL和第一重链的恒定域CH1包含本文中描述的电荷变体替代；且

b)第二轻链和第二重链的轻链恒定域CL和重链恒定域CH1彼此替换(如此形成交叉Fab)。为P1AE1768显示此类排列的一个例子。

在另一个实施方案中，该抗体包含

特异性结合第一抗原且由两条重链和两条轻链组成的全长抗体，其中全长抗体的两个重链恒定域CH1和两个轻链恒定域CL包含如本文中描述的电荷修饰；和

经由多肽接头与VL和CL域连接的包含VH和CH1域的scFab(VH-CH1-接头-VL-CL)，其中scFab融合至重链之一的N端，且其中scFab形成针对第二抗原的抗原结合位点。此类排列的一个例子是P1AE1770。

在另一个实施方案中，多特异性抗体包含包含针对第一抗原的抗原结合位点的全长抗体(例如，它可以是对第一抗原二价的)，其中全长抗体的两个重链恒定域CH1和两个轻链恒定域CL包含如本文中描述的电荷修饰，且其中重链之一的C端(例如它的CH3域的C端)经由多肽接头与第一多肽连接，且其中第一多肽与第二多肽联合以形成包含针对第二抗原的结合位点的交叉Fab。

第一多肽可以包含N端VL域和C端CH1域。如此，具有融合的重链可以自N至C端包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3-接头-VL-CH1。轻链可以包含VH-CL。此类排列的一个例子是P1AE1767。

在又一个实施方案中，抗体可以是一种双特异性抗体，其包含：

a)特异性结合第一抗原且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成的全长抗体，其中重链的CH1域和轻链的CL域包含如本文中描述的电荷修饰；

b)由下述各项组成的多肽：

i)抗体重链可变域(VH)；或

ii)抗体重链可变域(VH)和抗体重链恒定域(CH1)；或

iii)抗体重链可变域(VH)和抗体轻链恒定域(CL)，

其中所述多肽以VH域的N端经由肽接头与所述全长抗体的两条重链之一的C端融合；

c)由下述各项组成的多肽：

i)抗体轻链可变域(VL)；或

ii)抗体轻链可变域(VL)和抗体轻链恒定域(CL)；或

iii)抗体轻链可变域(VL)和抗体重链恒定域(CH1)，

其中所述多肽以VL域的N端经由肽接头与所述全长抗体的两条重链之另一的C端融合；且

其中(b)下的肽的抗体重链可变域和(c)下的肽的抗体轻链可变域一起形成针对第二抗原的抗原结合位点。此类排列的例子是PRIT-213和p1AE1766。

在一些实施方案中，本发明的抗体包含a)结合第一抗原的第一抗原结合模块，b)结合第二抗原的第二抗原结合模块，和c)结合第一抗原的第三抗原结合模块，其中抗体的第一，第二和第三抗原结合模块均为Fab分子，且在抗原结合模块之一(特别是第二抗原结合模块)中Fab轻链和Fab重链分别的可变域VL和VH是彼此替换的，其中

i)在第一Fab分子和第三Fab分子每一个的恒定域CL和恒定域CH1中，而非在b)下的第二Fab分子的恒定域CL和恒定域CH1中进行依照上文实施方案的氨基酸替代；或

ii)在b)下的第二Fab分子的恒定域CL和恒定域CH1中，而非在第一Fab分子和第三Fab分子的恒定域CL和恒定域CH1中进行依照上文实施方案的氨基酸替代。在一些实施方案中，电荷修饰存在于常规(非交换)Fab中：如此，例如，其中第二抗原结合模块是交叉Fab，选项(i)是优选的。

在一个特定实施方案中，本发明的多价抗体包含包含第一和第二抗体重链和第一和第二抗体轻链的全长抗体，其中第一重链和第一轻链组装成形成包含针对第一抗原(例如肿瘤特异性抗原，例如CEA)的抗原结合位点的Fab，且其中第二重链和第二轻链组装成形成包含针对第二抗原(例如DOTAM螯合的Pb)的抗原结合位点的交叉Fab(例如，第二重链具有VL域，替换VH域，且第二轻链具有VH域，替换VL域)；且

其中或是第一或是第二抗体重链经由接头与包含CH1和VH域的多肽融合，且所述第一多肽与包含CL和VL的第二多肽组装，使得第一和第二多肽组装成形成包含针对第一抗原的抗原结合位点的Fab，

其中第一重链的CH1域和第一轻链的CL域包含如本文中描述的电荷修饰。

第一多肽的CH1域和第二多肽的CL域还可以包含如本文中描述的电荷修饰。

融合可以在全长抗体的重链之一，任选第二重链的N端。此类排列的一个例子是P1AE1769。

在一些实施方案中，可能优选的是，本发明的抗体是多特异性抗体，例如结合Pb-DOTAM和CEA二者的双特异性抗体。如此，它们包含针对Pb-DOTAM螯合物的抗原结合位点和针对CEA的抗原结合位点。在此类实施方案中，对Pb-DOTAM螯合物特异性的抗原结合位点可以依照本文中描述的任何实施方案。型式可以是本文中描述的任何型式。

任选地，结合CEA的抗原结合位点可以以对于单价结合的1nM或更小，500pM或更小，200pM或更小，或100pM或更小的Kd值结合。

任选地，结合CEA的抗原结合位点可以包含至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种选自下述的CDR：(a)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)包含SEQID NO：16的氨基酸序列的CDR-L3。

任选地，结合CEA的抗原结合位点可以包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR-H3。在一个实施方案中，抗体包含包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR-H3。在另一个实施方案中，抗体包含包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR-H3和包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDR-L3。在又一个实施方案中，抗体包含包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR-H3，包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDR-L3，和包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDR-H2。在又一个实施方案中，抗体包含(a)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR-H3。

任选地，结合CEA的抗原结合位点包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDR-L3。在一个实施方案中，抗体包含(a)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDR-L1，(b)包含SEQ ID NO∶15的氨基酸序列的CDR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDR-L3。

任选地，结合CEA的抗原结合位点包含(a)VH域，该VH域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH CDR序列：(i)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR-H3，和(b)VL域，该VL域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL CDR序列：(i)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR-L2，和(c)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDR-L3。

在另一个方面，结合CEA的抗原结合位点包含(a)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDR-L3。

在任何上文实施方案中，多特异性抗体可以是人源化的。在一个实施方案中，抗CEA抗原结合位点包含如任何上文实施方案中的CDR，且进一步包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。

在另一个实施方案中，结合CEA的抗原结合位点包含与SEQ ID NO：17的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的抗原结合位点保留结合CEA的能力，优选以如上文列出的亲和力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO：17中替代，插入和/或删除总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，替代，插入，或删除发生在HVR以外的区域中(即在FR中)。任选地，结合CEA的抗原结合位点包含SEQ ID NO：17中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，VH包含一种，两种或三种选自下述的CDR：(a)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR-H1，(b)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR-H3。

在另一个实施方案中，结合CEA的抗原结合位点包含与SEQ ID NO：18的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的抗原结合位点保留结合CEA的能力，优选以上文列出的亲和力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO：18中替代，插入和/或删除总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，替代，插入，或删除发生在HVR以外的区域中(即在FR中)。任选地，针对CEA的抗原结合位点包含SEQ ID NO：18中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，VL包含一种，两种或三种选自下述的CDR：(a)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDR-L3。

在另一个实施方案中，结合CEA的抗原结合位点包含如上文提供的任何实施方案中的VH和如上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，抗体包含分别在SEQ IDNO：17和SEQ ID NO：18中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。

在一些实施方案中，多特异性抗体可以与本文中提供的PRIT-0213或PRIT-0214抗体结合相同CEA表位。

在一些实施方案中，可能优选的是，本发明的抗体是多特异性抗体，例如结合Pb-DOTAM和ERBB2二者的双特异性抗体。如此，它们包含针对Pb-DOTAM螯合物的抗原结合位点和针对ERBB2的抗原结合位点。在此类实施方案中，对Pb-DOTAM螯合物特异性的抗原结合位点可以依照本文中描述的任何实施方案。型式可以是本文中描述的任何型式。

任选地，结合ERBB2的抗原结合位点可以以对于单价结合的1nM或更小，500pM或更小，200pM或更小，或100pM或更小的Kd值结合。

任选地，结合ERBB2的抗原结合位点可以包含至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种选自下述的CDR：(a)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ IDNO：31的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-L3。

任选地，结合ERBB2的抗原结合位点可以包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3。在一个实施方案中，抗体包含包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3。在另一个实施方案中，抗体包含包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-L3。在又一个实施方案中，抗体包含包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3，包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-L3，和包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2。在又一个实施方案中，抗体包含(a)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3。

任选地，结合ERBB2的抗原结合位点包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-L3。在一个实施方案中，抗体包含(a)包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-L1，(b)包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-L3。

任选地，结合ERBB2的抗原结合位点包含(a)VH域，该VH域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH CDR序列：(i)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；和(b)VL域，该VL域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL CDR序列：(i)包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-L2，和(c)包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-L3。

在另一个方面，结合ERBB2的抗原结合位点包含(a)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-L3。

在任何上文实施方案中，多特异性抗体可以是人源化的。在一个实施方案中，抗ERBB2抗原结合位点包含如任何上文实施方案中的CDR，且进一步包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。

在另一个实施方案中，结合ERBB2的抗原结合位点包含与SEQ ID NO：34的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的抗原结合位点保留结合ERBB2的能力，优选以如上文列出的亲和力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO：34中替代，插入和/或删除总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，替代，插入，或删除发生在HVR以外的区域中(即在FR中)。任选地，结合ERBB2的抗原结合位点包含SEQ ID NO：34中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，VH包含一种，两种或三种选自下述的CDR：(a)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1，(b)包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3。

在另一个实施方案中，结合ERBB2的抗原结合位点包含与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的抗原结合位点保留结合ERBB2的的能力，优选以上文列出的亲和力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO：35中替代，插入和/或删除总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，替代，插入，或删除发生在HVR以外的区域中(即在FR中)。任选地，针对CEA的抗原结合位点包含SEQ ID NO：35中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，VL包含一种，两种或三种选自下述的CDR：(a)包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-L3。

在另一个实施方案中，结合ERBB2的抗原结合位点包含如上文提供的任何实施方案中的VH和如上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，抗体包含分别在SEQID NO：34和SEQ ID NO：35中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。

在一些实施方案中，多特异性抗体可以与本文中提供的P1AD9827抗体结合相同ERBB2表位。

在一些实施方案中，可能优选的是，该本发明的抗体是多特异性抗体，例如结合Pb-DOTAM和CD20二者的双特异性抗体。如此，它们包含针对Pb-DOTAM螯合物的抗原结合位点和针对CD20的抗原结合位点。在此类实施方案中，对Pb-DOTAM螯合物特异性的抗原结合位点可以依照本文中描述的任何实施方案。型式可以是本文中描述的任何型式。

任选地，结合CD20的抗原结合位点可以以对于单价结合的1nM或更小，500pM或更小，200pM或更小，或100pM或更小的Kd值结合。

任选地，结合CD20的抗原结合位点可以包含至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种选自下述的CDR：(a)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ IDNO：42的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L3。

任选地，结合CD20的抗原结合位点可以包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的CDR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的CDR-H3。在一个实施方案中，抗体包含包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的CDR-H3。在另一个实施方案中，抗体包含包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的CDR-H3和包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L3。在又一个实施方案中，抗体包含包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的CDR-H3，包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L3，和包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的CDR-H2。在又一个实施方案中，抗体包含(a)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的CDR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的CDR-H3。

任选地，结合CD20的抗原结合位点包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的CDR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L3。在一个实施方案中，抗体包含(a)包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的CDR-L1，(b)包含SEQ ID NO∶43的氨基酸序列的CDR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L3。

任选地，结合CD20的抗原结合位点包含(a)VH域，该VH域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH CDR序列：(i)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的CDR-H3；和(b)VL域，该VL域包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL CDR序列：(i)包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的CDR-L2，和(c)包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L3。

在另一个方面，结合CD20的抗原结合位点包含(a)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L3。

在任何上文实施方案中，多特异性抗体可以是人源化的。在一个实施方案中，抗CD20抗原结合位点包含如任何上文实施方案中的CDR，且进一步包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。

在另一个实施方案中，结合CD20的抗原结合位点包含与SEQ ID NO：45的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的抗原结合位点保留结合CD20的能力，优选以如上文列出的亲和力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO：45中替代，插入和/或删除总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，替代，插入，或删除发生在HVR以外的区域中(即在FR中)。任选地，结合CD20的抗原结合位点包含SEQ ID NO：45中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，VH包含一种，两种或三种选自下述的CDR：(a)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的CDR-H1，(b)包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的CDR-H3。

在另一个实施方案中，结合CD20的抗原结合位点包含与SEQ ID NO：46的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的抗原结合位点保留结合CD20的能力，优选以上文列出的亲和力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO：46中替代，插入和/或删除总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，替代，插入，或删除发生在HVR以外的区域中(即在FR中)。任选地，针对CD20的抗原结合位点包含SEQ ID NO：46中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，VL包含一种，两种或三种选自下述的CDR：(a)包含SEQ ID NO：42的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的CDR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L3。

在另一个实施方案中，结合CD20的抗原结合位点包含如上文提供的任何实施方案中的VH和如上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，抗体包含分别在SEQ IDNO：45和SEQ ID NO：46中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。

在一些实施方案中，多特异性抗体可以与本文中提供的P1AD9826抗体结合相同CD20表位。

在某些实施方案中，涵盖本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可以期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将合适的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除，和/或插入和/或替代。可以进行删除，插入，和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如，抗原结合。

在某些实施方案中，提供了具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。替代诱变感兴趣的位点包括HVR(CDR)和FR。保守替代在表1中在“优选的替代”的标题下显示。更实质的变化在表1中在“例示性替代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。

表1

依照共同的侧链特性，氨基酸可以如下分组：

(1)疏水性的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；

(2)中性，亲水性的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；

(3)酸性的：Asp，Glu；

(4)碱性的：His，Lys，Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；

(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。

非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一类别的。

一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力，降低的免疫原性)和/或会实质性保留亲本抗体的某些生物学特性。例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。

可以对HVR做出变化(例如，替代)，例如以改善抗体亲和力。可以对HVR“热点”，即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基(见例如Chowdhury，Methods Mol.Biol.207：179-196(2008))，和/或接触抗原的残基做出此类变化，其中对所得的变体VH或VL测试结合亲和力。通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟已经记载于例如Hoogenboom et al.，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O’Brien etal.ed.，Human Press，Totowa，NJ，(2001))。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR，链改组，或寡核苷酸指导的诱变)任一将多样性引入为成熟选择的可变基因。然后，创建次级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法牵涉HVR指导的方法，其中将几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定牵涉抗原结合的HVR残基。特别地，经常靶向CDR-H3和CDR-L3。

在某些实施方案中，可以在一个或多个HVR内发生替代，插入，或删除，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以对HVR做出保守变化(例如，保守替代，如本文中提供的)，其不实质性降低结合亲和力。例如，此类变化可以在HVR中的抗原接触残基以外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR或是未改变的，或是含有不超过1，2或3处氨基酸替代。

一种可用于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham and Wells，Science，244：1081-1085(1989)所描述的。在此方法中，将残基或靶残基的组(例如，带电荷的残基诸如Arg，Asp，His，Lys，和Glu)鉴定，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外，利用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原间的接触点。作为替代的候选，可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。

氨基酸序列插入包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合，及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N或C端与酶(例如对于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。

在某些实施方案中，改变本文中提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列，使得创建或消除一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体的糖基化位点的添加或删除。

在抗体包含Fc区的情况中，可以改变其附着的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体通常包含分支的，双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2域的Asn297。见例如Wright et al.，TIBTECH 15：26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖，N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，半乳糖，和唾液酸，以及附着于双触角寡糖结构“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善的特性的抗体变体。

在一个实施方案中，提供了抗体变体，其具有缺乏(直接或间接)附着于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中的岩藻糖量可以是1％至80％，1％至65％，5％至65％或20％至40％。通过相对于附着于Asn297的所有糖结构(例如，复合的，杂合的和高甘露糖的结构)的总和，计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量，如通过MALDI-TOF质谱术测量的，例如如记载于WO 2008/077546的。Asn297指位于Fc区中的约第297位(Fc区残基的Eu编号方式)的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即在第294位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。见例如美国专利公开文本No.US 2003/0157108(Presta，L.)和US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.Ltd)。涉及“脱岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体的出版物的例子包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki et al.，J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；及Yamane-Ohnuki et al.，Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能够生成脱岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka etal.，Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美国专利申请No US 2003/0157108 A1，Presta，L.；及WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其在实施例11)，和敲除细胞系，诸如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(见例如Yamane-Ohnuki et al.，Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda，Y.et al.，Biotechnol.Bioeng.，94(4)：680-688(2006)；及WO 2003/085107)。

进一步提供了具有两分型寡糖的抗体变体，例如其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类抗体变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利No.6,602,684(Umana等人)；及US 2005/0123546(Umana等人)。还提供了在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载于例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju，S.)；及WO 1999/22764(Raju，S.)。

可能优选的是，修饰抗体以降低糖基化的程度。在一些实施方案中，抗体可以是无糖基化或去糖基化的。抗体可以包括N297处的替代，例如N297D/A。

在某些实施方案中，可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中，由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如，人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4 Fc区)。

在某些实施方案中，本发明涵盖具有降低的效应器功能，例如降低的或消除的CDC，ADCC和/或FcγR结合的抗体变体。在某些方面，本发明涵盖拥有一些但不是所有效应器功能的抗体变体，所述效应器功能使其成为如下应用的期望候选物，其中抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应器功能(诸如补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC))是不必要的或有害的。

可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性)。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。在Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)的第464页上的表3中汇总了造血细胞上的FcR表达。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子记载于美国专利No.5,500,362(见例如Hellstrom，I.et al.，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA83：7059-7063(1986))和Hellstrom，I et al.，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；5，821，337；Bruggemann，M.et al.，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))。或者，可以采用非放射性测定方法(见例如用于流式细胞术的ACTI

具有降低的效应器功能的抗体包括那些具有Fc区残基238，265，269，270，297，327和329中的一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)，例如P329G。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265，269，270，297和327中的两处或更多处具有替代的Fc突变体，包括残基265和297替代成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。

在某些方面，抗体变体包含具有一处或多处降低FcγR结合的氨基酸替代的Fc区，例如Fc区的位置234和235处的替代(EU残基编号方式)。在一个方面，替代是L234A和L235A(LALA)。在某些方面，抗体变体进一步包含自人IgG1 Fc区衍生的Fc区中的D265A和/或P329G。在一个方面，替代是自人IgGl Fc区衍生的Fc区中的L234A，L235A和P329G(LALA-PG)(见例如WO 2012/130831)。在另一个方面，替代是自人IgG1 Fc区衍生的Fc区中的L234A，L235A和D265A(LALA-DA)。

在其它实施方案中，可能的是有可能使用具有降低的效应器功能的IgG亚型，诸如IgG4或IgG2。

描述了具有改善的或降低的对FcR的结合的某些抗体变体(见例如美国专利No.6,737,056；WO 2004/056312，及Shields et al.，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。

在一些实施方案中，对Fc区做出改变，其导致改变的(即改善的或降低的，优选降低的)Clq结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如记载于美国专利No.6,194,551，WO99/51642，及Idusogie et al.，J.Immunol.164：4178-4184(2000)的。

在一些实施方案中，FcRn结合可以是降低的，例如为了更短的半衰期。在其它实施方案中，FcRn结合可以是正常的。例如，在一些实施方案中，可以在牵涉清除剂的方法中使用正常FcRn结合。

在某些方面，抗体变体包含具有一处或多处降低FcRn结合的氨基酸替代的Fc区，例如Fc区的位置253，和/或310，和/或435处的替代(EU残基编号方式)。在某些方面，抗体变体包含具有位置253，310和435处的氨基酸替代的Fc区。在一个方面，替代是自人IgG1 Fc区衍生的Fc区中的I253A，H310A和H435A。见例如Grevys，A.et al.，J.Immunol.194(2015)5497-5508。

在某些方面，抗体变体包含具有一处或多处降低FcRn结合的氨基酸替代的Fc区，例如Fc区的位置310，和/或433，和/或436处的替代(EU残基编号方式)。在某些方面，抗体变体包含具有位置310，433和436处的氨基酸替代的Fc区。在一个方面，替代是自人IgG1 Fc区衍生的Fc区中的H310A，H433A和Y436A(见例如WO 2014/177460 A1)。例如，在一些实施方案中，可以使用正常FcRn结合。

还可见Duncan and Winter，Nature 322：738-40(1988)；美国专利No.5,648,260；美国专利No.5,624,821；及WO 94/29351，其关注Fc区变体的其它例子。

如本文中报告的抗体的重链的C端可以是完整的C端，以氨基酸残基PGK结束。重链的C端可以是缩短的C端，其中已经去除一个或两个C端氨基酸残基。在一个优选的方面，重链的C端是以PG结束的缩短的C端。

在如本文中报告的所有方面的一个方面，包含包括如本文中规定的C端CH3域的重链的抗体包含C端甘氨酸残基(G446，氨基酸位置的EU索引编号方式)。这仍然是如本文中使用的术语“全长抗体”或“全长重链”明确涵盖的。

在某些实施方案中，可以进一步修饰本文中提供的抗体以含有本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，右旋糖苷，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1，3-二氧戊环，聚-1，3，6-三噁烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)，和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚物，环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)，聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体要改进的具体特性或功能，抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。

在另一个实施方案中，提供了抗体和可以通过暴露于辐射选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，并且包括但不限于对普通细胞没有损害，但是将非蛋白质性质模块加热至抗体-非蛋白质性质模块附近的细胞被杀死的温度的波长。

可以使用重组方法和组合物来生成抗体，例如如记载于美国专利No.4,816,567的。在一个实施方案中，提供了编码本文中描述的抗体的分离的核酸。此类核酸可以编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含VH的氨基酸序列(例如抗体的轻和/或重链)。在又一个实施方案中，提供了包含此类核酸的一种或多种载体(例如表达载体)。在又一个实施方案中，提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如已经用下述各项转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体VL的氨基酸序列和包含抗体VH的氨基酸序列，或(2)第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码包含抗体VL的氨基酸序列的核酸，所述第二载体包含编码包含抗体VH的氨基酸序列的核酸。

在多特异性抗体的情况中，可以提供编码特定抗体型式的重和轻链成分中每一个的核酸。还提供了包含此类核酸的一种或一套载体。

在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0，NS0，Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了生成依照本发明的抗体的方法，其中该方法包括在适合于表达抗体的条件下培养包含编码抗体的核酸的宿主细胞，如上文提供的，并且任选地，自宿主细胞(或宿主细胞培养液)回收抗体。

对于抗体的重组生成，将编码抗体的核酸(例如如上文所描述的)分离，并插入一种或多种载体中，以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸可以使用常规规程(例如通过使用能够特异性结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。

适合于克隆或表达抗体编码载体的宿主细胞包括本文中所描述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中生成抗体，特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，见例如美国专利No.5,648,237，5,789,199和5,840,523(还可见Charlton，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，第245-254页，其描述了抗体片段在大肠杆菌(E.coli.)中的表达)。表达后，可以将抗体在可溶性级分中自细菌细胞团糊分离，并可以进一步纯化。

在原核生物外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是适合于抗体编码载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化样式的抗体的真菌和酵母菌株。见Gerngross，Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)和Li et al.，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。

适合于表达糖基化抗体的宿主细胞也自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞一起使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。

也可以利用植物细胞培养物作为宿主。见例如美国专利No.5,959,177，6,040,498，6,420,548，7,125,978和6,417,429(其描述了用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIES

也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如记载于例如Graham et al.，J.Gen Virol.36：59-74(1977)的)；幼年仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如记载于例如Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980)的)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如记载于例如Matheret al.，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)的；MRC 5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如Y0，NS0和Sp2/0。关于适合于抗体生成的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，见例如Yazaki and Wu，Methods inMolecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编)，Humana Press，Totowa，NJ，第255-268页(2003)。

可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的抗体鉴定，筛选，或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。

一方面，对本发明的抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如ELISA，Western印迹等来进行。

另一方面，可使用竞争测定法来鉴定与例如PRIT-0213或PRIT-0214竞争对Pb-DOTAM或CEA的结合的抗体。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合与PRIT-0213或PRIT-0214所结合表位相同的表位(例如线性或构象表位)。用于定位抗体所结合表位的详细例示性方法见Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”，Methods in Molecular Biologyvol.66(Humana Press，Totowa，NJ)。

在一种例示性竞争测定法中，在包含第一经标记抗体(其结合抗原)(例如PRIT-0213和PRIT-0214)和第二未标记抗体(其要测试与第一抗体竞争对抗原的结合的能力)的溶液中温育固定化抗原。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在包含第一经标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中温育固定化抗原。在允许第一抗体结合抗原的条件下温育后，除去过量的未结合抗体，并测量与固定化抗原联合的标记物的量。如果测试样品中与固定化抗原联合的标记物的量与对照样品相比实质性降低，那么这指示第二抗体与第一抗体竞争对抗原的结合。参见Harlow and Lane(1988)Antibodies：A LaboratoryManual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)。

在某些实施方案中，本文中提供的抗体具有1nM或更小，500pM或更小，200pM或更小，100pM或更小，50pM或更小，20pM或更小，10pM或更小，5pM或更小或1pM或更小的解离常数(Kd)，或如本文中另外所述。

在一个实施方案中，Kd是通过放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的。在一个实施方案中，用Fab型式的感兴趣抗体及其抗原实施RIA。例如，通过在存在未标记抗原的滴定系列的情况中用最小浓度的(

依照另一个实施方案，Kd是使用

在另一个实施方案中，Kd是使用SET(溶液平衡滴定)测定法测量的。依照这种测定法，典型地以恒定浓度应用测试抗体并与测试抗原的系列稀释液混合。在温育以建立平衡之后，在抗原包被表面上捕捉游离抗体部分并用带标记物/标签的抗物种抗体检测，一般使用电化学发光(例如如Haenel et al.，Analytical Biochemistry 339(2005)182-184中描述的)。

例如，在一个实施方案中，将384孔链霉亲合素板(Nunc，Microcoat#11974998001)与25μl/孔以20ng/ml的浓度PBS缓冲液中的抗原-生物素-Isomer混合物于4℃温育过夜。为了用游离抗原平衡抗体样品：始于2500nM，500nM或100nM抗原的浓度以1∶3，1∶2或1∶1.7稀释步骤用相关抗原滴定0.01nM-1nM抗体。将样品在密封的REMP贮存聚丙烯微孔板(Brooks)中于4℃温育过夜。在过夜温育之后，将链霉亲合素板用90μl PBST每孔清洗3次。将来自平衡板的15μl每一份样品转移至测定板并于室温温育15分钟，继以3个90μl PBST缓冲液清洗步骤。进行检测，其通过添加25μl山羊抗人IgG抗体-POD缀合物(Jackson，109-036-088，1：4000，在OSEP中)，继以6个90μl PBST缓冲液清洗步骤。将25μl TMB底物(RocheDiagnostics GmbH，目录号：11835033001)添加至每一个孔。在Satire2读数仪(Tecan)上于370/492nm进行测量。

在另一个实施方案中，Kd是使用KinExA(动力学排斥)测定法测量的。依照这种测定法，典型地将抗原滴定入恒定浓度的抗体结合位点，容许样品平衡，然后快速流过流动室，其中在抗原包被的珠上捕捉游离抗体结合位点，同时洗掉抗原饱和的抗体复合物。然后用带标记物的抗物种抗体(例如荧光标记的)检测珠捕捉的抗体(Bee et al.，PloS One，2012；7(4)：e36261)。例如，在一个实施方案中，使用PBS pH 7.4作为运行缓冲液，于室温(RT)实施KinExA实验。在补充有1mg/ml BSA的运行缓冲液(“样品缓冲液”)中制备样品。使用0.25ml/min的流速。通过始于100pM的两倍系列稀释液(浓度范围0.049pM-100pM)用抗原滴定具有5pM结合位点浓度的恒定量的抗体。一份没有抗原的抗体样品充当100％信号(即没有抑制)。将抗原-抗体复合物于室温温育至少24小时以容许达到平衡。然后以5ml的体积使平衡的混合物流过KinExA系统中抗原偶联的珠的柱，允许珠捕捉未结合的抗体，而不会扰动溶液的平衡状态。使用250ng/ml样品缓冲液中的Dylight

如上文讨论的，依照本发明的多特异性抗体适合于其中期望将放射性核素投递至靶物的任何治疗。因而，本发明提供一种靶向性抗体，诸如如本文中描述的多特异性或双特异性抗体，供治疗方法中使用。更加特别地，提供有一种如本文中描述的靶向性抗体(例如多特异性或双特异性抗体)，供预靶向的放射性免疫疗法的方法中使用。在此类实施方案中，螯合的Pb优选是

如上文指出的，治疗可以是通过靶向患者的患病细胞的细胞毒性活性可治疗的任何状况的。治疗优选是肿瘤或癌症的。然而，本发明的应用不限于肿瘤和癌症。例如，治疗还可以是病毒感染，或另一种致病性生物体，例如原核生物的感染的。任选地，靶向还可以针对T细胞，用于治疗T细胞驱动的自身免疫病或T细胞血癌。如此，要治疗的状况可以包括病毒感染，诸如HIV，狂犬病，EBV和卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒，和自身免疫病，诸如多发性硬化和移植物抗宿主病药物。

如本文中使用的术语“癌症”包括实体和血液学癌症二者，诸如淋巴瘤，淋巴细胞性白血病，肺癌，非小细胞肺(NSCL)癌，支气管肺泡细胞肺癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头或颈癌，皮肤或眼内黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛门区癌，胃癌，胃的癌，结肠癌，乳腺癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，阴门癌，霍奇金氏病，食管癌，小肠癌，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，前列腺癌，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾细胞癌，肾盂癌，间皮瘤，肝细胞癌，胆囊癌，中枢神经系统(CNS)新生物，脊柱轴肿瘤，脑干胶质瘤，多形性成胶质细胞瘤，星形细胞瘤，施旺细胞瘤，室管膜瘤，髓母细胞瘤，脑脊膜瘤，鳞状细胞癌，垂体腺瘤和尤因氏肉瘤，包括任何上述癌症的顽固形式，或一种或多种上述癌症的组合。

一种将放射性同位素靶向组织或器官进行疗法的方法可以包括：

i)对受试者施用如本文中描述的多特异性或双特异性抗体，其中抗体与靶抗原结合并定位于表达靶抗原的细胞的表面；并

ii)随后将与DOTAM或其功能性变体螯合的Pb放射性核素施用于个体，其中与DOTAM或其功能性变体螯合的Pb放射性核素结合定位于细胞表面的抗体。

任选地，在步骤(i)和(ii)之间施用清除/封闭剂。清除/封闭剂可以结合Pb-DOTAM特异性的抗原结合位点并封闭随后螯合的放射性核素的结合。清除剂可以包含与金属离子螯合且与清除模块缀合的DOTAM或其功能性变体。

合适的清除模块的例子可以包括提高分子的尺寸和/或流体动力学半径，阻碍分子进入肿瘤的能力，而不干扰分子结合循环中的抗体的能力的模块。例示性模块包括亲水性聚合物。模块可以是聚合物或共聚物，例如右旋糖酐，糊精，PEG，聚唾液酸(PSA)，透明质酸，羟乙基淀粉(HES)或聚(2-乙基2-噁唑啉)(PEOZ)的。在其它实施方案中，模块可以是非结构化肽或蛋白质，诸如XTEN多肽(无结构的亲水性蛋白质聚合物)，高氨基酸聚合物(HAP)，脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物(PAS)，弹性蛋白样肽(ELP)，或明胶样蛋白(GLK)。聚合物的合适分子量可以在例如至少50kDa，例如50kDa至2000kDa的范围中。例如，分子量可以是200-800kDa，任选大于300，350，400或450kDa，且任选小于700，650，600或550kDa，任选约500kDa。

在一些实施方案中，清除剂可以是与右旋糖酐或其衍生物缀合的DOTAM或其功能性变体(与金属离子螯合的)，例如如下文进一步描述的。

在一些实施方案中，抗体对清除剂的重量比可以在自1∶1，2∶1，3∶1或4∶1多至20∶1，15∶1，10∶1，8∶1，6∶1或5∶1的范围中，例如在1∶1至20∶1，1∶1至10∶1，2∶1至8∶1或2∶1至6∶1的范围中。

在一些实施方案中，可以在用多特异性抗体治疗之后数小时或数天施用清除剂。在一些实施方案中，可能优选的是，在多特异性抗体之后至少2，4，6，8，10，12，16，18，22或24小时，或至少1，2，3，4，5，6或7天施用清除剂。在一些实施方案中，可能优选的是，在抗体之后不多于14天，例如不多于10，9，8，7，6，5，4，3或2天施用清除剂。

任选地，在多特异性抗体之后4和10天，4和7天，2和7天，或2至4天之间的时段中施用清除剂。

在一些实施方案中，在清除剂之后数分钟，数小时或数天施用Pb放射性核素。在一些实施方案中，可能优选的是，在清除剂之后至少30分钟，且任选在施用清除剂48小时，24小时，8小时或4小时内施用Pb放射性核素。在一些实施方案中，可以在施用清除剂之后施用Pb放射性核素。

在一些实施方案中，可以作为组合疗法的一部分施用本文中描述的抗体。例如，可以与一种或多种化疗剂组合施用它们：可以同时或顺序(以任一次序)施用化疗剂和抗体。

在一些实施方案中，另外/或者，可以与放射性敏化剂组合施用本文中描述的抗体。可以同时或顺序(以任一次序)施用放射性敏化剂和抗体。

通过混合具有期望纯度的此类抗体与一种或多种任选的药学可接受载剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.编(1980))以冻干配制剂或水性溶液形式制备如本文中所描述的抗Pb-DOTAM抗体，例如多特异性或双特异性抗体的药学配制剂。一般地，药学可接受载剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括但不限于缓冲剂，诸如磷酸盐，柠檬酸盐，和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵，苯索氯铵；酚，丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的例示性的药学可接受载剂进一步包含间质药物分散剂诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(

例示性的冻干抗体配制剂记载于美国专利No.6，267，958。水性抗体配制剂包括那些记载于美国专利No.6,171,586和WO2006/044908的，后一种配制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。

本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性组分，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的组分。例如，可能想要进一步提供如上文讨论的化疗剂和/或放射性敏化剂。此类活性组分适于以有效用于所需目的的量而组合存在。

活性组分可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，在胶状药物投递系统中(例如脂质体，清蛋白微球体，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)，或在粗滴乳状液中。此类技术披露于Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编(1980)。

可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形商品形式，例如膜，或微胶囊。

用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可容易地实现，例如通过穿过无菌滤膜过滤。

本发明进一步提供靶抗体，例如如本文中描述的多特异性抗体，供对受试者进行的诊断方法中使用。诊断方法可以是预靶向的放射性免疫成像的方法，例如为了诊断怀疑具有增殖性病症或感染性疾病的受试者的目的。在此类实施方案中，螯合的Pb优选是

一种将放射性同位素靶向至组织或器官进行成像的方法可以包括：

i)对受试者施用如本文中描述的多特异性或双特异性抗体，其中该抗体结合靶抗原并定位于表达靶抗原的细胞的表面；并

ii)随后将与DOTAM或其功能性变体螯合的Pb放射性核素施用于个体，其中与所述DOTAM或其功能性变体螯合的Pb放射性核素结合定位于细胞的表面处的抗体。

在另一个实施方案中，如本文中描述的多特异性或双特异性抗体可以在施用时与螯合的Pb放射性核素结合。

任选地，该方法可以进一步包括：

iii)对与DOTAM或其功能性变体螯合的Pb放射性核素已经或预期定位其中的组织或器官成像。

在另一个实施方案中，本发明的方法可以包括对受试者的组织或器官成像，其中该受试者先前已经施用：

i)如本文中描述的多特异性或双特异性抗体，其中该抗体结合靶抗原并定位于表达靶抗原的细胞的表面；并

ii)与DOTAM或其功能性变体螯合的Pb放射性核素，其中与所述DOTAM或其功能性变体螯合的Pb放射性核素结合定位于细胞的表面的抗体。

任选地，在步骤(i)和(ii)之间施用清除/封闭剂。清除剂，清除剂的施用方案和抗体对清除剂的重量比可以是如上文描述的。

靶抗原可以是如本文中讨论的任何靶抗原。在一些实施方案中，靶抗原可以是如上文讨论的肿瘤特异性抗原，而且成像可以是对一个或多个肿瘤成像的方法。个体可以已知或怀疑具有肿瘤。

例如，该方法可以是对具有或怀疑具有下述的个体中的肿瘤成像的方法：肺癌，非小细胞肺(NSCL)癌，支气管肺泡细胞肺癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头或颈癌，皮肤或眼内黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛门区癌，胃癌，胃的癌，结肠癌，乳腺癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，阴门癌，霍奇金氏病，食管癌，小肠癌，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，前列腺癌，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾细胞癌，肾盂癌，间皮瘤，肝细胞癌，胆囊癌，中枢神经系统(CNS)新生物，脊柱轴肿瘤，脑干胶质瘤，多形性成胶质细胞瘤，星形细胞瘤，施旺细胞瘤，室管膜瘤，髓母细胞瘤，脑脊膜瘤，鳞状细胞癌，垂体腺瘤和尤因氏肉瘤，包括任何上述癌症的顽固形式，或一种或多种上述癌症的组合。

在本发明的仍有又一个方面，本发明人开发了一种新颖的清除剂。此类清除剂可以在如本文中描述的任何诊断，成像或治疗方法中使用。

在一个方面，本发明涉及一种基于右旋糖酐的清除剂，其包含与M-DOTAM或其功能性变体缀合的右旋糖酐或其衍生物。

在一些实施方案中，该清除剂可以是下式的化合物：

右旋糖酐-(接头-(M-DOTAM))

其中

右旋糖酐是右旋糖酐或其衍生物；

接头是连接模块；

M-DOTAM是并入金属离子的DOTAM或其功能性变体；且

x≥1。

在一些实施方案中，连接模块可以是或包含一个或多个选自脲基团(-NH-C(O)-NH-)，取代的脲基团(-NR

在特定实施方案中，连接模块可以是或包含一个或多个选自脲基团，硫基脲基团，酰胺基团，硫基酰胺基团，或三唑基团的二价官能团。

在一个优选实施方案中，连接模块包含二价硫基脲官能团或二价硫基酰胺官能团。

在一些实施方案中，连接模块包含二价硫基脲官能团和任选取代的亚芳基基团。在一些实施方案中，连接模块包含二价硫基脲官能团，任选取代的亚芳基基团和任选取代的亚烷基基团。在特定实施方案中，连接模块包含经由它的氮原子之一与任选取代的亚芳基基团成共价键的二价硫基脲官能团。在又一些实施方案中，连接模块包含经由它的氮原子之一与任选取代的亚芳基基团成共价键的二价硫基脲官能团且任选取代的亚芳基基团与任选取代的亚烷基基团成共价键。在优选实施方案中，亚芳基基团是未取代的。在特定实施方案中，亚芳基基团是亚苯基基团。在优选实施方案中，亚烷基基团是未取代的。在特定实施方案中，亚烷基基团是C1-C6亚烷基基团。在特别优选实施方案中，亚烷基基团选自亚甲基和亚乙基。当存在于连接模块中时，亚芳基基团和亚烷基基团可以是未取代的。在特定实施方案中，连接模块由经由它的氮原子之一与亚芳基基团成共价键的二价硫基脲官能团组成且亚芳基基团与亚烷基基团成共价键。

在一些实施方案中，连接模块包含二价硫基酰胺官能团和任选取代的亚芳基基团。在一些实施方案中，连接模块包含二价硫基酰胺官能团，任选取代的亚芳基基团和任选取代的亚烷基基团。在特定实施方案中，连接模块包含经由它的氮原子之一与任选取代的亚芳基基团成共价键的二价硫基酰胺官能团。在又一些实施方案中，连接模块包含经由它的氮原子之一与任选取代的亚芳基基团成共价键的二价硫基酰胺官能团且任选取代的亚芳基基团与任选取代的亚烷基基团成共价键。在优选实施方案中，亚芳基基团是未取代的。在特定实施方案中，亚芳基基团是亚苯基基团。在优选实施方案中，亚烷基基团是未取代的。在特定实施方案中，亚烷基基团是C1-C6亚烷基基团。在特别优选实施方案中，亚烷基基团选自亚甲基和亚乙基。当存在于连接模块中时，亚芳基基团和亚烷基基团可以是未取代的。在特定实施方案中，连接模块由经由它的氮原子之一与亚芳基基团成共价键的二价硫基酰胺官能团组成且亚芳基基团与亚烷基基团成共价键。

在一些实施方案中，连接模块可以是或包含下式的基团：

其中y是1至6(优选1或2)，*代表附着于右旋糖酐或其衍生物的点，且**代表附着于DOTAM或其功能性变体的环原子的点。

在一些实施方案中，连接模块可以是自胺(优选伯胺)和异氰酸根或异硫氰酸根的缀合形成的。此类缀合分别形成二价脲官能团和硫基脲官能团。在此类实施方案中，当异氰酸根是反应物之一时，在适宜时，连接模块可以认为是包含二价脲官能团或二价酰胺官能团。在此类实施方案中，当异硫氰酸根是反应物之一时，在适宜时，连接模块可以认为是包含二价硫基脲官能团或二价硫基酰胺官能团。

优选地，x大于1，使得每一个右旋糖酐具有平均大于1个M-DOTAM或其功能性变体每分子。例如，x可以是2或更多，5或更多，10或更多，15或更多，20或更多，25或更多，30或更多，35或更多，40或更多，或优选50或更多。本发明人发现使用用多个M-DOTAM基团标记的右旋糖酐可以实现改善的清除。

DOTAM或其功能性变体可以并入仅仅一个接头，从而防止右旋糖酐的交联。

可以在清除剂中找到用途的右旋糖酐的衍生物包括氨基右旋糖酐，其中右旋糖酐是用一个或多个胺取代的。特别有用的是其中右旋糖酐的一个或多个羟基基团用氨基取代的羧基甲基酰胺基团取代的氨基右旋糖酐。此类化合物可以通过用羧基甲基基团修饰右旋糖酐(例如通过与氯乙酸反应)，然后进一步与任选取代的二胺(优选烷基二胺，诸如α，ω-亚烷基二胺，例如乙二胺)反应来生成。

氨基基团提供供接头附着的点。至少30％，优选至少40％，更优选至少50％的可用氨基基团可以是用DOTAM或其功能性变体取代的。

优选地，上文式中的“右旋糖酐”是氨基右旋糖酐，对应于用一个或多个羧基甲基基团(它们自身是用乙二胺取代的)取代的右旋糖酐。

右旋糖酐可以是用一个或多个式-CH

其中波形线指示附着于右旋糖酐上的氧的点。

氨基右旋糖酐可以具有主要是α(1，6)连接的吡喃葡萄糖基重复单元的主链，任选有例如经由α(1，2)，α(1，3)或α(1，4)糖苷键连接的其它吡喃葡萄糖基单元的分支。至少一些羟基基团是用如上文讨论的氨基取代的羧基甲基酰胺基团取代的(特别是式-CH

其中每一个R

清除剂可以包括一个或多个下文式的单元：

其中**代表附着于DOTAM或其功能性变体的点，且y是如上文定义的。

右旋糖酐的衍生物可以包括用一个或多个选自氨基酸，或除了葡萄糖以外的糖的基团修饰的右旋糖酐或氨基右旋糖酐。例如，右旋糖酐可以是用一个或多个谷氨酸或聚谷氨酸单元修饰(例如加帽)的，包括Glu，(Glu)

在一些实施方案中，右旋糖酐成分的分子量可以是至少50kDa，例如50kDa至2000kDa之间。例如，分子量可以是200-800kDa，任选大于300，350，400或450kDa，且任选小于700，650，600或550kDa，任选约500kDa。

可能优选的是，作为右旋糖酐或其右旋糖酐衍生物的葡萄糖单元的数目的百分比的氨基基团的数目(具有氨基基团的葡萄糖单元的“饱和度”)可以是至少0.5％，至少1％，至少2，至少5％，至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或100％。在一些实施方案中，可能优选的是，具有氨基基团的右旋糖酐的饱和度是至少或约1％或10％，例如1％-10％

可能优选的是，作为右旋糖酐衍生物的氨基单元的数目的百分比的DOTAM基团的数目(具有DOTAM的氨基右旋糖酐成分的“饱和度”)可以是至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或100％。在一些实施方案中，可能优选的是，具有DOTAM的右旋糖酐衍生物的可用氨基基团的饱和度是至少或约40％或50％，例如40％-60％。

使用清除剂的一项潜在困难是它们可能进入肿瘤，并结合肿瘤相关抗体，负面影响随后放射性配体结合的可能性。

本发明人进一步发现当使用如下的基于右旋糖酐的清除剂时，能与清除剂渗透入肿瘤较低一起实现自血液清除较好：i)具有高平均分子量和ii)服从分子量截留，使得已经去除低于某种尺寸的片段。可以将截留在缀合步骤前应用于右旋糖酐或右旋糖酐衍生物；和/或在缀合后应用于清除剂；和/或在与金属络合之后应用于清除剂。

如此，在本发明中有用的清除剂可以是基于右旋糖酐的清除剂，其包含与金属螯合物缀合的右旋糖酐或其衍生物(例如如上文定义的，优选氨基右旋糖酐)，其中i)右旋糖酐或其衍生物的平均分子量优选是200-800kDa，任选大于300，350，400或450kDa，且任选小于700，650，600或550kDa，任选约500kDa，且ii)已经去除小于分子量截留的右旋糖酐，右旋糖酐衍生物或清除剂，其中分子量截留是50kDa或以上，100kDa或以上或200kDa或以上，任选在范围50kDa-250kDa或50kDa-200kDa，任选100kDa-200kDa中，任选100kDa或150kDa或200kDa左右。(为了避免疑问，我们注意到，如果截留表示为50kDa或以上，这意味着截留可以是50kDa或超过50kDa的任何值，但是它仍然是小于去除的截留的右旋糖酐，右旋糖酐衍生物或清除剂)。

具有低于截留的分子量的种类的量可以是例如5wt.％或更小，4wt.％或更小，3wt.％或更小，2wt.％或更小，1wt.％或更小，0.5wt.％或更小，0.4wt.％或更小，0.3wt.％或更小，0.2wt.％或更小，0.1wt.％或更小或0.01wt.％或更小，作为清除剂的重量百分比。优选地，清除剂本质上没有具有低于截留的分子量的种类。

分子量截留可以通过过滤来实现，例如通过渗滤，超滤，切向流过滤或错流过滤。优选地，进行至少2个，任选至少3个过滤步骤。“平均分子量”意味着如通过SEC-MALS分析测定的重量平均分子量。

会领会的是，当在DOTAM或其功能性变体中并入时，金属会作为金属离子存在，而且氧化状态会根据特定元素而变化。如此，技术人员理解，例如，术语铅，Pb，或

清除剂中存在的金属可以是铅的稳定(非放射性)同位素，或另一种金属离子的稳定或本质上稳定的同位素，前提是金属离子-DOTAM复合物以高亲和力受到抗体识别。例如，其它合适的金属可以是Zn(Zn

在又一个方面，本发明涉及一种制备清除剂的方法，其包括将右旋糖酐或右旋糖酐衍生物与DOTAM或其功能性变体或衍生物缀合，其中该方法牵涉在DOTAM或其功能性变体与右旋糖酐缀合之前和/或之后将DOTAM与如上文描述的Pb或另一种金属离子[例如Pb(II)]螯合。

在仍有又一个方面，本发明涉及一种制备清除剂的方法，其包括：

通过DOTAM或其功能性变体或衍生物与右旋糖酐或右旋糖酐衍生物缀合形成缀合物；

其中在缀合前右旋糖酐或右旋糖酐衍生物经受过滤步骤以去除低于分子量截留/阈(例如50kDa或以上，100kDa或以上或200kDa或以上，任选在50kDa-250kDa或50kDa-200kDa，任选100kDa-200kDa的范围中)的种类，例如低于100kDa，150kda或200kDa的种类，或其中

该方法进一步包括使缀合物经受过滤步骤以去除低于分子量截留/阈(例如50kDa或以上，100kDa或以上或200kDa或以上，任选在50kDa-250kDa或50kDa-200kDa，任选100kDa-200kDa的范围中)的种类，例如低于100kDa，150kDa或200kDa的种类。

如上文描述的，本发明人发现应用分子量截留以去除低于某种尺寸的片段是有益的。过滤方法可以是例如渗滤。技术人员会领会，“去除低于分子量截留/阈的种类”中的词语“去除”与“数目减少”同义，而且可以保留一些残留低分子量种类，取决于采用的特定过滤方法。具有低于截留的分子量的种类的量可以是例如5wt.％或更小，4wt.％或更小，3wt.％或更小，2wt.％或更小，1wt.％或更小，0.5wt.％或更小，0.4wt.％或更小，0.3wt.％或更小，0.2wt.％或更小，0.1wt.％或更小或0.01wt.％或更小，作为清除剂的重量百分比。优选地，在过滤之后清除剂本质上没有具有低于截留/阈的分子量的种类。

DOTAM功能性变体或衍生物可以是如上文定义的，其中R

这种化合物的合成描述于Chappell et al.Nuclear Medicine and Biology，Vol.27，pp.93-100，2000，而且DOTAM衍生物可购自Macrocyclics，Inc.(Plano，Texas)。

可以过量添加DOTAM或其功能性变体，使得每一个右旋糖酐衍生物具有平均大于1个DOTAM。每一个右旋糖酐上DOTAM或其功能性变体的平均数可以是大于1，例如2或更多，3或更多，4或更多，5或更多，10或更多，15或更多，20或更多，25或更多，30或更多，35或更多，40或更多，50或更多，100或更多或优选40或更多。本发明人发现使用与多个M-DOTAM基团缀合的右旋糖酐可以实现改善的清除。

优选地，右旋糖酐具有200-800kDa，任选大于300，350，400或450kDa，且任选小于700，650，600或550kDa，任选约500kDa的平均分子量。

制备清除剂的方法还可以包括螯合步骤，牵涉DOTAM或其功能性变体与金属离子螯合。金属离子可以是非放射性同位素，例如Pb，Ca，Zn的非放射性同位素，或实际上稳定的同位素，诸如

在DOTAM或其功能性变体与右旋糖酐缀合之前和/或在DOTAM或其功能性变体与右旋糖酐缀合之后但任选在过滤步骤之前进行螯合步骤。金属离子通过DOTAM或其功能性变体的螯合可能是对于确保双特异性抗体正确结合清除剂，例如确保DOTAM或其功能性变体采取与抗体啮合的正确构象必需的。

当该方法包括螯合步骤时，该方法优选还牵涉随后的去除未结合的金属的步骤。这可以通过添加别的螯合剂来实现，别的螯合剂随后可以在过滤步骤期间与右旋糖酐结合的DOTAM或其功能性变体分开。别的螯合剂优选不同于DOTAM或其功能性变体。优选地，别的螯合剂具有比右旋糖酐-螯合剂缀合物要低的分子量，以便于基于尺寸的分开。例如，别的螯合剂可以是聚氨基羧酸，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)或其盐。

优选地，制备清除剂的方法牵涉：

i)通过DOTAM或其功能性变体或衍生物与右旋糖酐或右旋糖酐衍生物缀合形成缀合物；

ii)任选地，自步骤(i)的产物去除低分子量种类；

iii)缀合物与金属离子，例如Pb，Bi，Zn或Ca的离子螯合；

iv)添加别的螯合剂以螯合未结合的金属离子；并

v)进行过滤步骤以去除低于分子量截留/阈的种类。

可以在如本文中描述的任何诊断，成像或治疗方法中使用与DOTAM或其功能性变体螯合的Pb放射性核素。会领会的是，当在此类方法中使用时，与DOTAM或其功能性变体螯合的Pb放射性核素包含在组合物中。在一个特定实施方案中，组合物包含由DOTAM或其功能性变体螯合的Pb放射性核素和没有与Pb放射性核素螯合的DOTAM或其功能性变体。如此，在另一个方面，本发明涉及此类组合物和/或供本文中描述的任何成像或治疗方法中使用的此类组合物。如此类方法中提到的与DOTAM螯合的Pb放射性核素可以是如本文中描述的组合物的形式。

没有与Pb放射性核素螯合的DOTAM或其功能性变体可以是未螯合的DOTAM或其功能性变体。当在体内使用时，未螯合的DOTAM或其功能性变体可以与来自环境的金属离子，例如钙离子形成复合物。此类与DOTAM或其功能性变体螯合的钙离子是药理学无活性的且能潜在阻断来自肿瘤中的靶物的与DOTAM或其变体螯合的药理学活性Pb放射性核素且因此可以降低治疗的功效，和/或成像和诊断的标准化摄取值。

本发明人发现通过在限定条件下淬灭未螯合的DOTAM或其功能性变体，可以提高螯合的Pb放射性核素的体内配制的控制和/或可以避免或降低药学活性螯合物和药学无活性螯合物之间的潜在竞争。因此，在一些实施方案中，没有与Pb放射性核素螯合的DOTAM或其功能性变体是与非放射性金属离子螯合的DOTAM或功能性变体。

在一些实施方案中，螯合的Pb放射性核素是

会领会的是，当并入DOTAM或其功能性变体时，Pb放射性核素会作为金属离子存在，而且氧化状态会取决于特定元素而变化。如此，技术人员理解，例如，术语铅，Pb，或

组合物中存在的非放射性金属可以是铅的稳定(非放射性)同位素，或另一种金属离子的稳定或本质上稳定的同位素。例如，其它合适的金属可以是Gd(Gd2+)，Cu(Cu2+)，Zn(Zn2+)，Ca(Ca2+)或

DOTAM功能性变体或衍生物可以是如上文定义的。

在又一个方面，本发明涉及一种制备包含与DOTAM或其功能性变体螯合的Pb放射性核素的组合物的方法，其包括：

i)提供Pb放射性核素，

ii)使Pb放射性核素与DOTAM或其功能性变体螯合，

iii)使未螯合的DOTAM或其功能性变体与非放射性金属离子螯合。

步骤iii)中的未螯合的DOTAM或其功能性变体是步骤ii)中没有与Pb放射性核素螯合的DOTAM或其功能性变体。

非放射性金属离子可以是Pb，Ca，Zn，Gd或Cu的离子。在一些实施方案中，金属离子是Ca或Cu的离子。在一些实施方案中，金属离子是Ca的离子，特别是Ca2+。

在一些实施方案中，在步骤ii)之后剩余的未螯合的DOTAM或其功能性变体是添加至Pb放射性核素的DOTAM或其功能性变体的至少90mol％，至少95mol％，至少99mol％。在一个特定实施方案中，在步骤ii)之后剩余的未螯合的DOTAM或其功能性变体是至少99mol％。

在一些实施方案中，在步骤iii)之后剩余的未螯合的DOTAM或其功能性变体是添加至Pb放射性核素的DOTAM或其功能性变体的小于5mol％，小于2mol％，小于1mol％，小于0.1mol％，小于0.01mol％。在一个特定实施方案中，在步骤iii)之后剩余的未螯合的DOTAM或其功能性变体小于1mol％，小于0.1mol％，小于0.01mol％。

在步骤a)中提供的Pb放射性核素可以通过将衰变成感兴趣Pb放射性核素的放射性材料放置在发生器中来生成，其中放射性材料是结合至固体材料的。例如，

萃取层析可以使用，在与水不混溶的有机稀释剂(典型地长烃链醇，换言之Cx链和以上)中在溶液中包括醚冠作为萃取剂的固定相，特别是其环己基或苄基基团用一个或多个具有直链或支链的C[至C]2烷基基团取代的二环己酮-18-冠-6或二苯并-18-冠-6。

特别是，可以使用包含4，4′(5′)-二-叔丁基环己酮-18-冠-6作为萃取剂的固定相，优选在辛-1-醇中稀释。此类固定相具有选择性保留含有1.5至2.5mol/L强酸的水溶液(这典型地对应于用于自镭-224发生器提取

或者，也可以用离子交换层析，例如阳离子交换层析纯化包含期望放射性核素和杂质的溶液。

一种生成和纯化

下文的表中提供本文中提到的某些序列。

表2

通过援引明确完整收录本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容。

现在参照具体实施例进一步描述本发明。会理解的是，鉴于上文提供的一般描述，可以实施各种其它实施方案。

实施例

实施例1：免疫接种的描述

将2种对映体Pb-DOTAM-烷基-PEG

在PBS中以1ug/ml，100ul/孔在96孔NUNC Maxisorp板上固定化2个对映体Pb-DOTAM级分(PJRD05.133F1或PJRD05.133F2)中每一个，继以：用200ul/孔PBS中的2％Crotein C封闭板；一式两份应用100ul/孔抗血清在含0.5％Crotein C的PBS中的连续稀释液；用100ul/孔在含0.5％Crotein C的PBS中各自稀释的HRP缀合的驴抗家兔IgG抗体(Jackson Immunoresearch/Dianova 711-036-152；1/16 000)和链霉亲合素-HRP检测。对于所有步骤，将板于37℃温育1小时。在所有步骤之间，将板用含0.05％Tween 20的PBS清洗3次。通过添加100ul/孔BM Blue POD底物溶液(Roche)来形成信号；并通过添加100ul/孔1MHCl来停止。针对690nm作为参照，于450nm读取吸光度。滴度定义为导致半最大信号的抗血清的稀释度。

实施例2：自家兔克隆B细胞

自经过免疫接种的家兔取得血液样品。将含有EDTA的全血用1x PBS(PAA，Pasching，Austria)稀释两倍，之后是依照制造商的说明书使用哺乳动物淋巴细胞(Cedarlane Laboratories，Burlington，Ontario，Canada)的密度离心。将PBMC用1x PBS清洗两次。

使用补充有10％FCS(Hyclone，Logan，UT，USA)，2mM Glutamin，1％青霉素/链霉素溶液(PAA，Pasching，Austria)，2mM丙酮酸钠，10mM HEPES(PAN Biotech，Aidenbach，Germany)和0.05mM b-巯基乙醇(Gibco，Paisley，Scotland)的RPMI 1640(Pan Biotech，Aidenbach，Germany)。

将无菌细胞培养6孔板用碳酸盐缓冲液(0.1M碳酸氢钠，34mM碳酸氢二钠，pH9.55)中的2μg/ml KLH于4℃包被过夜。在使用前将板用无菌PBS清洗三次。将无菌链霉亲合素包被的6孔板(Microcoat，Bemried，Germany)用生物素化TCMC-Pb-dPEC3一生物素异构体A(1μg/ml)和B(1μg/ml)在PBS中的1+1对映体混合物于室温包被3小时。在淘选步骤前将这些6孔板用无菌PBS清洗3次。

在无菌KLH包被的6孔板上接种PBMC以经由非特异性粘附消减巨噬细胞和单核细胞即去除结合KLH的细胞。对每个孔填充最多4ml培养基和多至6x10

对用TCMC-Pb-dPEC3-生物素异构体A和B的对映体混合物包被的6孔板接种多至6x10

将抗IgG FITC抗体(AbD Serotec，Düsseldorf，Germany)用于单细胞分选。为了表面染色，将来自消减和富集步骤的细胞与抗IgG FITC抗体一起在PBS中在黑暗中于4℃温育45分钟。染色后将PBMC用冰冷的PBS清洗两次。最后在冰冷的PBS中重悬浮PBMC并立即提交FACS分析。在FACS分析前添加浓度为5μg/ml的碘化丙啶(BD Pharmingen，San Diego，CA，USA)以区分死的和活的细胞。

将配备有计算机和FACSDiva软件(BD Biosciences，USA)的Becton DickinsonFACSAria用于单细胞分选。

通过Lightwood等人(J Immunol Methods，2006，316：133-143)描述的方法制备家兔B细胞的培养。简言之，将单个分选的家兔B细胞在96孔板中与200μl/孔含有Pansorbin细胞(1∶100000)(Calbiochem(Merck)，Darmstadt，Deutschland)，5％家兔胸腺细胞上清液(Microcoat，Bernried，Germany)和经伽马照射的鼠EL-4B5胸腺瘤细胞(5x10

实施例3：家兔抗体的表达

使用NucleoSpin 8/96RNA试剂盒(Macherey&Nagel；740709.4，740698)依照制造商的方案自B细胞裂解物(在RLT缓冲液中重悬浮，Qiagen，目录号79216)制备总RNA。用60μl无RNA酶的水洗脱RNA。使用Superscript III第一链合成SuperMix(Invitrogen 18080-400)和寡聚dT引物依照制造商的说明书使用6μl RNA通过逆转录酶反应生成cDNA。在Hamilton ML Star系统上实施所有步骤。以50μl的终体积使用引物用于重链的rbHC.up和rbHC.do和用于轻链的rbLC.up和rbLC.do(表3)使用4μl cDNA用AccuPrime超级混合(Invitrogen 12344-040)扩增免疫球蛋白重和轻链可变区(VH和VL)。所有正向引物是对信号肽(分别是VH和VL的)特异性的，而反向引物是对恒定区(分别是VH和VL的)特异性的。用于RbVH+RbVL的PCR条件如下：热启动5分钟94℃；35个循环的20秒94℃，20秒70℃，45秒68℃，和最终延伸7分钟68℃。

表3

在48E凝胶2％(Invitrogen G8008-02)上加载50μl PCR溶液中的8μl。使用NucleoSpin Extract II试剂盒(Macherey&Nagel；740609250)依照制造商的方案清洁阳性PCR反应并在50μl洗脱缓冲液中洗脱。在Hamilton ML Starlet系统上实施所有清洁步骤。

为了重组表达家兔单克隆二价抗体，通过悬垂克隆方法(RS Haun et al.，Biotechniques(1992)13，515-518；MZ Li et al.，Nature Methods(2007)4，251-256)将编码VH或VL的PCR产物作为cDNA克隆入表达载体。表达载体含有由5′CMV启动子(包括内含子A)和3′BGH多聚腺苷酸化序列组成的表达盒。在表达盒以外，质粒含有pUC18衍生的复制起点和赋予氨苄青霉素抗性(用于大肠杆菌中的质粒扩增)的β-内酰胺酶基因。使用基础质粒的三种变体：一种质粒含有设计用于接收VH区的家兔IgG恒定区，同时另外两种质粒含有用于接收VL区的家兔或人卡帕LC恒定区。使用交叠引物通过PCR扩增线性化的编码卡帕或伽马恒定区和VL/VH插入物的表达质粒。将经过纯化的PCR产物与生成单链悬垂的T4 DNA聚合酶一起温育。通过添加dCTP来停止反应。在下一步中，组合质粒和插入物并与诱导位点特异性重组的recA一起温育。将重组的质粒转化入大肠杆菌。次日挑取生长的菌落并通过质粒制备，限制性分析和DNA测序来测试正确的重组的质粒。

为了抗体表达，通过使用239-Free转染试剂(Novagen)遵循试剂供应商建议的规程将分离的HC和LC质粒瞬时共转染入2ml(96孔板)FreeStyle HEK293-F细胞(InvitrogenR790-07)。在1周后收获上清液并交付纯化。

实施例4：家兔单克隆抗体的选择

下文表显示多种单克隆二价家兔抗体的特性。选择PRIT-0128作为先导候选，因为它具有相当的对螯合的Pb和Bi的结合，降低的对其它螯合的金属的结合，和高亲和力(＜100pM)。

如下文所述进行SET(溶液平衡滴定)测定法。

测定板的准备：以20ng/ml的浓度在PBS缓冲液中用25μl/孔DOTAM-生物素异构体混合物将384孔链霉亲合素板(Nunc，Microcoat#11974998001)于4℃温育过夜。

用游离DOTAM-金属螯合物(Pb，Bi，Ca，Cu，Zn，Mg，Fe)平衡抗DOTAM抗体样品：始于2500nM，500nM或100nM DOTAM-金属螯合物的浓度以1∶3，1∶2或1∶1.7稀释步骤用相关DOTAM-金属螯合物滴定0.01nM-1nM抗体。在密封的REMP贮存聚丙烯微量板(Brooks)中将样品于4℃温育过夜。

过夜温育后，用90μl PBST每孔将链霉亲合素板清洗3次。将来自平衡板的15μl每份样品转移至测定板并于室温温育15分钟，继以3个用PBST缓冲液的90μl清洗步骤。如下进行检测，即添加25μl山羊抗人IgG抗体-POD缀合物(Jackson，109-036-088，1∶4000，在OSEP中)，继以6个用PBST缓冲液的90μl清洗步骤。将25μl TMB底物(Roche Diagnostics GmbH，目录号：11835033001)添加至每个孔。在Safire2读数仪(Tecan)上于370/492nm进行测量。

材料：

1.DOTAM-生物素-异构体混合物：

下列成分的混合物，浓度＝20ng/ml

-Pb-Dotam-Bn-生物素/TCMC-Pb-dPEG3-生物素，异构体A

-Pb-Dotam-Bn-生物素/TCMC-Pb-dPEG3-生物素，异构体B

-Pb-Dotam-烷基-生物素异构体A

-Pb-Dotam-烷基-生物素异构体B

2.PBS：DPBS，PAN，P04-36500

3.BSA：Roche，10735086001

4.Tween 20：Polysorbat20(usb，#20605，500ml)

5.PBST：10x，Roche，#11666789001/0，1％Tween 20

6.OSEP：PBS(10x，Roche，#11666789001)/0，5％BSA(牛血清清蛋白级分V，无脂肪酸，Roche，#10735086001)/0，05％Tween 20

表4

WTRa：野生型家兔；TgRa：转基因家兔

实施例5：分子生物学

如Sambrook，J.et al.，Molecular cloning：A laboratory manual；Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989中所述使用标准方法来操作DNA。依照制造商的说明书使用分子生物学试剂。

在Geneart GmbH(Regensburg，Germany)通过化学合成制备期望的基因区段。将合成的基因片段克隆入大肠杆菌质粒进行繁殖/扩增。通过DNA测序来检验亚克隆的基因片段的DNA序列。或者，通过化学合成的寡核苷酸的退火或经由PCR来组装短合成DNA片段。由metabion GmbH(Planegg-Martinsried，Germany)制备相应寡核苷酸。

使用基于多肽的氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过于280nm测定光密度(OD)来测定纯化的多肽的蛋白质浓度。

通过瞬时转染人胚胎肾细胞(HEK 293)来表达期望的蛋白质。为了表达期望基因/蛋白质(例如全长抗体重链，全长抗体轻链，或含有另外的域(例如在它的C端的免疫球蛋白重或轻链可变域)的全长抗体重链)，使用包含下面的功能性元件的转录单元：

-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子(P-CMV)，包括内含子A，

-人重链免疫球蛋白5’非翻译区(5’UTR)，

-鼠免疫球蛋白重链信号序列(SS)，

-要表达的基因/蛋白质，和

-牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH pA)。

在包括要表达的期望基因的表达单元/盒以外，基础/标准哺乳动物表达质粒含有容许这种质粒在大肠杆菌中复制的来自载体pUC18的复制起点，和赋予大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。

通过将编码通过G4Sx4接头彼此分开的相应序列元件的DNA片段(V-重或V-轻)融合至人IgG分子的CH3域的C端来组装包括C端融合基因，包含完整和功能性抗体重链，继以另外的抗体V-重或V-轻域的抗体重链编码基因(VH-CH1-铰链-CH2-CH3-接头-VH或VH--CH1-铰链-CH2-CH3-接头-VL)。使用节-入-穴技术表达在两个CH3域的C端分别承载一个VH和一个VL域的重组抗体分子。

在具有C端VH或VL域的抗体重链片段的表达盒以外，用于在HEK293细胞中瞬时表达具有C端VH或VL域的抗体重链的表达质粒包含容许这种质粒在大肠杆菌中复制的来自载体pUC18的复制起点，和赋予大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。具有C端VH或VL域融合基因的抗体重链片段的转录单元包含下面的功能性元件：

-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子(P-CMV)，包括内含子A，

-人重链免疫球蛋白5’非翻译区(5’UTR)，

-鼠免疫球蛋白重链信号序列，

-抗体重链(VH-CH1-铰链-CH2-CH3-接头-VH或VH-CH1-铰链-CH2-CH3-接头-VL)编码核酸，和

-牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH pA)。

依照如之前概述的方法构建编码表2中提到的所有重链多肽/蛋白质的表达质粒。

通过融合编码相应序列元件的DNA片段来组装包含完整和功能性抗体轻链的抗体轻链编码基因。

在抗体轻链片段以外，用于瞬时表达抗体轻链的表达质粒包含容许这种质粒在大肠杆菌中复制的来自载体pUC18的复制起点，和赋予大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。抗体轻链片段的转录单元包含下面的功能性元件：

-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子(P-CMV)，包括内含子A，

-人重链免疫球蛋白5’非翻译区(5’UTR)，

-鼠免疫球蛋白重链信号序列，

-抗体轻链(VL-CL)编码核酸，和

-牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH pA)。

依照如之前概述的方法构建编码表2中提到的所有轻链多肽/蛋白质的表达质粒。

所使用的型式的示意图在图1中描绘。星指PGLALA替代：1指DOTAM结合物，而2和3指抗靶物(此处的CEA)结合物。

实施例6：PRIT分子的瞬时表达

在F17培养基(Invitrogen Corp.)中培养的瞬时转染的HEK293细胞(人胚胎肾细胞系293衍生的)中生成抗体分子。为了转染，使用″无293″转染试剂(Novagen)。自各个表达质粒表达如上文描述的相应抗体重和轻链分子。如制造商的说明书规定的那样实施转染。在转染之后三至七(3-7)天收获含有免疫球蛋白的细胞培养物上清液。将上清液贮存于低温(例如-80℃)直至纯化。

关于例如HEK293细胞中的人免疫球蛋白的重组表达的一般信息见Meissner，P.etal.，Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203。

实施例7：蛋白质的纯化

以5ml/min的流速在用5ml蛋白A树脂(Mab Select Sure)填充的柱(1.1cm直径，5cm长度)上应用收获的细胞培养物上清液。用20ml PBS缓冲液清洗后用25ml柠檬酸钠pH3.0洗脱抗体。

然后用1M Tris pH 9.0将洗出液调节至pH 5.0并于4℃温育过夜。

以10000x g离心10分钟并在0.2μm滤器上过滤后，在处于pH 6.0含有20mM组氨酸，140mM NaCl的缓冲液预平衡的Superdex 200大小排阻层析柱(2.6cm直径，60cm长度)上应用滤出液并用相同的缓冲液洗脱。

收集含有纯化的抗体的主洗脱峰并分析最终的纯度。

材料-表5

实施例8：FACS

使用胰蛋白酶自培养瓶解离MKN-45细胞并使用Casy细胞计算器计数。于4℃，300g成团粒后，在FACS缓冲液(2.5％FCS，在PBS中)重悬浮细胞，调节至2.0E+06个细胞/mL，分配至96孔V底PP板(25μL/孔＝5.0E+04个细胞/孔)。

在FACS缓冲液中将CEA特异性一抗调节至40μg/mL，产生10μg/mL的终浓度。使用RS-CEA-Il2v作为参照。以等摩尔比使用用FITC标记的Pb-DOTAM和一抗。将它们混合并于室温温育10分钟以容许抗体结合Pb-DOTAM。随后，将20μl制备的混合物添加至25μl细胞悬浮液并于4℃温育1小时。然后在FACS缓冲液中清洗细胞两次并在70μl/孔FACS缓冲液中重悬浮用于使用FACS Canto(BD，Pharmingen)的测量。

在FACS缓冲液中将CEA特异性一抗调节至20μg/mL，产生10μg/mL的终浓度。使用RS-CEA-Il2v作为参照。将20μl添加至25μl细胞悬浮液并于4℃温育1小时。然后在FACS缓冲液中清洗细胞两次。清洗后，在50μL含有二抗(-Alexa488，c＝10μg/mL)的FACS缓冲液中重悬浮细胞并于4℃温育1小时。然后在FACS缓冲液中清洗细胞两次并在70μl/孔FACS缓冲液中重悬浮用于使用FACS Canto(BD，Pharmingen)的测量。

图36中描绘的是一个实施例，显示一种抗体(PRIT-0165)对MKN-45细胞的结合，使用或是二级检测(右边小图，Alexa 488)或是DOTAM FITC(左边小图，FITC-A)检测它。

实施例9：人源化

为了在DOTAM结合物PRIT-0128的人源化期间鉴定合适的人受体框架，使用两种方法的组合。一方面，采用经典办法，其通过搜索与亲本抗体具有高序列同源性的受体框架，随后将CDR区嫁接到这种受体框架上。判断鉴定的框架与亲本抗体的每一处氨基酸差异对结合物的结构完整性的影响并在适宜时引入朝向亲本序列的回复突变。

另一方面，使用内部开发的计算机方案预测人源化型式的VH和VL域朝向彼此的取向(见WO2016/062734)。进行这是为了CDR在所有可能的人种系组合上的虚拟嫁接物。将结果与亲本结合物的VH-VL域取向比较以选择在几何上接近起始抗体的框架组合。

在每种情况中将下列亲本抗体的CDR区嫁接到受体框架上(编号方式依照Kabat)：

VH_CDR1：31-35

VH_CDR2：50-65

VH_CDR3：95-102

VL_CDR1：24-34

VL_CDR2：50-56

VL_CDR3：89-97

以最终型式生成人源化变体，作为VH/VL Fv融合(分别没有CH1和Ck)，DOTAM结合物融合至肿瘤靶向性IgG的Fc的C端。最终型式的亲本(非人源化)DOTAM结合物PRIT-0128衍生分子称作PRIT-0156。

由于就VH/VL预测而言的合适性和升高的框架稳定性，同样包括Herceptin框架。对于所有VH人源化变体，使用人J元件hJH2。对于所有VK人源化变体，使用人J元件hJK4。

HC4是PRIT-128在具有一处回复突变kabat A49G的人种系IGHV3-30-02上的嫁接。

为了得到可变重链HC5，在具有A49G作为回复突变和删除第一个氨基酸以反映原始家兔N端的人种系hVH_2_26上嫁接CDR。

在Herceptin V区(衍生自人种系hVH3_66)上嫁接，变体HC7特征在于受体框架中的少数修饰：删除N端E，A49G，A71R，和S93A。

对于HC10，在人种系IGHV4_34_01上嫁接PRIT-128的CDR。

在这里，始于V2，修饰N端以反映始于Q2的原始家兔抗体。另外，考虑G29F和F31L作为回复突变wrt Kabat命名法以及框架3中的V71R和F78V。

对于轻链LC1，在没有任何回复突变的人种系IGKV1_39_01上嫁接CDR。选择I2作为起点至反映始于A2的原始家兔抗体。

通过在人种系hVK1_5上嫁接CDR获得轻链变体LC3。删除D1并考虑I2A回复突变作为新的N端。作为另外的回复突变，考虑K42Q和A43P。

没有生成人源化矩阵的所有可能组合，但是基于像VH/VL预测和给定组合的序列风险等考量选择所定义组合的选集。

人源化的目标是获得就对DOTAM的亲和力而言损失没有大于因子10且展示升高的稳定性(如果可能的话)的人源化结合物。具有相当或甚至更好的对DOTAM的亲和力以及热稳定性的升高(如通过约10-15℃的DLS测量的)的数种结合物实现了这一点。见下文表7和8。

实施例10：基于溶液平衡的kd测定

为了对更大量的人源化候选筛选它们对Pb-DOTAM的亲和力，使用溶液平衡滴定(SET)。

表6详述选定的人源化DOTAM结合物针对Pb-DOTAM的基于SET的亲和力测定。表6中的所有抗体都是包含对CEA的二价结合和对Pb-Dotam的单价结合的双特异性抗体(2∶1型式，见图1)：

表6

实施例11：基于Kinexa的kd测定

为了更加详细的分析和用于亲和力测定的正交方法，使用Kinexa。

使用带有自动进样器的来自Sapidyne Instruments(Boise，ID)的KinExA 3200仪器。聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)珠购自Sapidyne，而PBS(磷酸盐缓冲盐水)，BSA(牛血清清蛋白级分V)和抗DOTAM抗体是内部制备的(Roche)。

依照用于生物素化分子的KinExA手册方案(Sapidyne)包被PMMA珠。简言之，首先，珠的每个管(200mg)添加1ml PBS(pH 7.4)中的10μg生物素-BSA(Thermo Scientific)用于吸附包被。于室温旋转2小时后，去除上清液并用1ml PBS清洗珠5次。其次，将1ml含有10mg/ml BSA的PBS中的100μg中性亲合素生物素结合蛋白(Thermo Scientific)添加至珠并于室温温育另外2小时以将中性亲合素偶联至珠及提供另外的生物素结合位点用于随后生物素化蛋白质结合。然后用1ml PBS漂洗中性亲合素包被的珠5次。最后，用PBS中的200ng/ml生物素化Pb-DOTAM-异构体混合物(每种异构体50ng)包被珠并于室温进一步温育2小时。然后在30ml PBS中重悬浮珠并立即使用。

使用PBS pH 7.4作为运行缓冲液于室温(RT)实施所有KinExA实验。在补充有1mg/ml BSA的运行缓冲液(“样品缓冲液”)中制备样品。使用0.25ml/min的流速。通过始于100pM的两倍系列稀释(浓度范围0.049pM-100pM)用Pb-DOTAM抗原滴定具有5pM结合位点浓度的恒定量的抗DOTAM抗体。没有抗原的抗体的一份样品充当100％信号(即没有抑制)。将抗原-抗体复合物于室温温育至少24小时以容许达到平衡。然后以5ml的体积使平衡的混合物通过KinExA系统中Pb-DOTAM偶联珠的柱，允许由珠捕捉未结合的抗体，没有扰乱溶液的平衡状态。使用样品缓冲液中的250ng/ml

使用“标准分析”方法使用KinExA软件(版本4.0.11)内含有的单位点同质结合模型自数据的非线性回归分析获得KD。通过将数据点拟合理论KD曲线，该软件计算KD并确定95％置信区间。作为KD低和KD高给出95％置信区间(Sapidyne TechNote TN207R0)。

下文提供为PRIT-213如通过Kinexa测定的亲和力值的其它例子。PRIT-0213是与PRIT-0186相同的分子，只是另一种CEA结合性VH/VL，见表8。

PRIT-213

CEA-DOTAM BsAb的金属-DOTAM螯合物亲和力

另外的值如下文显示的：

*宽置信区间，指示测量的KD不那么精确

°没有为了nM-亲和力完全优化测定法

实施例12：人源化PRIT分子的热稳定性测量

将最终型式的人源化PRIT分子的不同变体(在20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0中)在相同的缓冲液中稀释至1mg/ml。将30μl每份样品转移入384孔板过滤装置(连同抗HER3抗体作为参照)。以1,000g离心1分钟后用10μl石蜡油覆盖孔。将板再次离心(1,000g，1分钟)并转移入DLS读板仪(Dyna Pro PlateReader-II，Wyatt)。始于25℃，以0.05℃/分钟的速度升高温度至79.9℃。使用Dynamics软件(V7.0)记录散射的光。

将数据转移至Excel(Microsoft)，根据样品和温度分选并使用软件插件来创建解链曲线。将发生明显偏离基线的温度定义为“开始聚集”并将解链曲线的拐点定义为“解链温度”。

结果-表7

实施例13：候选的选择

PRIT-0156是包含与CEA结合物CH1A1A组合的家兔DOTAM结合物PRIT-0128的2∶1抗体。PRIT-0178至PRIT-0204是具有相同CEA结合物的相同型式的人源化变体。PRIT-0205直至PRIT-0221对应于DOTAM结合部分中的PRIT-0178至PRIT-0204人源化变体，但是CEA结合物变成T84.66。

下文表比较各种PRIT分子的特性。优选的化合物是PRIT-213和PRIT-214。

表8：候选的选择

序列

HC5：

LC1：

LC3：aqmtqspstl sasvgdrvti tcqsshsvys

501 dndlawyqqk pgqppklliy qasklasgvp srfsgsgsgt eftltisslq

551 pddfatyycl ggyddesdty gfgggtkvei k

HC7：vqlvesgggl vqpggslrls caasgfslst

501 ysmswvrqap gkglewvgfi gsrgdtyyas wakgrftisr dtskntaylq

551 mnslraedta vyycarerdp ygggaypphl wgrgtlvtvs s

HC10：vqlqqwgagl lkpsetlslt cavygfslst

501 ysmswirqpp gkglewigfi gsrgdtyyas wakgrvtisr dtsknqvslk

551 Issvtaadta vyycarerdp ygggaypphl wgrgtlvtvs s

T84.66 VH 1 qvqlvqsgae vkkpgssvkv sckasgfnik dtymhwvrqa pgqglewmgr

51 idpangnsky vpkfqgrvti tadtststay melsslrsed tavyycapfg

101 yyvsdyamay wgqgtlvtvs s

T84.66VL：

CH1A1A VH：

CH1A1A VL：

实施例14：Fab P1AA1227 Pb-DOTAM复合物的结晶，数据收集和结构测定

为了复合物形成，将自PRIT-0213中的人源化VH/VL衍生的Fab，称作P1AA1227以26mg/ml与Pb-DOTAM粉以1∶4.2的摩尔比混合。于4℃温育2小时后使用JCSG+筛(Qiagen，Hilden)于21℃以坐滴蒸气扩散设置实施初始结晶试验。晶体在5天内自0.2M(NH

数据收集和结构测定。为了数据收集，将晶体在含有10％乙二醇的沉淀溶液中于100K闪冻。在瑞士光源(Villigen，Switzerland)的光束线X10SA上使用PILATUS 6M检测仪以

表9中汇总数据收集和细化统计。

用PYMOL(The Pymol Molecular Graphics System，Version 1.7.4.

表9：Fab P1AA1227-Pb-DOTAM复合物的数据收集和细化统计

*括号中的值是最高分辨率壳的。

为了表征Pb-Dotam与Fab P1AA1227的相互作用细节，我们以

用程序PISA分析结合界面揭示Fab P1AA1227与Pb-DOTAM经由3个氢键，极性相互作用和范德华接触的相互作用样式。Pb-DOTAM在由重和轻链形成的口袋中结合。这个口袋具有一侧打开的盒子的形状。口袋的侧壁和底部促成非极性相互作用而在壁的边缘极性相互作用为主。在重链Glu95和Asp97的CDR3残基与DOTAM氨甲酰基氮原子N7和N8之间形成侧链氢键。经由Arg96的主链羰基原子与DOTAM的原子N7建立另外的氢键。经由以边缘至面取向朝向氮杂环十二烷环的重链CDR2 Phe50和Tyr58侧链的非极性相互作用进一步稳定复合物。轻链促成口袋的大部分“底部”，CDR3残基Gly91-Tyr96提供与四环十二烷环的非极性接触。Asp32提供与DOTAM的氨甲酰基氮原子N6的氢键(编号方式依照Kabat)。

图2显示与Pb-DOTAM复合的P1AA1227的结构。

图3显示相互作用位点上的视图。

下文表显示重链互补位残基，基于用程序PISA进行的分析。

表10

下文表显示轻链互补位残基，基于用程序PISA进行的分析。

表11

互补位残基在下文序列中还

＞P1AA1227_HC

＞P1AA1227_LC

实施例15：体内生物分布和功效：材料和方法

下面的实施例的词汇表

所有实验方案得到地方当局(Comité Régional d’Ethique de l’Expérimentation Animale du Limousin(CREEAL)，Laboratoire Départemental d′Analyseset de Recherches de 1a Haute-Vienne)的审查和批准。遵照道德准则以光明和黑暗(12小时/12小时)的日周期在无特定病原体条件下维持雌性重度合并免疫缺陷(SCID)小鼠(Charles River)。在到达后第一周期间没有实施操作以容许动物适应新环境。每天监测所有小鼠以评估身体状况和总体健康状况。

经由测径器估算肿瘤体积，依照公式计算：体积＝0.5×长度×宽度

使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software，Inc.)和JMP 8(SAS InstituteInc.)实施统计学分析。

由Roche Diagnostics GmbH，Pharma Research Penzberg(Penzberg，Germany)提供双特异性抗体并贮存于-80℃直至注射日。然后融化它们并在标准媒介缓冲液(20mM组氨酸/组氨酸HCl，140mM NaCl；pH 6.0)中稀释。

双特异性抗体

由Macrocyclics(Plano，TX，USA)提供清除试剂。将它们贮存于-80℃直至注射日，此时融化它们并在PBS中稀释至期望浓度。

清除剂

由Macrocyclics提供用于放射性标记的DOTAM螯合物并在放射性标记之前于-20℃维持。由AREVA Med(Razès，France)实施随后用或是铅-203(

放射性标记的螯合物

BxPC3是一种天然表达CEA的人原代胰腺腺癌细胞系。在富含10％胎牛血清和1％GlutaMAX(Gibco，目录号35050-061)的RPMI-1640培养基(Gibco，目录号42401-018)中培养BxPC3细胞。LS174T是一种天然表达CEA的人结肠直肠腺癌细胞系。在富含10％胎牛血清的DMEM培养基(Gibco，目录号42430-082)中培养LS174T细胞。MKN45是一种天然表达CEA的人胃腺癌细胞系。在补充20％胎牛血清的RPMI-1640培养基(Gibco，目录号42401-018)中培养MKN45细胞。在与

细胞系

*欧洲认证细胞培养物保藏中心(Salisbury，UK)

**美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA，USA)

***莱布尼兹研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏中心(Braunschweig，Germany)

实施例16：用各种CEA靶向性双特异性抗体预靶向(方案80(a，b，c))

这项研究旨在评估在用各种CEA靶向性双特异性抗体预靶向之后小鼠中的胰腺腺癌异种移植物中的Pb积累，以为转变成临床试验优化方案和选择最合适的候选。实验分成三个分开的方案，以i)80b，ii)80c，和iii)80a的次序实施。方案80b评估与

研究设计，方案80a

*注射体积100gL

研究设计，方案80b

*注射体积100μL

研究设计，方案80c

*注射体积100μL

对每只小鼠(6-7周龄)在100μL RPMI/Matrigel中皮下(s.c.)注射BxPC3细胞(传代30)入右体侧。在肿瘤细胞注射之后五天，将小鼠分入实验组，平均肿瘤体积为160-170mm

在方案80a中，在双特异性抗体之后3天以30μg每100μL的浓度静脉内注射清除剂，继以2小时后的

研究组，方案80c(n

*阳性对照(T84.66)；**阴性对照

在24小时(80a)；96小时(80b)；或24，72，或168小时(80c)后处死小鼠用于生物分布目的。自方案80a中的所有小鼠收获：血液，膀胱，脾，肾，肝，肺，心，肌肉，和肿瘤。自方案80b和80c中的所有小鼠收获：血液，膀胱，小肠，结肠，脾，胰，肾，肝，肺，心，股骨，肌肉，和肿瘤。对收集的样品称重并放置在塑料管中用于立即放射性测量。然后计算百分比注射剂量每克组织(％ID/g)，包括放射性衰变和背景的校正。

所有CEA结合性双特异性抗体导致

总之，靶向CH1A1A的双特异性抗体导致比靶向T84.66的那些显著更高的肿瘤摄取(不配对t检验，p＜0.0001)；CHlA1A和T84.66均导致与阴性对照相比显著更高的摄取(单向ANOVA，p＜0.0001)。结果在图4中显示。

用所有预结合的CEA结合性双特异性抗体实现了特异性肿瘤靶向，尽管完全人源化版本的％ID/g与阳性对照PRIT-0165相比略微更低。非CEA结合性对照导致相对可忽略的肿瘤积累。

总之，这种预结合实验设置中的计算％ID/g达到比相应的PRIT方案的那些高大约10倍的水平；然而，输出数据反映伽马计数器活性测量且未发现计算误差。重要的是，肿瘤对正常组织比保持在预期范围内。具体而言，肿瘤对血液比(±SD，n＝3)为PRIT-0205的6.76±2.95，PRIT-0206的7.56±2.27，PRIT-0207的9.33±0.91，PRIT-0208的10.77±0.84，PRIT-0209的11.71±0.84，PRIT-0165的10.78±0.88，和PRIT-0175的0.85±0.12。结果在图5中显示。

两种CEA结合性抗体均导致与阴性对照相比显著的肿瘤积累。统计学分析显示使用PRIT-0206或PRIT-0165靶向的肿瘤之间对于任何研究时间点没有显著差异，在第3和7天之间％ID/g对于任何研究抗体也没有任何显著差异(双向ANOVA，p＜0.05)。与方案80b类似，计算％ID/g值总体较高；然而，肿瘤对血液比保持在预期范围内。在第1和3天之间没有看到肿瘤对血液比的显著差异，但是对于PRIT-0165和PRIT-0206，等待7天显著提高PRIT-0213d比(双向ANOVA，p＜0.05)。结果在图6中显示。

在注射之后多个时间点时

所有靶向T84.66或CH1A1A的完全人源化双特异性抗体导致放射性在BxPC3肿瘤中的显著积累，与它们的相应阳性对照的那些相当。

肿瘤中的

实施例17：清除剂的生物分布(方案44)

这项研究的目的是解决具有不同特性(例如分子主链，尺寸，和电荷)的清除剂的选集的生物分布，更具体地说，它们在肿瘤中的存在和/或积累。令人感兴趣的是，清除剂可能潜在进入肿瘤，结合肿瘤结合性抗体和/或将它们拉出肿瘤，负面影响随后放射性配体的结合。

研究设计，方案44

*注射体积100μL

研究组，方案44(n

用5μCi

在注射

所有清除剂自血流迅速清除，在注射之后2小时就主要在肝和结肠中积累。在注射之后24小时在肝中找到约50％的注射

图7显示在MKN45荷瘤小鼠中在注射

图8显示在MKN45荷瘤小鼠中在注射

图9显示在MKN45荷瘤小鼠中在注射

汇总和结论

放射性标记的CA无一导致以30μg每只小鼠的剂量施用的

实施例18：清除剂的长期生物分布(方案70)

这项研究比较六种不同清除剂的长期生物分布。用

研究设计，方案70

*注射体积100μL

研究组，方案70(n

图10显示在无肿瘤小鼠中在注射

图11显示在无肿瘤小鼠中在注射

实施例19：血液中的清除剂(方案83和87)

这个部分涵盖两项研究，其中第一项包括就血液中的停留时间而言与PBS比较九种不同的基于右旋糖酐的清除剂的初始筛选。目的是鉴定有希望的候选用于未来的预靶向实验，容许分开三周的重复治疗。假设是在循环中保持延长时间的清除剂结合施用的双特异性抗体，有效阻断随后注射的放射性标记的DOTAM的结合。清除试剂就尺寸，电荷，和1，4，7，10-四(氨甲酰基甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷(TCMC)载荷而言变化。

第二项研究就抗体清除效率而言评估九种清除剂。实验设计为无肿瘤小鼠中的标准单次注射PRIT方案，评估

研究设计，方案83

*注射体积100μL

研究设计，方案87

*注射体积100μL

方案83和87中的研究组(n

在第一次PRIT注射时，小鼠为7-9周龄。研究中的所有小鼠没有肿瘤；因此，任何DOTAM结合性双特异性抗体可用于筛选目的。在PRIT-0155之后一天静脉内施用清除剂，在PBS中稀释至30(方案83)或60(方案87)μg每100μL的终浓度。O组接受PBS代替清除剂。A-D组中的化合物是基于20，70，250，或500kDa的右旋糖酐尺寸，具有不同TCMC取代。J-N组中的化合物基于具有不同电荷(Glu)的加帽的(即具有过量胺的中和)右旋糖酐-500(CDex)，或具有单版本Glu的右旋糖酐-500和右旋糖酐-20(M(Glu))。具有-(Glu)4，-(Glu)3，和-(Glu)2的加帽的右旋糖酐分别对应于非常负，负，和中性净电荷；单版本M(Glu)2对应于负至略微正净电荷。

在施用之后3周，与PBS对照组显著不同的血液中的放射性含量(％ID/g)的组平均(41.1±1.4％ID/g)指示清除剂停留在循环中。三种化合物与对照没有显著差异：加帽的Dex500-(Glu)4，Dex500-单-(Glu)2，和Dex20-单-(Glu)3；其它化合物有不同程度的差异。

图12显示在注射

测试的清除剂一般表现较好，有一个例外：Dex500-M(Glu)2，它在24小时之后保持在血液中，以8.07±0.61％ID/g脱颖而出。

图13显示在注射

筛选的试剂就自我清除而言总体表现较好且实现自循环清除抗体。CA注射之间三周的重复治疗证明是可行的，没有使

实施例20：清除剂的肿瘤渗透(方案85)

清除剂的肿瘤渗透是PRIT方案的一个潜在问题，因为渗透性DOTAM结合的CA片段会与

研究设计，方案85

*注射体积100μL

方案85中的研究组(n

对每只小鼠(7周龄)在100μL RPMI/Matrigel中皮下注射BxPC3细胞(传代33)入右体侧。在肿瘤细胞注射之后五天，将小鼠分入实验组，平均肿瘤体积为200mm

清除剂基于20，70，或500kDa的右旋糖酐尺寸，具有不同TCMC取代。CDex500-(Glu)4基于具有负净电荷的加帽的(即具有过量胺的中和)右旋糖酐-500(CDex)；Dex500-M(Glu)2具有单版本Glu(M(Glu))和中性至略微正净电荷。在PRIT-0165之后三天静脉内施用所有，30μg每100μL。G组接受PBS代替清除剂。

在注射

候选中的三种展示很少的肿瘤摄取或无肿瘤摄取：Dex20(0.26±0.03％ID/g)，Dex70(4.06±2.06％ID/g)，和CDex500-(Glu)4(2.98±0.73％ID/g)，指示CA广泛渗透入肿瘤。与之对比，Dex500-M(Glu)2在肿瘤(69.39±9.70％ID/g)和血液(20.68±1.22％ID/g)二者中导致高放射性，水平与PBS对照的那些(在肿瘤和血液中分别是59.02±15.53和27.92±2.38％ID/g)相似，解读为bsAb清除失败。Dex500展示放射性在肿瘤中的可观积累(20.78±3.76％ID/g)，指示很少的肿瘤渗透，而血液清除是本质上完全的(0.17±0.01％ID/g)。尽管如此，无CA对照实现的肿瘤摄取指示Dex500批次中还存在某种程度的低分子量(MW)DOTAM-右旋糖酐片段。

图14显示在注射

这项实验确认了低分子量CA种类的存在可能实质性干扰

实施例21：用于Dex500的清除剂制造工艺

在含0.1M Na

在含0.1M AcOH的H

所得清除剂是被多个下文示意性显示的形式的Pb-DOTAM模块取代的：

实施例22：清除剂剂量对肿瘤积累(方案90)

这项研究旨在调查在皮下肿瘤模型中清除剂剂量对肿瘤积累的影响，假设较高量的清除剂能导致较高程度的清除剂渗透入肿瘤，由此通过封闭肿瘤结合性双特异性抗体的DOTAM结合臂降低随后对标记的螯合物的摄取。然而，由于循环中较高水平的DOTAM结合性双特异性抗体，太低的剂量会导致不太有效的肿瘤相关放射性的积累。

另外，在清除剂批次之间进行比较，它们经过渗滤以去除低分子量成分，截留位于30或100kDa，试图降低DOTAM结合的右旋糖酐片段的肿瘤渗透。

研究设计，方案90

*注射体积100μL

在与

以30或100μg每100μL的浓度静脉内注射PRIT-0165，4天后继以10，25，30，50，或100μg每100μL浓度的清除剂(A-F组)。在CA之后2小时注射

在注射

对于所有施用清除剂的组，正常组织中的

生物分布数据证明改变清除剂(100kDa截留)的量的影响。个体肿瘤数据的线性回归产生显著的斜率，指示随着Dex500的量降低，肿瘤摄取升高(p＝0.03，R

两个组以相等(1∶1)比接受PRIT-0165和Dex500；每种药剂100或30μg。所得肿瘤中的％ID/g在两个组之间没有显著不同(未配对t检验，p＝0.726)。重要的是，相等量的具有不同过滤截留的Dex500之间的比较显示使用更高MW截留时肿瘤积累的显著增益：54.9±6.9代替32.5±4.4％ID/g(未配对t检验，p＝0.009)。

图15显示在注射放射性标记的DOTAM之后24小时的

图16显示随着递增量的清除剂(0-100μg)血液和肿瘤中

研究证明

实施例23：对肿瘤相关放射性的影响(方案95)

在这项研究，就抑制

研究设计，方案95

*注射体积100μL

方案95中的研究组(n

通过在与

静脉内施用PRIT-0165(100μg每100μL)，3天后继以具有不同TCMC取代(10-100％)的基于右旋糖酐-500的清除试剂(10-170μg每100μL)。J和K组接受PBS代替清除剂。2小时后，对小鼠静脉内注射100μL相应

在注射

生物分布数据揭示在

图17显示在注射

具有用于多重比较的校正的单向ANOVA揭示了只有Dex500-(40％)(76.79±33.28，p＜0.0001)和Dex500-(100％)(43.26±24.66，p＝0.0115)就肿瘤对血液比而言显著不同于10μCi阴性对照(2.26±0.25)。具有最高肿瘤对血液比的清除试剂(Dex500-(40％))和先前的标准品(Dex500-(100％))之间感知的差异在统计学上不显著(未配对t检验，p＝0.2336)。

图18显示在注射

实施线性回归和多项式(三次)曲线拟合以分析来自提高清除剂(Dex500-(10％))量和TCMC载荷(无CA，Dex500-(10％)，Dex500-(20％)，Dex500-(40％)，Dex500-(100％))对肿瘤对血液比的影响。线性曲线的斜率统计学上显著(p＜0.0001)有利于更大量的Dex500-(10％)来提高肿瘤对血液比，而对于注射的某个量的TCMC，基于100μg Dex500-(10％)，在60左右的TCMC对Dex500比时指示最大值。重要的是要注意，不应脱离它们的背景来考虑这些结果以生成关于试剂量或TCMC饱和的一般结论；它们仅仅对应用的设置有效。

图19显示在注射

最终的检验比较10与30μCi

总之，在施用

实施例24：双特异性抗体剂量对肿瘤积累的影响(方案91)

这项研究旨在调查在皮下肿瘤模型中双特异性抗体剂量对肿瘤积累的影响。假设是较高量的双特异性抗体能更加容易地饱和肿瘤细胞上的可用结合位点，由此提高随后标记的螯合物的摄取。另一方面，由于较高水平的循环双特异性抗体，过度提高剂量可能导致不太有效的肿瘤相关放射性积累。

研究设计，方案91

*注射体积100μL

通过在与

对小鼠静脉内施用30-200μg每100μL浓度的CEA结合性双特异性抗体PRIT-0165或PRIT-0156，或100μg非CEA结合性对照抗体PRIT-0175。4天后，对所有组静脉内注射3，10，或20μg每100μL浓度的清除剂(注射的抗体剂量的1/10)，2小时后继以10μCi

使用100μg任一CEA结合性双特异性抗体的预靶向导致与100μg非CEA结合对照相比

图20显示在注射放射性标记的DOTAM之后24小时

对于测试的两种双特异性构建物二者，所有三种抗体剂量水平(30，100，和200μg)均导致较高的，特异性的肿瘤中放射性的摄取。剂量升高时肿瘤积累没有差异指示结合位点在较低剂量早就饱和，或者PRIT施用和清除剂注射之间的时间(4天)太短，无法容许进一步肿瘤积累。正如预期的，血液中的放射性水平随提高剂量而升高，略微缩小治疗的治疗性窗口。

实施例25：CEA-PRIT的功效(方案93(a，b))

在这项研究中，在两种平行皮下肿瘤模型(BxPC3和LS174T)中评估使用两种临床bsAb候选(PRIT-0213和PRIT-0214)的CEA-PRIT的功效。在单和双周期治疗方案中并排比较双特异性抗体。

研究设计，方案93a(BxPC3)

*注射体积100μL

研究设计，方案93b(LS174T)

*注射体积100μL

A-G组代表接受治疗，为了评估功效而跟踪的小鼠，而H-L组包含在它们的最后一次

方案93a中的研究组(BxPC3；n

方案93b中的研究组(LS174T；n

通过在与

对于方案93a，对小鼠(7周龄)在100μL RPMI/Matrigel中皮下注射5x10

对于方案93b，对小鼠(9周龄)在100μL DMEM/Matrigel中皮下注射1x10

每个治疗周期始于注射人源化bsAb(PRIT-0213，PRIT-0214，或PRIT-0175)。4天后，施用清除剂(Dex500)，2小时后继以

经由一周三次重复测径来跟踪小鼠中的肿瘤发展。如果需要，在安排的测量之间的间隙实施另外的测径。以相同的方式重复测量动物的体重。对其肿瘤体积达到3000mm

在安乐死时自A-G组收获下面的器官和组织：膀胱，卵巢，肝，脾，肾，股骨(包括骨髓)，结肠，空肠，胃，和肿瘤。记录意外的或异常的状况并拍照。立即将组织放置在10％中性缓冲福尔马林中(4℃)，然后在5天之后转移至PBS(4℃)。然后将福尔马林固定样品运输至Roche Pharma Research and Early Development，Roche Innovation Center Basel，进行进一步加工和分析。

在它们第一次且唯一一次注射

在治疗周期1之后的结果较好地对应于先前在这种模型中实现的组织摄取，具有高肿瘤积累(PRIT-0213和PRIT-0214分别是25.0±9.7和19.5±6.4％ID/g)和正常组织中的低积累。然而，周期2导致不同的

图21显示在BxPC3模型中对于治疗周期1和2在注射

注射30μCi

图22显示在BxPC3模型中在CEA-PRIT之后A-G组的平均体重(n＝8)。在每个组中在第一例死亡处截断曲线。垂直点线指示一些或所有组的

图23显示在BxPC3模型中在CEA-PRIT之后A-G组的平均重量变化(n＝8)，表述为初始体重的百分比。在每个组中在第一例死亡处截断曲线。垂直点线指示一些或所有组的

所有组它们的肿瘤体积到第14-19天与基线相比加倍。在第16天给予第一次

在第47天，仍然代表所有治疗组的最后一天，“PRIT-0213，30+10μCi”，“PRIT-0213，30+30μCi”，“PRIT-0214，30+10μCi”，“PRIT-0214，30+30μCi”，“PRIT-0175，30+30μCi”，和“DOTAM单独，30+30μCi”组与PBS相比的肿瘤生长抑制(TGI)分别为87.3，88.8，84.1，88.7，57.5，和15.8％。媒介对照组中的最后一只小鼠在第66天出现，当时剩余三个组的TGI分别为87.8，84.5，和87.3％：“PRIT-0213，30+10μCi”，“PRIT-0214，30+10μCi”，和“PRIT-0214，30+30μCi”。总共6只小鼠存活直至实验结束(第84天)：一只来自“PRIT-0213，30+10μCi”组，三只来自“PRIT-0214，30+10μCi”组，而两只来自“PRIT-0214，30+30μCi”组。

图24显示在BxPC3模型中A-G组的肿瘤生长平均值及标准误差(n＝8)。在每个组中在第一例死亡处截断曲线。垂直点线指示一些或所有组的

图25显示在BxPC3模型中A-G组的个体肿瘤生长曲线。垂直点线指示

图26显示Kaplan-Meier曲线，显示在BxPC3模型中A-G组的存活(n＝8)。垂直点线指示

实施成对检验以规定哪些组就存活而言显著不同：对数秩检验(较晚的存活事件的权重更大)，和Wilcoxon检验(早期存活时间的权重更大)，均使用多重检验的Bonferroni校正。由于辐射诱导的毒性，“PRIT-0213，30+30μCi”表现与对照组相比相同或更差。相应的PRIT-0214治疗实现略微更好的结果，与PBS和非特异性抗体相比提高存活。在第二个周期中用10μCi

两个治疗周期均导致高

图27显示在LS174T模型中对于治疗周期1和2在注射

所有注射

图28显示在LS174T模型中在CEA-PRIT之后A-G组中的平均体重(n＝8)。在每个组中在第一例死亡处截断曲线。垂直点线指示一些或所有组的

图29显示在LS174T模型中在CEA-PRIT之后A-G组中的平均重量变化(n＝8)，表述为初始体重的百分比。在每个组中在第一例死亡处截断曲线。垂直点线指示一些或所有组的

在第8天给予第一次

在第22天，仍然代表所有治疗组的最后一天，“PRIT-0213，30μCi”，“PRIT-0213，30+30μCi”，“PRIT-0214，30μCi”，“PRIT-0214，30+30μCi”，“PRIT-0175，30+30μCi”，和“DOTAM单独，30+30μCi”组与PBS相比的TGI分别为83.1，88.8，87.5，91.0，53.0，和64.7％。媒介对照组中的最后一只小鼠在第30天出现，当时剩余“PRIT-0213，30μCi”，“PRIT-0213，30±30μCi”，“PRIT-0214，30μCi”，“PRIT-0214，30+30μCi”，和“PRIT-0175，30+30μCi”组的TGI分别为92.5，89.5，90.8，92.6，和79.9％。两只小鼠存活直至实验结束(第101天)，二者均来自“PRIT-0214，30+30μCi”组。

图30显示在LS174T模型中A-G组的肿瘤生长平均值及标准误差(n＝8)。在每个组中在第一例死亡处截断曲线。垂直点线指示一些或所有组的

图31显示在LS174T模型中A-G组的个体肿瘤生长曲线。垂直点线指示

图32显示Kaplan-Meier曲线，显示在LS174T模型中A-G组的存活(n＝8)。垂直点线指示

实施具有Bonferroni校正的对数秩和Wilcoxon检验以规定哪些组就存活而言显著不同。关键的发现是“PRIT-0214，30+30μCi”与所有组相比显著提高存活，除了“PRIT-0213，30μCi”。然而，“PRIT-0213，30+30μCi”组的总体存活与“PRIT-0213，30μCi”没有显著不同，因而与“PRIT-0214，30+30μCi”只有略微不同。

使用两种双特异性抗体PRIT-0213和PRIT-0214任一，有一个或两个治疗周期的CEA-PRIT对于两种研究的肿瘤模型均导致显著肿瘤生长抑制和存活提高。BxPC3研究中意外的第二周期

最后，对肿瘤生长背后的潜在机制的研究极感兴趣，以澄清为什么，尽管它们的生长受到明显抑制，肿瘤没有完全消退，而是改为在某个量的时间之后开始再生长。

实施例26：清除剂剂量(方案105)

在这项研究中，就对

研究设计，方案105

*注射体积100μL

方案105中的研究组(n

通过在与

静脉内施用CEA-PRIT(100μg每100μL)，3天后继以Dex500-(50％)(5-250μg每100μL)。F组接受PBS代替清除剂。2小时后，对小鼠静脉内注射100μL

在注射

图33显示在注射

图34显示在注射

基于实现的肿瘤中的

实施例27：基于右旋糖酐-500的清除剂在血液中的停留时间(方案106)

在这项研究中，就血液中的停留时间而言评估具有50％TCMC饱和的基于右旋糖酐-500的清除剂。目的是鉴定对于重复治疗合适的时间框(1-4周)，确保循环中剩余很少或无清除剂能结合施用的双特异性抗体，有效阻断随后注射的放射性标记的DOTAM的结合。

研究设计，方案106

*注射体积100μL

方案106中的研究组(n

对小鼠(9周)静脉内施用CEA-PRIT(100μg每100μL)，1天后继以Dex500-(50％)(25μg每100μL)。B，D，F，和H组接受PBS代替清除剂。1，2，3，或4周后对小鼠静脉内再注射CEA-PRIT(100μg每100μL)，1天后继以100gL

在注射

对于任一研究时间点接受Dex500-(50％)或PBS的小鼠之间平均放射性含量没有统计学显著差异(单向ANOVA，Sidak氏多重比较检验，p＞0.05)。

图35显示在注射

结果显示在最后一次注射Dex500-(50％)之后一周就可以启动重复CEA-PRIT治疗周期，不会阻断随后施用的

实施例28：双特异性抗体的另外的型式

通过瞬时转染人胚胎肾细胞(HEK 293)来表达期望的蛋白质。为了表达期望基因/蛋白质(例如全长抗体重链，全长抗体轻链，或含有另外的域(例如在它的C端的免疫球蛋白重或轻链可变域)的全长抗体重链)，使用包含下面的功能性元件的转录单元：

-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子(P-CMV)，包括内含子A，

-人重链免疫球蛋白5’非翻译区(5’UTR)，

-鼠免疫球蛋白重链信号序列(SS)，

-要表达的基因/蛋白质，和

-牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH pA)。

在包括要表达的期望基因的表达单元/盒以外，基础/标准哺乳动物表达质粒含有

-来自载体pUC18的复制起点，其容许这种质粒在大肠杆菌中复制，和

-β-内酰胺酶基因，其赋予大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性。

P1AE1766

通过将编码通过G4Sx4接头彼此分开的相应序列元件的DNA片段融合至人IgG分子的CH3域的C端来组装包括C端融合基因，包含完整和功能性抗体重链，继以另外的抗体VL-CH1或VH-Cκ域的抗体重链编码基因(VH-CH1-铰链-CH2-CH3-接头-VL-CH1或VH-CH1-铰链-CH2-CH3-接头-VH-Ck)。使用节-入-穴技术表达在两个CH3域的C端分别承载一个VL-CH1和一个VH-Ck域的重组抗体分子。

通过融合编码相应序列元件的DNA片段来组装包含完整和功能性抗体轻链的抗体轻链编码基因。

通过使用节-入-穴技术来组装包含靶向CEA或DOTAM的完整和功能性抗体重链的抗体重链编码基因。

通过融合编码相应序列元件的DNA片段来组装包含完整和功能性抗体轻链的抗体轻链编码基因。使用CrossMab技术(为臂之一交换CL和CH1域)确认正确联合。

通过将编码VH-CH1域的DNA片段经由G4Sx4接头融合至含有VL域交换VH域的人IgG分子的VL域的N端来组装融合基因(如此，生成编码结构VH-CH1-接头-VL-CH1-铰链-CH2-CH3的融合基因)。使用节-入-穴技术表达在N端分别承载一个VH-CH1和无融合的重组抗体分子。

通过融合编码相应序列元件的DNA片段来组装包含完整和功能性抗体轻链的抗体VH-Cκ编码基因。

通过融合编码相应序列元件的DNA片段来组装包含完整和功能性抗体轻链的抗体轻链编码基因。

使用CrossMab技术确认正确联合。

通过将编码通过G4Sx4接头彼此分开的相应序列元件的DNA片段融合至人IgG分子的CH3域的C端来组装包括C端融合基因，包含完整和功能性抗体重链，继以另外的抗体V-轻-CH1域的抗体重链编码基因(VH-CH1-铰链-CH2-CH3-接头-VL-CH1)。使用节-入-穴技术表达在两个CH3域的C端分别承载一个VL-CH1和无融合的重组抗体分子。

通过融合编码相应序列元件的DNA片段来组装包含完整和功能性抗体轻链的抗体VH-Cκ编码基因。

通过融合编码相应序列元件的DNA片段来组装包含完整和功能性抗体轻链的抗体轻链编码基因。

使用CrossMab技术确认正确联合。

通过将编码通过G4Sx4接头彼此分开的相应序列元件的DNA片段融合至人IgG分子的CH3域的C端来组装包括C端融合基因，包含完整和功能性抗体重链，继以另外的抗体V-轻-Cκ-接头-V-重-CH1域的抗体重链编码基因(VH-CH1-铰链-CH2-CH3-接头-VL-Ck-接头-VH-CH1)。使用节-入-穴技术表达在两个CH3域的C端分别承载一个单链Fab和无融合的重组抗体分子。

通过融合编码相应序列元件的DNA片段来组装包含完整和功能性抗体轻链的抗体轻链编码基因。

在F17培养基(Invitrogen Corp.)中培养的瞬时转染的HEK293细胞(人胚胎肾细胞系293衍生的)中生成抗体分子。为了转染，使用″无293″转染试剂(Novagen)。自各个表达质粒表达如上文描述的相应抗体重和轻链分子。如制造商的说明书规定的那样实施转染。在转染之后三至七(3-7)天收获含有免疫球蛋白的细胞培养物上清液。将上清液贮存于低温(例如-80℃)直至纯化。

关于例如HEK293细胞中的人免疫球蛋白的重组表达的一般信息见Meissner，P.etal.，Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203。

通过MabSelect Sure(亲和层析)并继以Superdex 200(大小排阻层析)来纯化分子。

为了详细分析亲和力测定，使用Kinexa。

使用带有自动进样器的来自Sapidyne Instruments(Boise，ID)的KinExA 3200仪器。聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)珠购自Sapidyne，而PBS(磷酸盐缓冲盐水)，BSA(牛血清清蛋白级分V)和抗DOTAM抗体是内部制备的(Roche)。

依照用于生物素化分子的KinExA手册方案(Sapidyne)包被PMMA珠。简言之，首先，珠的每个管(200mg)添加1ml PBS(pH 7.4)中的10μg生物素-BSA(Thermo Scientific)用于吸附包被。于室温旋转2小时后，去除上清液并用1ml PBS清洗珠5次。其次，将1ml含有10mg/ml BSA的PBS中的100μg中性亲合素生物素结合蛋白(Thermo Scientific)添加至珠并于室温温育另外2小时以将中性亲合素偶联至珠及提供另外的生物素结合位点用于随后生物素化蛋白质结合。然后用1ml PBS漂洗中性亲合素包被的珠5次。最后，用PBS中的200ng/ml生物素化Pb-DOTAM-异构体混合物(每种异构体50ng)包被珠并于室温进一步温育2小时。然后在30ml PBS中重悬浮珠并立即使用。

使用PBS pH 7.4作为运行缓冲液于室温(RT)实施所有KinExA实验。在补充有1mg/ml BSA的运行缓冲液(“样品缓冲液”)中制备样品。使用0.25ml/min的流速。通过始于100pM的两倍系列稀释(浓度范围0.049pM-100pM)用Pb-DOTAM抗原滴定具有5pM结合位点浓度的恒定量的抗DOTAM抗体。没有抗原的抗体的一份样品充当100％信号(即没有抑制)。将抗原-抗体复合物于室温温育至少24小时以容许达到平衡。然后以5ml的体积使平衡的混合物通过KinExA系统中Pb-DOTAM偶联珠的柱，允许由珠捕捉未结合的抗体，没有扰乱溶液的平衡状态。使用样品缓冲液中的250ng/ml

使用“标准分析”方法使用KinExA软件(版本4.0.11)内含有的单位点同质结合模型自数据的非线性回归分析获得KD。通过将数据点拟合理论KD曲线，该软件计算KD并确定95％置信区间。作为KD低和KD高给出95％置信区间(Sapidyne TechNote TN207R0)。

所有构建物的KD是相当的，因为置信区间交叠。

不同型式的分子的序列：

任选电荷修饰以粗体和下划线显示：EQ-＞RK，或KK-＞EEP1AE1766

＞CEA轻链RK

＞CEA重链及DOTAM VL/CH1

＞CEA重链及DOTAM VH/CK

P1AE1767

＞DOTAM“LC”及VH/CK

＞CEA轻链RK

＞CEA重链及DOTAM VL/CH1

＞CEA重链

P1AE1768

＞CEALC

＞DOTAM重链及VL/CH1

＞CEA重链

＞DOTAM“LC”VH/CK

P1AE1769

DOTAM“LC”及VH/CK

＞CEALC

＞CEA HC及CEA VH/CH1/DOTAM VL/CH1

＞CEAHC

P1AE1770

＞CEALC

＞CEA HC及DOTAM scFab：DOTAM VL/Ck/接头/VH/CH1

＞CEAHC

实施例29：结合Pb-DOTAM和CD20或Her2的双特异性抗体

通过瞬时转染人胚胎肾细胞(HEK 293)来表达期望的蛋白质。为了表达期望基因/蛋白质(例如全长抗体重链，全长抗体轻链，或含有另外的域(例如在它的C端的免疫球蛋白重或轻链可变域)的全长抗体重链)，使用包含下面的功能性元件的转录单元：

-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子(P-CMV)，包括内含子A，

-人重链免疫球蛋白5’非翻译区(5’UTR)，

-鼠免疫球蛋白重链信号序列(SS)，

-要表达的基因/蛋白质，和

-牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH pA)。

在包括要表达的期望基因的表达单元/盒以外，基础/标准哺乳动物表达质粒含有

-来自载体pUC18的复制起点，其容许这种质粒在大肠杆菌中复制，和

-β-内酰胺酶基因，其赋予大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性。

通过将编码通过G4Sx4接头彼此分开的相应序列元件的DNA片段(V-重或V-轻)融合至人IgG分子的CH3域的C端来组装包括C端融合基因，包含完整和功能性抗体重链，继以另外的抗体V-重或V-轻域的抗体重链编码基因(VH-CH1-铰链-CH2-CH3-接头-VH或VH-CH1-铰链-CH2-CH3-接头-VL)。使用节-入-穴技术表达在两个CH3域的C端分别承载一个VH和一个VL域的重组抗体分子。

在具有C端VH或VL域的抗体重链片段的表达盒以外，用于在HEK293细胞中瞬时表达具有C端VH或VL域的抗体重链的表达质粒包含容许这种质粒在大肠杆菌中复制的来自载体pUC18的复制起点，和赋予大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。具有C端VH或VL域融合基因的抗体重链片段的转录单元包含下面的功能性元件：

-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子(P-CMV)，包括内含子A，

-人重链免疫球蛋白5’非翻译区(5’UTR)，

-鼠免疫球蛋白重链信号序列，

-抗体重链(VH-CH1-铰链-CH2-CH3-接头-VH或VH-CH1-铰链-CH2-CH3-接头-VL)编码核酸，和

-牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH pA)。

具有C端VH或VL域融合蛋白的成熟抗体重链片段的氨基酸序列是

通过融合编码相应序列元件的DNA片段来组装包含完整和功能性抗体轻链的抗体轻链编码基因。

在抗体轻链片段以外，用于瞬时表达抗体轻链的表达质粒包含容许这种质粒在大肠杆菌中复制的来自载体pUC18的复制起点，和赋予大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。抗体轻链片段的转录单元包含下面的功能性元件：

-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子(P-CMV)，包括内含子A，

-人重链免疫球蛋白5’非翻译区(5’UTR)，

-鼠免疫球蛋白重链信号序列，

-抗体轻链(VL-CL)编码核酸，和

-牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH pA)。

在F17培养基(Invitrogen Corp.)中培养的瞬时转染的HEK293细胞(人胚胎肾细胞系293衍生的)中生成抗体分子。为了转染，使用″无293″转染试剂(Novagen)。自各个表达质粒表达如上文描述的相应抗体重和轻链分子。如制造商的说明书规定的那样实施转染。在转染之后三至七(3-7)天收获含有免疫球蛋白的细胞培养物上清液。将上清液贮存于低温(例如-80℃)直至纯化。

关于例如HEK293细胞中的人免疫球蛋白的重组表达的一般信息见Meissner，P.etal.，Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203。

通过MabSelect Sure(亲和层析)并继以Superdex 200(大小排阻层析)来纯化PRIT分子。

为了确认PRIT分子的同一性，使用ESI-MS。

为了评估P1AD8927的功能性，于37℃使用accutase达10分钟，自培养器皿解离KPL-4细胞。随后，在PBS中清洗细胞两次，并接种入96孔v底板至4x10

用Zenon<人IgG>A488预标记抗体，以图38中所示浓度添加至细胞。随后，将细胞在冰上温育1小时并在PBS中清洗两次并在200μl PBS/5％FCS中重悬浮，用于使用FACS canto测量FITC荧光。

结果在图38中显示。

为了评估抗体对DOTAM的结合能力，在结合KPL-4细胞之后，清洗细胞以去除未结合的抗体。随后，添加Pb-DOTAM-FITC以检测DOTAM结合胜任细胞结合的抗体(图39)。P1AD8927显示同种型校正的剂量依赖性FITC信号。这项实验显示DOTAM结合在这种抗体中是功能性的。

为了评估P1AD8926的功能性，在PBS中清洗Raji细胞两次，并接种入96孔v底板至4x10

用Zenon<人IgG>A488预标记抗体，以图40中所示浓度添加至细胞。随后，将细胞在冰上温育1小时并在PBS中清洗两次并在200μl PBS/5％FCS中重悬浮，用于使用FACS canto测量FITC荧光。

为了评估抗体对DOTAM的结合能力，在结合Raji细胞之后，清洗细胞以去除未结合的抗体。随后，添加Pb-DOTAM-FITC以检测DOTAM结合胜任细胞结合的抗体(图41)。P1AD8927显示同种型校正的剂量依赖性FITC信号。这项实验显示DOTAM结合在这种抗体中是功能性的。

实施例30：实施例31至37的材料和方法

这个实施例列出用于实施例31-37的研究的材料和方法。

步骤1：施用BsAb(静脉内或腹膜内)：研究中使用的BsAb以高亲和力结合Pb-DOTAM并例如经由CEA靶向肿瘤。

步骤2：施用CA(静脉内或腹膜内)：为了容许

步骤3：施用

在ARCoLab实施的实验方案得到地方当局(Comité Régional d’Ethique de 1’Expérimentation Animale du Limousin(CREEAL)，Laboratoire Départemental d’Analyses et de Recherches de la Haute-Vienne)的审查和批准。重度合并免疫缺陷(SCID)和CD1小鼠由Charles River提供并遵照道德准则以光明和黑暗(12小时/12小时)的日周期在无特定和机会性病原体(SOPF)下维持。研究121采用无特定病原体(SPF)条件，小鼠由Envigo提供。在到达后头5天期间没有实施操作以容许动物适应新环境。每天对所有小鼠掌握临床症状和不良事件检测。

通过在与

为了最小化放射性尿液/粪便的再摄入，在

每周至少3次测量研究动物的体重(BW)，在需要时有另外的测量，取决于健康状况。立即对体重损失超过它们的初始体重的25％或肿瘤体积达到3000mm

在终止时使用眶后取血自静脉窦收集血液，继以另外的组织收获用于放射性测量和/或组织学分析，按照方案进行。记录意外或异常状况。将为福尔马林固定收集的组织立即放置在10％中性缓冲的福尔马林中(4℃)，然后在5天之后转移至磷酸盐缓冲盐水(PBS；4℃)。对为了生物分布目的收集的器官和组织称重并使用2470WIZARD

使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software，Inc.)和JMP 8(SAS InstituteInc.)实施统计学分析。使用公式基于均值肿瘤体积实施肿瘤生长抑制(TGI)的曲线分析：

其中d指示治疗日而0指示基线值。选择媒介(PBS)作为参照组。依照公式计算肿瘤消退(TR)：

其中正值指示肿瘤消退，而低于-1的值生长超过两倍基线值。

实施成对检验以规定哪些组就存活而言显著不同：对数秩检验(较晚的存活事件的权重更大)，和Wilcoxon检验(早期存活时间的权重更大)，均使用多重检验的Bonferroni校正。

所描述的研究中利用的化合物在下文标题为“双特异性抗体”，“清除剂”，和“放射性标记的螯合物”的表格中呈现。

CEA-DOTAM(PRIT-0213)是一种靶向CEA的T84.66表位的完全人源化BsAb，而DIG-DOTAM(PRIT-0175)是一种非CEA结合性BsAb，用作阴性对照。P1AE1766，P1AE1767，P1AE1768，P1AE1769，和P1AE1770是靶向CEA的CH1A1A表位的人源化CEA-DOTAM BsAb，如上文实施例28中描述的。抗体构建物贮存于-80℃直至注射日，那时融化它们并在标准媒介缓冲液(20mM组氨酸，140mM NaCl；pH 6.0)或0.9％NaCl中稀释至它们的相应终浓度，用于静脉内(i.v.)或腹膜内(i.p.)施用。

Ca-DOTAM-右旋糖酐-500和Pb-DOTAM-右旋糖酐-500CA贮存于-20℃直至注射日，那时融化它们并在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释，用于静脉内或腹膜内施用。

用于放射性标记的DOTAM螯合物由Macrocyclics提供并在放射性标记之前维持于-20℃。通过在标记之后用DOTAM自钍发生器洗脱，随后用Cu，Ca，Zn，Gd，或Pb淬灭来生成

媒介对照组中的小鼠接受多次注射PBS代替BsAb，CA，和

双特异性抗体

清除剂

放射性标记的螯合物(供应商：Orano Med)

使用的肿瘤细胞系和用于小鼠中接种的注射量在下文表格“肿瘤细胞系”中描述。BxPC3是一种天然表达CEA的人原代胰腺腺癌细胞系。在富含10％胎牛血清(GE HealthcareHyclone SH30088.03)的RPMI-1640培养基，GlutaMAX

肿瘤细胞系

*欧洲认证细胞培养物保藏中心(Salisbury，UK)

**美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA，USA)

***莱布尼兹研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏中心(Braunschweig，Germany)

研究

实施例31：CEA-PRIT在肿瘤模型中的功效(方案103)

这项研究评估使用CEA-DOTAM BsAb的CEA-PRIT治疗小鼠中的皮下BxPC3肿瘤的功效。或是作为10或30μCi

方案103的时间过程和设计在下文表中显示。

方案103的时间过程

方案103中的研究组

通过在RPMI/Matrigel中皮下注射5x10

由于后勤原因，在2天过程期间开始治疗，在第一天C，D，E，F，G，J，K，和L组注射BsAb或PBS，如上文表中描述的，继以在次日A，B，H，和I组注射BsAb。4天后，注射CA，2小时后继以

在它们的第一次和唯一一次注射

注射后24小时

平均肿瘤发展和个体肿瘤生长曲线分别在图44和图45显示。所有组它们的肿瘤体积到第20-24天加倍。在第24天给予第一次

在第63天，能基于均值分析所有治疗组的最后一天，A，B，C，D，E，和F组与无治疗相比的TGI分别是57.2，89.8，77.7，96.6，-6.2，和67.3％。媒介对照组中的最后一只小鼠在第74天出现，那时剩余四个组(A，B，C，和D)的TGI分别是48.5，83.3，63.5，和95.7％。通过对最后一只剩余小鼠处以安乐死(组D)，在细胞注射之后在第118天终止研究。

实施对数秩和Wilcoxon检验以规定哪些组就存活而言显著不同，结果在下文两表中显示。所有CEA-DOTAM PRIT方案与三个对照组相比显著提高存活。总体存活在3个周期的10μCi之后比在单个10μCi周期之后略微更好(p＝0.0110)，但是3个周期的10μCi和具有CEA-DOTAM预靶向的任一30μCi方案之间没有显著差异。Kaplan-Meier存活曲线在图46中显示。

出于伦理原因促使处死小鼠的观察到的不良事件可以分成两组：1)肿瘤状态，和2)放射诱导的毒性。第一个指坏死性和/或溃疡性肿瘤，促使小鼠自己或它们的同笼同伴“清理”肿瘤区域。立即对达到这个阶段的小鼠处以安乐死以避免受苦。

第二组不良事件包含放射诱导的毒性的典型症状，例如体重损失，腹泻，和嗜睡。图47显示疗法组中的体重发展。所有注射30μCi

我们得出结论，作为单药疗法方案给予时，用10或30μCi

实施例32：用于CEA-PRIT的BsAb和CA注射之间适宜时间的选择(方案116和121)

方案116和121设计成指导基于高肿瘤摄取和均质肿瘤内BsAb分布选择用于CEA-PRIT的BsAb和CA注射之间适宜时间。方案116评估在静脉内注射之后第4，7，和14天在BxPC3模型中与CEA表达相比肿瘤内BsAb分布，通过免疫荧光染色来检测。方案121评估在1，4，7，和10天之后BxPC3肿瘤中用铅-203(

方案116和121的时间过程和设计在下文四表中显示。

方案116的时间过程

方案116中的研究组

*

方案121的时间过程

方案121中的研究组

经由皮下注射BxPC3细胞来建立固体异种移植物。在接种之后19天，将方案116中的小鼠分入实验组，平均肿瘤体积为227mm

在安乐死之后对方案116中的小鼠尸检，并收获脾，肾，肝，肌肉，和肿瘤。将收集的组织分成两块：将一块放入装有

用于方案116中的组织学染色的试剂

使用Leica CM1850 UV冷冻切片机将冷冻肿瘤切成12μm切片，并将切片保存于-20℃。在染色之前，将切片于室温(RT)融化1小时，然后用PBS(1X，pH 7.4)清洗5分钟，继以在冷丙酮(-20℃)中5分钟，和再多一次用PBS清洗5分钟。用一张纸在组织周围干燥载片，并使用疏水笔(Dako；Agilent)在组织周围画一个圈。用400μL封闭血清(山羊)于室温实施切片温育1小时期间。去除封闭血清并将200μL一抗(家兔IgG抗人CEA)添加至切片，继以在暗室中于4℃温育过夜。在第2天，将切片用PBS清洗两次达10分钟，并添加400μL封闭血清。在于室温温育1小时期间之后，去除封闭血清并将200μL二抗(Alexa Fluor 488标记的山羊抗家兔IgG)和复染剂(Hoechst)添加至切片，继以在暗室至于室温温育2小时。然后将切片用PBS清洗两次达10分钟。最后，将荧光封固介质(Dako S3023；Agilent)和盖片添加至载片，随后风干并在黑暗中保存于-20℃。使用Zeiss Axio Scope.A1模块化显微镜实施染色载片的分析。

针对CEA-DOTAM的染色

如上文关于CEA染色所述保存和加工冷冻肿瘤切片，但是用PBS代替一抗。二抗是用Alexa Fluor 555标记的山羊抗人IgG。

H&E染色

使用Leica Autostainer XL自动化载片染色仪实施来自方案116的冷冻肿瘤切片的苏木精和曙红(H&E)染色。

生物分布

在终止之前为了生物分布目的处死方案121中的小鼠并经由眶后取血收集它们的血液。另外，在安乐死之后收获膀胱，小肠，结肠，脾，胰，肾，胃，肝，肺，心，脑，股骨，肌肉，皮肤，尾，和肿瘤并测量放射性。

免疫荧光染色-方案116

未治疗的对照展示在收集的肿瘤中均匀分布的高水平的CEA。正如预期的，针对CEA-DOTAM BsAb的对照染色导致无信号。

在注射后4，7，和14天采集来自注射CEA-DOTAM BsAb的小鼠的肿瘤。在4天时，BsAb完全覆盖组织内肿瘤细胞结节的边界，但是尚未完全渗透入较大的结节。这是通过由亮红色边界细胞层围绕的较暗Hoechst染色区域的存在显示的。在7天后，来自CEA-DOTAM染色的信号表现为更加均质分布，而且有更少的肿瘤细胞结构有暗的内部区域。一周后，注射后14天，荧光信号的分布仍然与7天时间点相似，但是总体信号较低。

来自施用整个PRIT周期，包括用

生物分布-方案121

BxPC3荷瘤SCID小鼠中的平均

使用Sidak氏多重比较检验通过单向方差分析(ANOVA)实施统计学分析，以评估不同时间点时肿瘤摄取中觉察的差异是否显著。依照该检验，仅仅在第1和7天，和第1和10天之间实现

结果显示在注射之后4和7天之间肿瘤中203Pb-BsAb摄取的总体升高，但是当将时间间隔延长至10天时没有实现进一步改善。在显微镜下，BsAb渗透入肿瘤在7天之后与4相比改善。在14天时间点时没有看到益处，到那时总体荧光信号看来降低，没有改善肿瘤内分布。该研究支持选择7天的BsAb-CA时间间隔胜过4天。

实施例33：生物分布(用于估算肿瘤和正常组织吸收的放射性剂量的体内

方案146设计成提供在携带皮下BxPC3肿瘤的SCID小鼠中在PRIT之后的体内

通过注射CEA-DOTAM BsAb来实施预靶向，7天后继以CA。24小时后，施用

方案146的时间过程和设计在下文两表中显示。

方案146的时间过程

方案146中的研究组

通过皮下注射BxPC3细胞入8周龄SCID小鼠(Envigo)来建立固体异种移植物。在接种之后28天，将小鼠分入实验组，平均肿瘤体积为310mm

E和F组中的小鼠在格栅地板的代谢笼中个别安置(即一只小鼠每个笼)。在放射性注射之后2，6，和24小时自每个笼收集尿液和粪便，并随后对个体样品测量放射性。注射后24小时将F组中的小鼠转移至常规笼。

在终止之前经由眶后采血自所有小鼠收集血液/血清。在安乐死之后，收获下面的器官和组织用于放射性测量和％ID/g计算：膀胱，子宫，小肠，结肠，脾，胰，肾，胃，肝，肺，心，脑，股骨，皮肤，肌肉，腹部脂肪，尾，和肿瘤。

遵循来自医学内部放射剂量(MIRD)委员会的第21号小册子中概述的形式计算吸收剂量(Bolch WE，Eckerman KF，Sgouros G，and Thomas SR.J Nucl Med 2009；50：477-484)。形式上，靶组织或区域r

1.由于α粒子的范围短，能量被局部吸收，这意味着仅仅考虑术语S(r

2.来自β和γ辐射的贡献被忽略。

以Δ

计算基于时间t时的综合(平均)衰变校正的放射性浓度，以[％ID/g]

A

第二步，对每种组织在时间上对放射性浓度积分。这使用药代学软件PhoenixWinNonlin 6.4(Certara USA，Inc.，100 Overlook Center，Suite 101，Princeton，NJ08540 USA)中的“线性对数梯形计算方法”来实现。以统一加权使用模型类型“Plasma”。

最后一步，通过将放射性浓度的时间积分乘以能量释放Δ

生物分布

荷瘤SCID小鼠中的平均

吸收剂量

为方案146计算的以Gy计的均值吸收剂量在表24中显示，作为绝对值(RBE＝1)和为α发射体的更高细胞毒性校正的(RBE＝5)二者。对于SCID小鼠，平均重量为18.5g；20μCi的注射

在肿瘤中实现大约20Gy的吸收剂量而除了膀胱以外的大多数正常组织中的吸收剂量维持远远低于2Gy。膀胱中的

在注射20μCi

在肿瘤中实现大约20Gy的吸收剂量而大多数正常组织中的吸收剂量维持远远低于2Gy。总之，该研究指示使用所评估的PRIT方案没有剂量限制性毒性的重大风险。

实施例34：未螯合DOTAM的淬灭(方案131)

在自含有钍的树脂洗脱之后将α发射体

CEA-DOTAM BsAb的金属-DOTAM螯合物亲和力

淬灭的初始选项是Cu，如此用淬灭的，非竞争性的Cu-DOTAM替换未螯合DOTAM，并且使用这种条件执行了CEA-PRIT程序内的大量研究。然而，后来发现Cu-DOTAM复合物事实上在体内不稳定，并且进行了一项研究来评估在人和小鼠血清，血浆，和血液中它与备选淬灭离子相比的稳定性。选择的离子一方面是具有相似亲和力的Pb和Ca，另一方面是具有显著更低亲和力的Zn和Cu。该研究证明在人和小鼠血液中Zn-DOTAM与Cu-DOTAM相比显著更高的稳定性，如通过注射后35分钟的自发Ca-DOTAM形成测量的，与Zn-DOTAM的0％和0％，和Pb-DOTAM的4％和4％相比，在小鼠和人血液中对于初始注射的Cu-DOTAM分别达到大约25％和30％。

方案131设计成在体内评估DOTAM淬灭性候选金属，比较它们在用CEA-DOTAM预靶向和用Pb-DOTAM-右旋糖酐-500清除之后对

方案131的时间过程和设计在下文两表中显示。

方案131的时间过程

方案131中的研究组

通过皮下注射BxPC3细胞入5-7周龄SCID小鼠的右体侧来建立固体异种移植物。在肿瘤细胞注射18天之后，将小鼠分入实验组，平均肿瘤体积为200mm

将抗体在20mM His/His-HCl，140mM NaCl，pH 6.0中稀释至100μg每100μL的终浓度用于依照“方案131中的研究组”表和图51的静脉内施用。在BsAb注射之后7天，将CA融化并在PBS中稀释至25μg每100μL的终浓度用于静脉内施用。再过24小时之后，静脉内注射使用5种不同金属任一淬灭的

在注射

在

方案131评估与Ca或Pb淬灭相比，来自DOTAM的Zn，Gd，或Cu淬灭对预靶向的

实施例35：用于PRIT的CD20-DOTAM和HER2-DOTAM的评估(方案151和152)

方案151和152分别旨在评估

方案151和152的时间过程和设计在下面的四个表中显示。

方案151的时间过程

方案151中的研究组

方案152的时间过程

方案152中的研究组

在方案151中通过在DMEM培养基中皮下注射CD20表达性WSU-DLCL2人B细胞淋巴瘤细胞入9周龄SCID小鼠来建立固体异种移植物。在肿瘤细胞注射之后4天，将小鼠分入实验组，平均肿瘤体积为105mm

在方案152中，通过在RPMI 1640培养基中皮下注射HER2表达性NCI-N87人胃癌细胞对10周龄SCID小鼠异种移植。在肿瘤细胞注射之后14天，将小鼠分入实验组，平均肿瘤体积为74mm

在放射性注射之后24小时处死生物分布小鼠。在终止之前在麻醉下经由眶后采血收集血液。在安乐死之后对所有小鼠尸检，另外收集皮肤，膀胱，胃，小肠，结肠，脾，胰，肾，肝，肺，心，股骨，肌肉，尾，和肿瘤。

生物分布-方案15l

在注射之后24小时所有收集的组织中的平均

生物分布-方案152

在注射之后24小时所有收集的组织中的平均

方案151和152的结果证明使用为CEA-PRIT开发的三步预靶向办法的CD20-PRIT和HER2-PRIT的特异性靶向和体内概念证明。

实施例36：其它型式的体内分布和肿瘤积累数据(方案154)

方案154旨在评估5种新颖CEA-DOTAM BsAb构建物对PRIT的用途。它设计成提供

方案154的时间过程和设计在下文两表中显示。

方案154的时间过程

方案154中的研究组

通过皮下注射HPAF-II细胞入9周龄小鼠的右体侧来建立固体异种移植物。在肿瘤细胞注射之后11天，将小鼠分入实验组，平均肿瘤体积为79mm

将所有抗体在20mM His/His-HCl，140mM NaCl，pH 6.0中稀释至100μg每100μL的终浓度用于依照“方案154中的研究组”表和图56的静脉内施用。在该BsAb注射之后7天将CA融化并在PBS中稀释至25μg每100μL的终浓度用于静脉内施用。再过24小时，静脉内注射用Ca淬灭的

在注射

在注射之后6小时所有收集的组织中的平均

在正常组织/器官中没有看到显著的

研究的结果证明对于三步PRIT所有测试的CEA-DOTAM抗体构建物(P1AE1766，P1AE1767，P1AE1768，P1AE1769，和P1AE1770)的体内概念证明。

实施例37：CD20-PRIT功效(方案162)

这项研究的目的是显示为针对备选靶物(分化簇20(CD20))的CEA-PRIT开发的治疗方案的概念证明。在承载皮下WSU-DLCL2肿瘤的小鼠中在3个周期的CD20-PRIT之后评估治疗功效。还与使用在注射之前与

研究设计，方案162

依照图59中图示的实验进度表治疗动物。通过皮下注射1.5x10

跟踪A-G组中的小鼠以评估治疗的功效。为了避免使用这种方案在血液和正常组织中保留更长时间导致急性放射诱导的毒性，对于PRIT，施用的活性是20μCi每周期，而一步RIT的相应活性是10μCi。

为了生物分布目的在它们的第一次和唯一一次注射

对于PRIT，将CEA-DOTAM BsAb或DIG-DOTAM(阴性对照BsAb)在20mM组氨酸，140mMNaCl(pH 6.0)中稀释至100μg每200μL的终浓度用于腹膜内施用。在BsAb注射之后7天腹膜内施用Ca-DOTAM-右旋糖酐-500CA(25μg每200μL)，24小时后继以Ca淬灭的

用一步RIT治疗的小鼠接受预结合的

对用利妥昔单抗

在书写这个实施例时研究仍在进行，但是可以相应报告初步结果：

对于第一个治疗周期，在注射之后24小时所有收集的组织中的平均

所评估的治疗的平均肿瘤发展在图61中显示。非治疗媒介组，DIG-DOTAM组，和基于抗体的治疗组的肿瘤稳定生长。与之对比，CD20-RIT和CD20-PRIT组中的肿瘤在第一个治疗周期之后尺寸缩小。

所有疗法组中的体重发展在图62中显示。多次注射20μCi

该研究显示CD20-PRIT的概念证明，具有与先前为CEA-PRIT所证明的相当的肿瘤生长抑制的指标。CD20-PRIT治疗得到较好耐受，但是一步CD20-RIT治疗并非如此。

下面的编号的段落代表本发明的某些另外的方面和实施方案。

1.一种包含对DOTAM-铅(Pb)螯合物特异性的抗原结合位点的抗体，其中所述抗原结合位点至少包含：

a)包含氨基酸序列FIGSRGDTYYASWAKG(SEQ ID NO：2)的重链CDR2，或其具有SEQID NO：2中多至1，2，或3处替代的变体，其中这些替代不包括Phe50，Asp56和Tyr58，且任选也不包括Gly52和/或Arg54；

b)包含氨基酸序列ERDPYGGGAYPPHL(SEQ ID NO：3)的重链CDR3，或其具有SEQ IDNO：3中多至1，2，或3处替代的变体，其中这些替代不包括Glu95，Arg96，Asp97，Pro98，且任选也不包括Ala100C，Tyr100D，和/或Pro100E，和/或任选也不包括Tyr99；

c)包含氨基酸序列QSSHSVYSDNDLA(SEQ ID NO：4)的轻链CDR1，或其具有SEQ IDNO：4中多至1，2，或3处替代的变体，其中这些替代不包括Tyr28和Asp32；

d)包含氨基酸序列LGGYDDESDTYG(SEQ ID NO：6)的轻链CDR3，或其具有SEQ IDNO：6中多至1，2，或3处替代的变体，其中这些替代不包括Gly91，Tyr92，Asp93，Thr95c和Tyr96，

其中编号方式是依照Kabat。

2.段落1的抗体，其进一步包含重链CDR1和轻链CDR2。

3.段落2的抗体，其包含：

i)包含氨基酸序列GFSLSTYSMS(SEQ ID NO：1)的重链CDR1，或其具有SEQ ID NO：1中多至1，2，或3处替代的变体，任选保守替代；和/或

ii)包含氨基酸序列QASKLAS(SEQ ID NO：5)的轻链CDR2，或其具有SEQ ID NO：5中至少1，2或3处替代的变体，任选保守替代。

4.依照前述段落任一项的抗体，其中抗原结合位点包含至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种选自下述的CDR：

a)包含氨基酸序列GFSLSTYSMS(SEQ ID NO：1)的重链CDR1，

b)包含氨基酸序列FIGSRGDTYYASWAKWG(SEQ ID NO：2)的重链CDR2，

c)包含氨基酸序列ERDPYGGGAYPPHL(SEQ ID NO：3)的重链CDR3，

d)包含氨基酸序列QSSHSVYSDNDLA(SEQ ID NO：4)的轻链CDR1，

e)包含氨基酸序列QASKLAS(SEQ ID NO：5)的轻链CDR2，

f)包含氨基酸序列LGGYDDESDTYG(SEQ ID NO：6)的轻链CDR3。

5.依照前述段落任一项的抗体，其与下述各项结合相同或交叠的Pb-DOTAM螯合物表位：

i)具有包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变域的抗体；或

ii)具有包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链可变域的抗体。

6.依照前述段落任一项的抗体，其是人，嵌合或人源化的。

7.依照前述段落任一项的抗体，其中抗原结合位点包含包含选自由SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9组成的组的氨基酸序列的重链可变域，或其包含与SEQ ID NO：7或SEQ IDNO：9具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，或99％同一性的氨基酸序列的变体。

8.依照前述段落任一项的抗体，其中抗原结合位点包含包含选自由SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10组成的组的氨基酸序列的轻链可变域，或其包含与SEQ ID NO：8或10具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，或99％同一性的氨基酸序列的变体。

9.依照前述段落任一项的抗体，其中抗原结合位点包含包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变域。

10.依照前述段落任一项的抗体，其中抗原结合位点包含包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链可变域。

11.依照前述段落任一项的抗体，其中抗原结合位点以100pM，50pM，20pM，10pM，5pM，1pM或更小的Kd值结合Pb-DOTAM螯合物。

12.依照前述段落任一项的抗体，其中抗原结合位点结合Pb-DOTAM螯合物和Bi-DOTAM螯合物，且其中针对Bi-DOTAM螯合物/Pb-DOTAM螯合物的Kd值之比在0.1-10或1-10的范围中。

13.依照前述段落任一项的抗体，其是完整抗体，或其是选自由Fv，Fab，Fab′，Fab’SH，F(ab′)

14.依照前述段落任一项的抗体，其中抗体是与特异性结合靶抗原的模块偶联的。

15.依照段落14的抗体，其中靶抗原是肿瘤特异性抗原。

16.依照段落14或15的抗体，其是多特异性或双特异性抗体，任选依照段落17至51任一项的多特异性抗体或双特异性抗体。

17.一种包含至少一个对Pb-DOTAM螯合物特异性的抗原结合位点和至少一个针对靶抗原的抗原结合位点的多特异性或双特异性抗体。

18.段落17的多特异性或双特异性抗体，其中对Pb-DOTAM螯合物特异性的抗原结合位点如段落1至12任一项中定义。

19.段落17或18的多特异性或双特异性抗体，其中靶抗原是肿瘤特异性抗原。

20.段落19的多特异性或双特异性抗体，其中肿瘤特异性抗原选自由CEA，HER2和CD20组成的组。

21.段落20的多特异性或双特异性抗体，其中肿瘤特异性抗原是癌胚抗原(CEA)。

22.段落17至21任一项的多特异性或双特异性抗体，其中多特异性或双特异性抗体包含至少一个对Pb-DOTAM螯合物特异性的抗原结合位点和至少一个对CEA特异性的抗原结合位点，且其中对CEA特异性的抗原结合位点包含包含至少一种，两种或三种重链CDR的重链，其中：

d)重链CDR1包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列，

e)重链CDR2包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列，

f)重链CDR3包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列；和/或对CEA特异性的抗原结合位点包含包含至少一种，两种或三种轻链CDR的轻链，其中：

a)轻链CDR1包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列；

b)轻链CDR2包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列；

c)轻链CDR3包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列。

23.段落22的多特异性或双特异性抗体，其中针对CEA的抗原结合位点包含至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种(即所有)选自下述的CDR：

a)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的重链CDR1；

b)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的重链CDR2；

c)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链CDR3；

d)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链CDR1；

e)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的轻链CDR2；

f)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链CDR3。

24.段落17至23任一项的多特异性或双特异性抗体，其中多特异性或双特异性抗体包含至少一个对Pb-DOTAM螯合物特异性的抗原结合位点和至少一个对CEA特异性的抗原结合位点，且其中对CEA特异性的抗原结合位点包含

i)包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链可变域，或其包含与SEQ ID NO：17具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，或99％同一性的氨基酸序列的变体；和/或

ii)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的轻链可变域，或其包含与SEQ ID NO：18具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，或99％同一性的氨基酸序列的变体。

25.段落24的多特异性或双特异性抗体，其中对CEA特异性的抗原结合位点包含包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链可变域和/或包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的轻链可变域。

26.依照段落17至20任一项的多特异性或双特异性抗体，其中多特异性或双特异性抗体包含至少一个对Pb-DOTAM螯合物特异性的抗原结合位点和至少一个对ERBB2特异性的抗原结合位点，且其中对ERBB2特异性的抗原结合位点包含至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种选自下述的CDR：(a)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-L3。

27.依照段落17至20或26任一项的多特异性或双特异性抗体，其中多特异性或双特异性抗体包含至少一个对Pb-DOTAM螯合物特异性的抗原结合位点和至少一个对ERBB2特异性的抗原结合位点，且其中对ERBB2特异性的抗原结合位点包含

i)包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的重链可变域，或其包含与SEQ ID NO：34具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，或99％同一性的氨基酸序列的变体；和/或

ii)包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的轻链可变域，或其包含与SEQ ID NO：35具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，或99％同一性的氨基酸序列的变体。

28.依照段落27的多特异性或双特异性抗体，其中对ERBB2特异性的抗原结合位点包含包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的重链可变域和/或包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的轻链可变域。

29.依照段落17至20任一项的多特异性或双特异性抗体，其中多特异性或双特异性抗体包含至少一个对Pb-DOTAM螯合物特异性的抗原结合位点和至少一个对CD20特异性的抗原结合位点，且其中对CD20特异性的抗原结合位点包含至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种选自下述的CDR：(a)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ IDNO：40的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQID NO：42的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L3。

30.依照段落17至20或29任一项的多特异性或双特异性抗体，其中多特异性或双特异性抗体包含至少一个对Pb-DOTAM螯合物特异性的抗原结合位点和至少一个对CD20特异性的抗原结合位点，且其中对CD20特异性的抗原结合位点包含

i)包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的重链可变域，或其包含与SEQ ID NO：45具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，或99％同一性的氨基酸序列的变体；和/或

ii)包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的轻链可变域，或其包含与SEQ ID NO：46具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，或99％同一性的氨基酸序列的变体。

31.依照段落30的多特异性或双特异性抗体，其中对CD20特异性的抗原结合位点包含包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的重链可变域和/或包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的轻链可变域。

32.段落17至31任一项的多特异性或双特异性抗体，其包含Fc区。

33.段落32的多特异性或双特异性抗体，其中Fc区改造成降低效应器功能。

34.段落33的多特异性或双特异性抗体，其中Fc区是通过Fc区残基234，235，238，265，269，270，297，327和/或329中一个或多个的替代而改造的。

35.段落32-34任一项的多特异性或双特异性抗体，其包含包含第一和第二抗体重链和第一和第二抗体轻链的全长抗体，其中第一重链和第一轻链组装成形成针对第一抗原的抗原结合位点，且其中第二重链和第二轻链组装成形成针对第二抗原的抗原结合位点，

其中或是第一或是第二抗原是Pb-DOTAM螯合物，且另一是靶抗原。

36.段落35的多特异性或双特异性抗体，其进一步包含另外的针对第一抗原的抗原结合模块。

37.段落36的多特异性或双特异性抗体，其包含：

包含第一和第二抗体重链和第一和第二抗体轻链的全长抗体，其中第一重链和第一轻链组装成形成包含针对第一抗原的抗原结合位点的Fab，且其中第二重链和第二轻链组装成形成包含针对第二抗原的抗原结合位点的交叉Fab；且

其中或是第一或是第二抗体重链经由接头与包含CH1和VH域的多肽融合，且所述第一多肽与包含CL和VL的第二多肽组装，使得第一和第二多肽组装成形成包含针对第一抗原的抗原结合位点的Fab。

38.段落37的多特异性或双特异性抗体，其中第二抗体重链的N端经由接头与所述第一多肽融合。

39.段落32至34任一项的多特异性或双特异性抗体，其包含：

i)包含针对第一抗原的抗原结合位点的全长抗体；和

ii)至少第二重链可变域和第二轻链可变域，其一起形成针对第二抗原的抗原结合位点，

其中或是第一或是第二抗原是Pb-DOTAM螯合物，且另一是靶抗原。

40.段落39的多特异性或双特异性抗体，其包含包含针对第一抗原的抗原结合位点的全长抗体，其中重链之一的N或C端经由多肽接头与第一多肽连接且其中第一多肽与第二多肽联合以形成包含针对第二抗原的结合位点的Fab或交叉Fab。

41.段落40的多特异性或双特异性抗体，其包含：

i)由VH域和CH1域组成的第一多肽，其与由VL和CL域组成的第二多肽联合；或

ii)由VL域和CH1域组成的第一多肽，其与由VH和CL域组成的第二多肽联合；或

iii)由VH域和CL域组成的第一多肽，其与由VL和CH1域组成的第二多肽联合；

使得第一和第二多肽一起形成针对第二抗原的抗原结合位点。

42.段落41的多特异性或双特异性抗体，其包含包含针对第一抗原的抗原结合位点的全长抗体，其中重链之一的C端经由多肽接头与由VL域和CH1域组成的第一多肽连接，第一多肽与由VH和CL域组成的第二多肽联合。

43.依照段落39的多特异性或双特异性抗体，其包含：

a)特异性结合第一抗原且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成的全长抗体；

b)由下述各项组成的多肽：

i)抗体重链可变域(VH)；或

ii)抗体重链可变域(VH)和抗体重链恒定域(CH1)；或

iii)抗体重链可变域(VH)和抗体轻链恒定域(CL)，

其中所述多肽以VH域的N端经由肽接头与所述全长抗体的两条重链之一的C端融合；

c)由下述各项组成的多肽：

i)抗体轻链可变域(VL)；或

ii)抗体轻链可变域(VL)和抗体轻链恒定域(CL)；或

iii)抗体轻链可变域(VL)和抗体重链恒定域(CH1)；

其中所述多肽以VL域的N端经由肽接头与所述全长抗体的两条重链之另一的C端融合；且

其中(b)下的肽的抗体重链可变域和(c)下的肽的抗体轻链可变域一起形成针对第二抗原的抗原结合位点，

其中或是第一或是第二抗原是Pb-DOTAM螯合物且另一是靶抗原。

44.依照段落35-43任一项的多特异性或双特异性抗体，其中第一抗原是靶抗原且第二抗原是Pb-DOTAM螯合物。

45.依照段落44的多特异性或双特异性抗体，其中第一抗原是CEA。

46.依照段落45的多特异性或双特异性抗体，其包含：

a)特异性结合CEA且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成的全长抗体；

其中重链与SEQ ID NO：22或23的氨基酸1-450的重链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性；且

其中轻链与SEQ ID NO：21的轻链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性；

b)由下述各项组成的多肽：

i)与SEQ ID NO：7的重链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体重链可变域(VH)；或

ii)所述与SEQ ID NO：7的重链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体重链可变域(VH)和抗体重链恒定域(CH1)；和

iii)所述与SEQ ID NO：7的重链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体重链可变域(VH)和抗体轻链恒定域(CL)，

其中所述多肽以VH域的N端经由肽接头与所述全长抗体的两条重链之一的C端融合；和

c)由下述各项组成的多肽：

i)与SEQ ID NO：8的轻链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体轻链可变域(VL)；或

ii)所述与SEQ ID NO：8的轻链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体轻链可变域(VL)和抗体轻链恒定域(CL)；或

iii)所述与SEQ ID NO：8的轻链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体轻链可变域(VL)和抗体重链恒定域(CH1)，

其中所述多肽以VL域的N端经由肽接头与所述全长抗体的两条重链之另一的C端融合；

其中(b)下的肽的抗体重链可变域和(c)下的肽的抗体轻链可变域一起形成针对Pb-DOTAM螯合物的抗原结合位点。

47.依照段落45的多特异性或双特异性抗体，其包含：

a)特异性结合CEA且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成的全长抗体；

其中重链与SEQ ID NO：19或20的氨基酸1至450的重链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性；且

其中轻链与SEQ ID NO：21的轻链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性，

b)由下述各项组成的多肽：

i)与SEQ ID NO∶9的重链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体重链可变域(VH)；或

ii)所述与SEQ ID NO：9的重链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体重链可变域(VH)和抗体重链恒定域(CH1)；或

iii)所述与SEQ ID NO：9的重链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体重链可变域(VH)和抗体轻链恒定域(CL)，

其中所述多肽以VH域的N端经由肽接头与所述全长抗体的两条重链之一的C端融合；

c)由下述各项组成的多肽：

i)与SEQ ID NO：10的轻链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体轻链可变域(VL)；或

ii)所述与SEQ ID NO：10的轻链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体轻链可变域(VL)和抗体轻链恒定域(CL)；或

iii)所述与SEQ ID NO：10的轻链可变域具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体轻链可变域(VL)和抗体重链恒定域(CH1)，

其中所述多肽以VL域的N端经由肽接头与所述全长抗体的两条重链之另一的C端融合；且

其中(b)下的肽的抗体重链可变域和(c)下的肽的抗体轻链可变域一起形成针对Pb-DOTAM螯合物的抗原结合位点。

48.依照段落45的多特异性或双特异性抗体，其包含：

i)包含与SEQ ID NO：22的重链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的氨基酸序列的第一重链，

ii)包含与SEQ ID NO：23的重链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的氨基酸序列的第二重链，和

iii)两条与SEQ ID NO：21的轻链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体轻链。

49.依照段落48的多特异性或双特异性抗体，其包含：

i)具有SEQ ID NO：22的氨基酸序列的第一重链；

ii)具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的第二重链；和

iii)两条具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的抗体轻链。

50.依照段落45的多特异性或双特异性抗体，其包含：

i)具有与SEQ ID NO：19的重链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的氨基酸序列的第一重链，

ii)与SEQ ID NO：20的重链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的第二重链，

iii)两条与SEQ ID NO：21的轻链具有至少90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％同一性的抗体轻链。

51.依照段落50的多特异性或双特异性抗体，其包含：

i)具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的第一重链；

ii)具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的第二重链；和

iii)两条具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的抗体轻链。

52.一种分离的多核苷酸或一种分离的多核苷酸套组，其编码依照前述段落任一项的抗体。

53.一种载体，其包含依照段落52的多核苷酸或多核苷酸套组。

54.一种试剂盒或组合物，其包含载体套组，载体套组一起包含依照段落52的多核苷酸套组。

55.段落53的载体或段落54的载体套组，其为表达载体。

56.一种原核或真核宿主细胞，其包含依照段落52的分离的多核苷酸或分离的多核苷酸套组，任选包含段落53的载体或段落54的载体套组。

57.一种生成依照段落1至51任一项的抗体的方法，其包括自段落56的宿主细胞表达抗体。

序列表

<110> 豪夫迈·罗氏有限公司（F. Hoffmann-La Roche AG）

<110> 奥兰诺医药公司（Orano Med SAS）

<120> 针对螯合的放射性核素的抗体和清除剂

<130> 007472434

<150> US 62/658468

<151> 2018-04-16

<150> US 62/658471

<151> 2018-04-16

<160> 82

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 CDR1 PRIT-213

<400> 1

Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser

1 5 10

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 CDR2 PRIT-213

<400> 2

Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

1 5 10 15

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 CDR3 PRIT-213

<400> 3

Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Pro His Leu

1 5 10

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 CDR1 PRIT-213

<400> 4

Gln Ser Ser His Ser Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 CDR2 PRIT-213

<400> 5

Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser

1 5

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 CDR3 PRIT-213

<400> 6

Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly

1 5 10

<210> 7

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 可变域 1 PRIT-213

<400> 7

Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu Thr

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser

20 25 30

Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly

35 40 45

Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu Thr

65 70 75 80

Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg

85 90 95

Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Pro His Leu Trp Gly

100 105 110

Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 可变域 PRIT-213

<400> 8

Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His Ser Val Tyr Ser Asp Asn

20 25 30

Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Glu

85 90 95

Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 9

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 可变域 PRIT-214

<400> 9

Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr

1 5 10 15

Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser

20 25 30

Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys

65 70 75 80

Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

85 90 95

Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Pro His Leu Trp Gly

100 105 110

Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 10

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 可变域 PRIT-214

<400> 10

Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His Ser Val Tyr Ser Asp Asn

20 25 30

Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Glu

85 90 95

Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 CDR1

<400> 11

Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His

1 5 10

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 CDR2

<400> 12

Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 13

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 CDR3

<400> 13

Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr

1 5 10

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 CDR1

<400> 14

Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe Gly Val Gly Phe Leu His

1 5 10 15

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 CDR2

<400> 15

Arg Ala Ser Asn Arg Ala Thr

1 5

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 CDR3

<400> 16

Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Tyr Thr

1 5

<210> 17

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 可变域 84.66

<400> 17

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 18

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 可变域 84.66

<400> 18

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe

20 25 30

Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 19

<211> 591

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 1 双特异性, 三价 PRIT-214 VH_84.66

<400> 19

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

450 455 460

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu

465 470 475 480

Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Phe

485 490 495

Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys

500 505 510

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr

515 520 525

Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys

530 535 540

Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala

545 550 555 560

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr

565 570 575

Pro Pro His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

580 585 590

<210> 20

<211> 581

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 2 双特异性, 三价 PRIT-214 VL_84.66

<400> 20

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

450 455 460

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

465 470 475 480

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His

485 490 495

Ser Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

500 505 510

Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly

515 520 525

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

530 535 540

Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu

545 550 555 560

Gly Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr

565 570 575

Lys Val Glu Ile Lys

580

<210> 21

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 84.66

<400> 21

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe

20 25 30

Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 22

<211> 591

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 1 双特异性, 三价 PRIT-213 VH_84.66 ->节

<400> 22

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

450 455 460

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu

465 470 475 480

Val Lys Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe

485 490 495

Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys

500 505 510

Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr

515 520 525

Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys

530 535 540

Ser Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala

545 550 555 560

Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr

565 570 575

Pro Pro His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

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<210> 23

<211> 581

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 2 双特异性, 三价 PRIT-213 VL_84.66 ->穴

<400> 23

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20 25 30

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290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

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405 410 415

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Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His

485 490 495

Ser Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

500 505 510

Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly

515 520 525

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

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Gly Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr

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580

<210> 24

<211> 581

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 1 双特异性, 家兔 Dotam _84.66

<400> 24

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

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180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

450 455 460

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val

465 470 475 480

Ser Pro Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser His

485 490 495

Ser Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly

500 505 510

Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly

515 520 525

Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu

530 535 540

Thr Ile Ser Gly Val Gln Ser Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu

545 550 555 560

Gly Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr

565 570 575

Glu Val Val Val Lys

580

<210> 25

<211> 589

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 2 双特异性, 四价 家兔 Dotam_84.66

<400> 25

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

450 455 460

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu

465 470 475 480

Val Thr Pro Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe

485 490 495

Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

500 505 510

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr

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Val Asp Leu Lys Ile Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr

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<210> 26

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 26

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 27

<211> 1379

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Immunomedics hNM14

<400> 27

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

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50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

450 455 460

Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr

465 470 475 480

Pro Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu

485 490 495

Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

500 505 510

Glu Trp Ile Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser

515 520 525

Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp

530 535 540

Leu Lys Ile Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

545 550 555 560

Ala Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Pro His Leu

565 570 575

Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Val Gln Leu Val

580 585 590

Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser

595 600 605

Cys Ser Ala Ser Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr Trp Met Ser Trp Val

610 615 620

Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile His Pro

625 630 635 640

Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu Lys Asp Arg Phe Thr

645 650 655

Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asp Ser

660 665 670

Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Ser Leu Tyr Phe

675 680 685

Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val

690 695 700

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser

705 710 715 720

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

725 730 735

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

740 745 750

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu

755 760 765

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr

770 775 780

Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val

785 790 795 800

Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

805 810 815

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

820 825 830

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

835 840 845

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

850 855 860

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

865 870 875 880

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

885 890 895

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

900 905 910

Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

915 920 925

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg

930 935 940

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly

945 950 955 960

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

965 970 975

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

980 985 990

Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

995 1000 1005

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

1010 1015 1020

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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

1040 1045 1050

Gly Ser Ala Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Pro Ala

1055 1060 1065

Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser His Ser Val

1070 1075 1080

Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln

1085 1090 1095

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly

1100 1105 1110

Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr

1115 1120 1125

Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ser Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr

1130 1135 1140

Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly

1145 1150 1155

Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser

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1175 1180 1185

Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser Val Ala Trp Tyr Gln

1190 1195 1200

Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser

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Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

1220 1225 1230

Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp

1235 1240 1245

Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Leu Tyr Arg Ser Phe

1250 1255 1260

Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

1265 1270 1275

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

1280 1285 1290

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

1295 1300 1305

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

1310 1315 1320

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

1325 1330 1335

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

1340 1345 1350

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

1355 1360 1365

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

1370 1375

<210> 28

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 CDR1

<400> 28

Asp Thr Tyr Ile His

1 5

<210> 29

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 CDR2

<400> 29

Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 30

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 CDR3

<400> 30

Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 31

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 CDR1

<400> 31

Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala

1 5 10

<210> 32

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 CDR2

<400> 32

Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser

1 5

<210> 33

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 CDR3

<400> 33

Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr

1 5

<210> 34

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 可变域

<400> 34

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 35

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 可变域

<400> 35

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 36

<211> 590

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 1 (节) 双特异性, 三价 ERbB2/Pb-Dotam (P1AD9827)

<400> 36

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

450 455 460

Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val

465 470 475 480

Lys Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser

485 490 495

Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala

500 505 510

Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala

515 520 525

Ser Trp Ala Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser

530 535 540

Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr

545 550 555 560

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro

565 570 575

Pro His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

580 585 590

<210> 37

<211> 580

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 2 (穴) 双特异性, 三价 ERbB2/Pb-Dotam (P1AD9827)

<400> 37

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

450 455 460

Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

465 470 475 480

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His Ser

485 490 495

Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

500 505 510

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val

515 520 525

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

530 535 540

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly

545 550 555 560

Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys

565 570 575

Val Glu Ile Lys

580

<210> 38

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 (P1AD9827)

<400> 38

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 39

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 CDR1

<400> 39

Tyr Ser Trp Ile Asn

1 5

<210> 40

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 CDR2

<400> 40

Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 41

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 CDR3

<400> 41

Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr

1 5 10

<210> 42

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 CDR1

<400> 42

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr

1 5 10 15

<210> 43

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 CDR2

<400> 43

Gln Met Ser Asn Leu Val Ser

1 5

<210> 44

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 CDR3 CD20>

<400> 44

Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr

1 5

<210> 45

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 可变域

<400> 45

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 46

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 可变域

<400> 46

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 47

<211> 589

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 1 (节) 双特异性, 三价 CD20/Pb-Dotam (P1AD9826)

<400> 47

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

450 455 460

Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys

465 470 475 480

Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu

485 490 495

Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu

500 505 510

Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser

515 520 525

Trp Ala Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln

530 535 540

Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr

545 550 555 560

Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Pro

565 570 575

His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

580 585

<210> 48

<211> 579

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 2 (穴) 双特异性, 三价 CD20/Pb-Dotam (P1AD9826)

<400> 48

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser

355 360 365

Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

450 455 460

Gly Gly Gly Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala

465 470 475 480

Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His Ser Val

485 490 495

Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

500 505 510

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro

515 520 525

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

530 535 540

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly

545 550 555 560

Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val

565 570 575

Glu Ile Lys

<210> 49

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 (P1AD9826)

<400> 49

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg

115 120 125

Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 50

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P1AE1766 >CEA 轻链 RK

<400> 50

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu

85 90 95

Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 51

<211> 687

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P1AE1766 CEA 重链 带有 DOTAM VL / CH1

<400> 51

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1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

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Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

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Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

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Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

450 455 460

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

465 470 475 480

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser

485 490 495

His Ser Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

500 505 510

Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser

515 520 525

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

530 535 540

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys

545 550 555 560

Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly

565 570 575

Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

580 585 590

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

595 600 605

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

610 615 620

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

625 630 635 640

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

645 650 655

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

660 665 670

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

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<210> 52

<211> 699

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P1AE1766 CEA 重链 带有 DOTAM VH / CK

<400> 52

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

450 455 460

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val

465 470 475 480

Leu Val Lys Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly

485 490 495

Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly

500 505 510

Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr

515 520 525

Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser

530 535 540

Lys Ser Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr

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Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala

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Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

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<220>

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Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser

20 25 30

Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly

35 40 45

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Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu Thr

65 70 75 80

Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg

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Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Pro His Leu Trp Gly

100 105 110

Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser

115 120 125

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130 135 140

Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val

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210 215 220

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225

<210> 54

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 54

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

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65 70 75 80

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100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 55

<211> 687

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P1AE1767 CEA 重链 带有 DOTAM VL / CH1 (节)

<400> 55

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

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Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

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Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

465 470 475 480

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser

485 490 495

His Ser Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

500 505 510

Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser

515 520 525

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

530 535 540

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys

545 550 555 560

Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly

565 570 575

Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

580 585 590

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

595 600 605

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

610 615 620

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<210> 56

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P1AE1767 CEA 重链 (穴)

<400> 56

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 57

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P1AE1768 >CEA LC

<400> 57

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu

85 90 95

Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 58

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P1AE1768> DOTAM 重链 带有 VL / CH1 (穴)

<400> 58

Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp

1 5 10 15

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Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu

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Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

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Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser

100 105 110

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

115 120 125

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

130 135 140

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

145 150 155 160

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln

180 185 190

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

195 200 205

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

225 230 235 240

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

245 250 255

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

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275 280 285

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

290 295 300

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

305 310 315 320

Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

325 330 335

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp

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Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe

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Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

405 410 415

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435 440

<210> 59

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P1AE1768 CEA 重链 (节)

<400> 59

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly

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355 360 365

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385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 68

<211> 496

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）软骨蛋白

<400> 68

Met Arg Val Leu Ser Gly Thr Ser Leu Met Leu Cys Ser Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Gln Ala Leu Cys Ser Pro Gly Leu Ala Pro Gln Ser Arg Gly

20 25 30

His Leu Cys Arg Thr Arg Pro Thr Asp Leu Val Phe Val Val Asp Ser

35 40 45

Ser Arg Ser Val Arg Pro Val Glu Phe Glu Lys Val Lys Val Phe Leu

50 55 60

Ser Gln Val Ile Glu Ser Leu Asp Val Gly Pro Asn Ala Thr Arg Val

65 70 75 80

Gly Met Val Asn Tyr Ala Ser Thr Val Lys Gln Glu Phe Ser Leu Arg

85 90 95

Ala His Val Ser Lys Ala Ala Leu Leu Gln Ala Val Arg Arg Ile Gln

100 105 110

Pro Leu Ser Thr Gly Thr Met Thr Gly Leu Ala Ile Gln Phe Ala Ile

115 120 125

Thr Lys Ala Phe Gly Asp Ala Glu Gly Gly Arg Ser Arg Ser Pro Asp

130 135 140

Ile Ser Lys Val Val Ile Val Val Thr Asp Gly Arg Pro Gln Asp Ser

145 150 155 160

Val Gln Asp Val Ser Ala Arg Ala Arg Ala Ser Gly Val Glu Leu Phe

165 170 175

Ala Ile Gly Val Gly Ser Val Asp Lys Ala Thr Leu Arg Gln Ile Ala

180 185 190

Ser Glu Pro Gln Asp Glu His Val Asp Tyr Val Glu Ser Tyr Ser Val

195 200 205

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210 215 220

Asp Leu Cys Ala Thr Gly Asp His Asp Cys Glu Gln Val Cys Ile Ser

225 230 235 240

Ser Pro Gly Ser Tyr Thr Cys Ala Cys His Glu Gly Phe Thr Leu Asn

245 250 255

Ser Asp Gly Lys Thr Cys Asn Val Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser

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275 280 285

Glu Asn Phe Glu Leu Val Lys Lys Phe Ile Ser Gln Ile Val Asp Thr

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Leu Asp Val Ser Asp Lys Leu Ala Gln Val Gly Leu Val Gln Tyr Ser

305 310 315 320

Ser Ser Val Arg Gln Glu Phe Pro Leu Gly Arg Phe His Thr Lys Lys

325 330 335

Asp Ile Lys Ala Ala Val Arg Asn Met Ser Tyr Met Glu Lys Gly Thr

340 345 350

Met Thr Gly Ala Ala Leu Lys Tyr Leu Ile Asp Asn Ser Phe Thr Val

355 360 365

Ser Ser Gly Ala Arg Pro Gly Ala Gln Lys Val Gly Ile Val Phe Thr

370 375 380

Asp Gly Arg Ser Gln Asp Tyr Ile Asn Asp Ala Ala Lys Lys Ala Lys

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Asp Leu Gly Phe Lys Met Phe Ala Val Gly Val Gly Asn Ala Val Glu

405 410 415

Asp Glu Leu Arg Glu Ile Ala Ser Glu Pro Val Ala Glu His Tyr Phe

420 425 430

Tyr Thr Ala Asp Phe Lys Thr Ile Asn Gln Ile Gly Lys Lys Leu Gln

435 440 445

Lys Lys Ile Cys Val Glu Glu Asp Pro Cys Ala Cys Glu Ser Leu Val

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<210> 69

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 三聚化域序列

<400> 69

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1 5 10 15

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35

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<220>

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<212> DNA

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<220>

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<212> DNA

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<220>

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> https://protect-eu.mimecast.com/s/05w_ClOgxUM0EYi1ugxe?domain=rblc.do

<400> 73

cagagtrctg ctgaggttgt aggtac 26

<210> 74

<211> 579

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Immunomedics hNM14

<400> 74

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

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115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser

355 360 365

Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

450 455 460

Gly Gly Gly Ser Ala Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Pro

465 470 475 480

Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser His Ser Val

485 490 495

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Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile

530 535 540

Ser Gly Val Gln Ser Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly

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Val Val Lys

<210> 75

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC1

<400> 75

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100 105 110

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<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC3

<400> 76

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1 5 10 15

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100 105 110

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<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HC7

<400> 77

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1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser

20 25 30

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Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

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100 105 110

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<210> 78

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CH1A1A VH

<400> 78

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 79

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CH1A1A VL

<400> 79

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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65 70 75 80

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Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

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<210> 80

<211> 224

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P1AA1227_HC

<400> 80

Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu Thr

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser

20 25 30

Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly

35 40 45

Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu Thr

65 70 75 80

Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg

85 90 95

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130 135 140

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165 170 175

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180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

<210> 81

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P1AA1227_LC

<400> 81

Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His Ser Val Tyr Ser Asp

20 25 30

Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp

85 90 95

Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

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115 120 125

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Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 82

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Immunomedics hNM14

<400> 82

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Leu Tyr Arg Ser

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210