具有较长激发态寿命的包含铽的超亮发光镧系纳米粒子

摘要

本发明提供发光镧系纳米粒子，其同时具有改善的亮度和延长的激发态寿命。这些纳米粒子包含铽离子和第二镧系的离子，所述第二镧系优先地为铕，并且所述纳米粒子涂布有键合到所述纳米粒子的表面的发色团配体分子。所述配体为式(I)或式(II)包含至少一个发色团基团的有机分子：其中R选自H、CN基团或COOH基团。磷光激发态寿命是通过从表面铽离子到所述第二镧系的核心离子的能量转移来改善。所述纳米粒子可以进一步包含共价附接到至少一个配体分子的受到分析关注的载体分子。

说明书

技术领域

本发明涉及具有重要亮度和非常长的激发态寿命的新型发光镧系纳米粒子。

更具体地，本发明涉及共掺杂有第二镧系的离子的铽离子纳米粒子，所述铽离子纳米粒子包括涂布其表面的发色团配体，这导致改善的亮度和延长的激发态寿命。

这些发光纳米粒子可有利地用于生物分析的技术领域，特别是用于荧光免疫分析、医学成像和显微镜。

背景技术

在生物分析领域中，非常需要能够与生物分子特异性结合并且易于观察的“标志”化合物。

由于这些标志化合物，存在具体分析物，例如核酸、酶、肽、药品(例如麻醉剂、毒物、药物…)、激素、代谢物、病原微生物、病毒或抗体，和尤其与疾病状态有关的那些，出于研究或诊断目的，可有利地检测和定量。

优选的标志应便宜、安全、稳定并且能够附接到各种化学、生物化学和生物材料。在自然界中应该很少并且实际上从未发现它们。另外，它们应产生高度特征性的信号，在水性系统中可容易检测，优选地以快速、灵敏和可再现的方式检测。

在现有技术中已经开发各种各样的标志。举例来说，有时使用放射性标志。但是这类标志具有缺点，因为它们昂贵、危险、需要复杂的设备和训练有素的人员并且需要特定的废弃物处理。

在这种情况下，使用荧光光谱法或发光检测方法可直接检测的标志备受关注。在现有技术中已描述为了方便附接到其它分子开发的大量这类标志，并且其中一些为可商购的。理想地，这类标志应具有良好的亮度，所述亮度被定义为摩尔消光系数乘发光量子产率、窄发射带和长激发态寿命的乘积，允许用于时间分辨检测技术。

半导体纳米晶体，也称为量子点，例如由Medintz等人,《自然材料(NatureMaterials)》,2005年6月,4,435描述的那些，具有良好的亮度，但发光寿命非常短(小于微秒)，并且发射峰宽。

镧系离子具有非常特殊的光谱特性，并且为在这类发光标志中使用的受关注的候选，如由Bünzli,J.C.G.《化学评论(Chem.Rev.)》2010,110,2729公开。实际上，它们的发射线非常窄，其激发态寿命长，并且可达到几毫秒。因此，可以合理的信噪比来区分其发光信号的光谱和时间。

然而，相应的摩尔消光系数非常小，因此产生非常低的亮度。为了克服这种不便，由于被称作天线效应的机制，光敏配体已被用于吸收光并将吸收的能量朝向镧系离子转移。

在现有技术中存在基于能够与生物材料结合的镧系离子单核络合物的发光标志，并且一些是可商购的(例如，以Lumi4或Lanthascreen商品名称)。专利申请WO 00/48990和WO 00/48991公开由包含一种镧系离子和络合剂的镧系离子螯合物制成的这类发光标记物的实例。

但是，由于这些络合物的分子性质，最著名的基于镧系的标志仍显示适度的亮度。最有效的分子络合物，例如描述于WO 2013/011236；Delbianco,M.等人,《应用化学国际版(Angew.Chem.Int.Ed.)》2014,54,10718；WO 2006/001835或Xu,J.等人,《美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)》2011,133,199900中，亮度大约为10

为了改善此方面，本发明人关注镧系离子纳米粒子而不是镧系离子分子络合物。

纳米粒子是小的物体，根据通常的定义，其尺寸在1nm和500nm之间，并且由许多原子构成，其一个关注点是由于表面处的原子数高。随着在所述领域中的最新创新，可在大小、元素组成和特性方面控制纳米粒子的合成。

镧系纳米粒子作为生物标记物为非常有前景的，因为它们提供大的斯托克斯位移和强的光稳定性。但是，即使它们由数百或数千个镧系阳离子构成，镧系离子纳米粒子也具有低的吸收系数。

然而，本发明人已研究镧系离子纳米粒子(尤其含有镧系离子纳米粒子的铽)的光敏化，并且已通过用以表面铽离子执行天线作用的合适的发色团配体涂布它们成功地将其亮度提高到高于10

另外，与现有技术中描述的用镧系离子单核络合物实现的灵敏度相比，为了改善分析的灵敏度，非常期望延长标记物的激发态寿命。

实际上，在较长激发态寿命的情况下，有可能以延迟的信号采集实现时间分辨测量。在脉冲激发之后，施加在记录发射强度之前的延迟。此延迟的采集去除较短的荧光现象，并且所有其它荧光分子的信号消失。仅，最长激发态寿命化合物的磷光信号仍然需要测量。因此，背景噪声大大降低，信噪比显著提高。这在环境中荧光化合物众多的生物介质中具有相当大的优势。

本发明提供含有铽的新型发光纳米粒子，除了具有重要的亮度和结合允许用作标志的分析关注的载体的能力之外，还具有比现有技术化合物更长的激发态寿命。

通过改善测量的灵敏度和信号分辨率，本发明的纳米粒子的水性溶液的非常长的激发态寿命和杰出的亮度使得能够在生物分析和显微镜领域中具有杰出的结果。

发明内容

为了解决技术问题，本发明提供发光镧系纳米粒子，其同时具有改善的亮度和延长的激发态寿命，并且包含包括铽的镧系离子纳米粒子，和键合到镧系离子纳米粒子的表面的几个发色团配体分子。

根据本发明，所述镧系离子纳米粒子包含铽离子和选自由以下组成的组的至少第二镧系的离子：铈、镨、钕、钐、铕、镝、钬、铒、铥和镱。

另外，所述配体为式I或式II包含至少一个发色团基团的有机分子：

其中R选自H、CN基团或COOH基团。

根据本发明的实施例，所述镧系离子纳米粒子包含铽离子和选自由以下组成的组的至少第二镧系的离子：铈、镨、钕、钐、铕、镝、钬、铒、铥和镱。

另外，所述配体为式I或式II包含至少一个发色团基团的有机分子：

其中R为4-乙基苯甲酸基。

由此，配体为包括具有如上文所描述的式I或II的一个基团或基序和连接到所述基团或基序的任何合适的化学结构的有机分子。位于表示的截断之后的任何种类的此化学结构可为例如OH基团、具有或不具有杂原子的支链、直链或环状碳链、接枝官能团、通过任何合适的种类的间隔基团任选地连接在一起的一个或几个其它发色团基团，或任何其它合适的化学结构。

由于本发明，当如在此后实例部分中，在被称作：“发光光谱法的实验测量方法”中所描述测量时，获得的纳米粒子的亮度和激发态寿命同时分别高于3毫秒和10

根据本发明的实施例，第二镧系选自铕、钐、镝和镱，并且优先地为铕。

根据实施例，镧系离子纳米粒子可含有在10mol.％和99.9mol.％之间，优先地在50mol.％和99.9mol.％之间，并且甚至更优先地在75mol.％和99.9mol.％之间的铽离子，和在0.1mol.％和90mol.％之间，优先地在0.1mol.％和50mol.％之间，并且甚至更优先地在0.1mol.％和25mol.％之间的第二镧系的离子。

根据本发明的优选的实施例，镧系离子纳米粒子还包含选自以下的第三镧系的离子：镧、镥和钆，并且优先地为镧。

在此情况下并且根据实施例，所述镧系离子纳米粒子可含有在1mol.％和98.9mol.％之间，优先地在10mol.％和98mol.％之间，并且甚至更优先地在40mol.％和98mol.％之间的铽离子，在0.1mol.％和20mol.％之间，优先地在0.5mol.％和10mol.％之间，并且甚至更优先地在1mol.％和5mol.％之间的第二镧系的离子，和在1mol.％和90.9mol.％之间，优先地在10mol.％和80mol.％之间，并且甚至更优先地在10mol.％和20mol.％之间的第三镧系的离子。

根据本发明的实施例，配体包含n个发色团基团和间隔基团，其中间隔基团为将发色团基团连接在一起的含有杂原子的碳链，并且其中n为1到10，优先地2到6，并且更优先地2到3的整数。

根据本发明的优选的实施例，配体还包含能够共价连接到受到分析关注的载体分子的接枝官能团。

根据此实施例，发光纳米粒子还可包含共价附接到至少一个配体分子的受到分析关注的载体分子。

受到分析关注的载体分子优选地选自由以下组成的组：肽、蛋白、抗体、抗体部分和分子量低于2000g.mol

根据本发明的优选的实施例，配体选自具有根据式L1、L2、L3、L4和L5的结构的分子：

根据本发明的另一个优选的实施例，配体选自具有根据式L6、L7、L8和L9的结构的分子：

附图说明

通过阅读下面的详细描述并参考所附附图，将揭示本发明的其它特征和优点，其中：

-图1到3分别为对应于根据实例N°5的镧系纳米粒子的透射电子显微镜图像、说明在超纯水中的动态光散射的图谱和示出固体纳米粒子的X射线衍射图案的图谱；

-图4到6分别为对应于根据实例N°6的镧系纳米粒子的透射电子显微镜图像、说明在超纯水中的动态光散射的图谱和示出固体粒子的X射线衍射图案的图谱；

-图7为获得根据本发明的生物官能化发光纳米粒子的两种不同方式的示意图；

-图8和10为说明根据实例N°6的镧系纳米粒子通过配体L5，接着分别通过UV/可见吸收和通过发射荧光光谱的滴定的图谱；

-图9为相对于图8的滴定的图谱，其示出随添加的配体L5的浓度变化的在314nm处的吸收演化；

-图11为图10图的图谱的包围部分的放大图，其更具体地示出对应于铽和铕的发射的光谱区域；

-图12为相对于图10的滴定的图谱，其示出随添加的配体L5的浓度变化的在不同波长处的强度发射演化；和

-图13为示出在缓冲溶液中涂布有配体L5的La

具体实施方式

现在将参考图1到13详细描述根据本发明的发光纳米粒子。

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域的技术人员通常所理解的意义。

根据本发明的发光纳米粒子由镧系离子纳米粒子制成，所述镧系离子纳米粒子包含铽离子和选自以下的至少第二镧系的离子：铈、镨、钕、钐、铕、镝、钬、铒、铥和镱。

优选地，此镧系离子纳米粒子还可含有第三镧系的离子，充当在可见和近红外区域中光谱学上沉默的主体基质，但是这有利地降低在光谱学上活性离子之间的自淬灭。

这些第三镧系离子可有利地为镧离子或镥离子，其可容易地由铽离子和另一种镧系的离子(第二镧系离子)掺杂，以获得本发明的共掺杂的镧系离子纳米粒子。

如果除了光谱特性外需要磁特性，那么钆离子还可有利地用作第三镧系离子。

所属领域技术人员可使用传统的可用方法在水介质中容易地合成镧系离子纳米粒子。它们可例如使用微波炉在水中实现，或在高压釜中通过水热合成来实现，如在此后的实例部分详细解释。

因此，当合成时，不同的镧系离子随机定位，一些在获得的纳米粒子的表面上，并且一些在核心中。

本发明人合成并表征了许多符合本发明的镧系离子纳米粒子，其中铽和其它镧系离子具有不同的掺杂水平。其几个实例收集在此后的实例部分的表1中。

对应于实例N°5和N°6的镧系离子纳米粒子通过透射电子显微镜、在超纯水中的动态光散射和X射线衍射表征。获得的结果在图1到6中说明。

如先前解释，本发明的发光纳米粒子通过发色团配体光敏化。这些发色团配体吸收光能并且通过天线效应将其转移到存在于纳米粒子的表面的镧系离子。

这些配体的性质的选择对于具有优异的配位以确保纳米粒子的溶解度和稳定性，以及得到期望的显著光谱特性是重要的。

选择根据本发明的配体，其中一个或几个发色团基团特异性地使铽离子光敏，这些发色团基团能够转移至少对应于铽的7F6到5D4跃迁的能隙的量的能量。

由于这个原因，已经选择基于二吡啶甲酸或2-羟基间苯二甲酸荧光团的发色团基团来敏化根据本发明的纳米粒子的Tb(III)离子。实际上，这些基团的三重态(分别为26600cm

二吡啶甲酸(左)和2-羟基间苯二甲酸(右)的分子式下文示出：

根据这些观察结果，已经合成具有不同连接基团和取代基的两个系列的配体。然而，与高度预先组织的用于镧系离子配位的常见配体矛盾，本发明的配体优先地以平面配位为目标，以确保纳米粒子的稳定，同时防止从镧系阳离子中浸出。

因此，本发明提供式I或式II包含一个或几个发色团基团的有利配体：

其中R选自H、CN基团或COOH基团。

根据另一个实施例，本发明提供式I或式II包含一个或几个发色团基团的有利配体：

其中R为4-乙基苯甲酸基。

这些发色团基团具有充当锚固点的氧和氮原子，其确保配体附接到镧系纳米粒子的表面，和芳香族部分，其能够强烈吸收光能并且随后将其转移到在其中它附接的镧系纳米粒子的表面处的铽离子。

根据本发明的配体的实例具体地说为下文表示的被称作L

此后示出配体的四个其它优先实例，被称作L1、L2、L3和L4：

此后示出配体的四个其它优先实例，被称作L6、L7、L8和L9：

那些配体实例L1到L5的合成方法在下文实例部分中描述。

那些配体实例L6到L9的合成方法也在下文实例部分中描述。

当配体包含几个发色团基团时，这些基团优先地通过被称作间间隔基团的碳链在配体内连接在一起，碳链的长度随配体的发色团基团的数量而增加。

如可从L1到L4看出，间隔基团优先地为含有一个或几个杂原子(例如氮原子)，具有至少与发色团基团一样多的臂来连接的支链碳链。

此外，我们可看到与L6到L8相同，间隔基团优先地为含有一个或几个杂原子(例如氮原子)，具有至少与发色团基团一样多的臂来连接的支链碳链。

有利地，根据本发明的配体还可包含能够共价附接受到分析关注的载体分子的接枝官能团。在此情况下，此接枝官能团也通过间隔基团连接到分子的其余部分。

在上述实施例的情况下，间隔基团可具有附加的臂来连接接枝官能团。

接枝官能团的性质取决于官能团所附接的载体或载体分子的性质。详述其化学结构以能够特异性并且共价连接到期望载体分子的化学结构。因此，所属领域技术人员可使调整此接枝结构以精确地对应于期望应用。

根据希望获得的标志或标记物，目标载体分子可不同。已经设想几种这类载体并且与本发明相容，其包括例如肽、蛋白、抗体、抗体部分，或分子量低于2000g.mol-1的小分子，如例如生物素或脱硫生物素。

在另一个实施例中，已经设想其它载体，并且与本发明相容，其包括例如肽LPFFD、肽KLVFF，或抗IgG(H+L)人抗体。

在将配体固定在镧系离子纳米粒子周围并且将受到分析关注的载体分子共价附接到配体之后，由于本发明，获得生物官能化的超亮发光纳米粒子。

如在图7上示意性地表示，根据其中实现步骤的顺序，两种不同的方式可能获得这类生物官能化的发光纳米粒子。

根据上文表示第一种方式，配体分子1，各自包含发色团基团2、间隔基团3和接枝官能团4，首先与可例如为肽或抗体的生物分子5(载体分子或载体)混合。这些生物分子5经由其接枝官能团4与配体分子1结合，并且获得生物官能化的配体分子6。

在第二步中，将镧系纳米粒子7混合到生物官能化的配体分子6，其借助于镧系纳米粒子7的发色团基团2涂布其表面。

根据下文表示的第二种方式，使配体分子1立即与镧系纳米粒子7接触。配体分子1的发色团基团2与镧系纳米粒子7的表面结合，由此形成涂布的纳米粒子8。

在第二步中，这些涂布的纳米粒子8与生物分子5混合。这些生物分子5与已经附接到镧系纳米粒子7的配体分子1的接枝官能团4共价结合。

两种描述的方式均导致获得根据本发明的生物官能化的发光纳米粒子9。由于生物分子5的空间位阻，它们在固定的涂布配体数量(在第二种方式中更重要)和在固定的生物分子的数量(在第一种方式中更重要)方面不同，并且因此可替代地由所属领域的技术人员根据目标应用选择。

因此，先前描述的配体L1到L4可有利地借助于载体分子的羟基、胺或硫醇官能团例如与配体L1到L4的接枝官能团反应来固定受到分析关注的载体分子，以便产生生物官能化的配体。

由配体L1实现的生物官能化的配体的两个具体实例已经由本发明人合成并测试。关于通过链霉亲和素和马妥珠单抗抗体的配体L1的生物官能化的这些实例将在此后实施例部分中详细描述。

关于有利地将发光纳米粒子生物官能化，本发明提供具有杰出的光谱特性的发光纳米粒子。

如先前解释，通过含有配体的合适的发色团涂布镧系离子纳米粒子，由于能量经由天线效应从发色团转移到位于纳米粒子的表面的铽离子，改善所得纳米粒子的亮度。

然而，那些表面铽离子必须通过在生物介质中围绕它们的水性环境的水分子振动淬灭，这不利地降低其激发态寿命并且降低其量子产率，并且由此随后降低其亮度。

为了解决此技术问题，本发明提供镧系纳米粒子，除了铽离子之外，所述镧系纳米粒子包含与铽不同的合适的第二镧系的离子。

此添加第二镧系离子的目的是促进位于纳米粒子的核心的镧系离子的发光。

实际上，位于纳米粒子的核心的镧系离子具有比表面离子更长的寿命和改善的本征量子产率，因为它们被保护免受介质的水分子的振动淬灭。但是，尽管如此，它们远离表面，并且不能通过充当天线的发色团配体有效地敏化。

通过引入第二镧系的离子，所述第二镧系适当地在以下中选择：铈、镨、钕、钐、铕、镝、钬、铒、铥和镱，以能够与铽离子配合，有利地获得这些核心离子的发光参与。

实际上，通过漏斗效应促进能量从位于纳米粒子的表面处的铽离子Tb

由于此有效的能量转移，表面铽离子用作中继来达到核心镧系离子并且使其光敏。因此，增强纳米粒子的光谱特性。纳米粒子的亮度得到改善，并且其在水性介质中的激发态寿命是同时延长。

在关于根据本发明并且包含涂布有配体L5分子的根据实例N°6的镧系纳米粒子的对发光纳米粒子进行的研究的图8到13中已经展示这种有利效果。

进行这些研究以理解在配体L5存在下实例N°6镧系纳米粒子的特性。通过由L5滴定，已经监测纳米粒子的吸收、激发和发射光谱。这些测试的目的是示出，使用在Tb与Eu之间的能量转移，L5对Tb(III)离子的敏化改善纳米粒子的Eu(III)离子在水中的光谱性质。

在图8中，含有La0.14Tb0.85Eu0.01F3纳米粒子([c]＝13.5pM)的缓冲溶液(TRIS/HCl，0.01M，pH＝7)已由配体L5滴定。所述操作包括添加增加体积的L5的水性溶液([c]＝5x10

a到l的每个曲线对应于不同增加的添加体积V的配体L5溶液。

曲线a对应于没有配体L5的单独的纳米粒子溶液，即对应于添加的体积V

曲线b到l分别对应于以下：对于曲线b，添加的L5配体溶液的体积V

如可在图8上观察到，溶液的吸收以与添加的配体的体积相同的方式增加。

如果如在图9上表示专门研究对应于配体L5的最大吸收带的在314nm处的吸收，可注意到，随添加的配体的浓度变化的在314nm处的吸收带增加为线性的。

同时，还通过荧光光谱(其中λ

如先前，曲线a'对应于没有配体L5的单独的纳米粒子溶液，即对应于添加的体积V

选择激发波长雃xc＝330nm，对应于配体L5的吸收波长。

对应于没有配体L5的纳米粒子溶液的曲线a'示出，当在330nm处激发时，纳米粒子的Tb和Eu发射极弱。曲线a′与横轴几乎重合。

首次添加对应于曲线b'的配体使Tb和Eu离子敏化，以获得发射光谱，其含有在485、545、584和621nm处的四个典型发射带以及具有在579nm、583-603nm、604-630nm、650nm和679-707nm处的窄带的铕的信号，其中最大发射在592nm处。

从曲线b'到曲线l'，这些发射带的重要性以与添加的配体量增加相同的方式增加。

对应于铽和铕的发射带可在图11的放大图上更容易观察到。

当添加大量配体时，在415nm区域中出现另一个发射带并增加。此带是由于在溶液中配体的荧光。

如可在图12上观察到，随添加的配体变化的光谱的不同峰强度的演化在用配体L5滴定期间存在不同的特性。

曲线a"示出在415nm处发射强度的演化，其对应于配体L5的发射带。正如预期的，随添加的配体的浓度变化的曲线a"几乎为直线。由于在溶液中未配位的配体L5分子的扩散，在当量体积(如下所解释)之后，曲线a"的斜率稍微增加。

曲线b"示出在545nm处铽的主带的发射强度的演化。在镧系纳米粒子的表面处键合的配体L5分子的数量增加时，在曲线b"的第一部分中铽的发射强度逐渐增加。然后，当镧系纳米粒子的表面完全被配体L5分子涂布时，达到最大值。此强强度发射是由于在纳米粒子的表面处的铽离子通过配体L5分子的光敏化。

与生长区域和最大区域有关的两条直线的点处的交点允许定义滴定的当量体积，其对应于完全涂布纳米粒子表面所需的最小配体溶液体积。在表示的情况下，当量体积为423μL(对应于浓度为8.8×10

已在分别对应于曲线c"和d"的614nm和700nm处的两个带上观察到铕发射的演化。从首次添加配体L5溶液开始，出现强发射并且两个带达到最大强度。随着下一次添加L5溶液，此发射保持恒定。

由曲线c"和d"所示的铕离子的强发射证明在表面处的铽离子通过配体L5光敏化随后有利地将能量定量转移到在纳米粒子的核心内的铕离子，正如在本发明中预期的。此重要发射不能由存在于表面的铕离子通过配体L5直接光敏化引起，因为配体L5分子很难使它们光敏，如在图13中说明。

实际上，在图13中，在对应于配体L5吸收的波长λexc＝330nm处激发之后，在缓冲溶液(TRIS/HCl 0.01M，pH 7.0)中存在配体L5溶液([L5]＝1.22×10

已经使用两种实验方法来合成镧系离子纳米粒子。

第一种方法使用微波照射。已经使用微波炉在水中实现了。

根据此第一种方法，已经在超纯水(milliQ water)中制备NH

合成的第一步在于将TbCl

在第二步中，已在室温下添加NH

然后第三步是在微波炉中将混合物在150℃下加热12min。允许在微波炉中的合成得到具有快速而精确的温度升高的常规加热，在中等温度下快速合成，并且因此预期产生大小分布窄的纳米粒子。

在9000tr/min下离心25分钟之后，除去上清液，并且在60℃下使用超生1h将白色固体分散在超纯水中，以获得纳米粒子的水性悬浮液。

第二种方法是在150℃下的水中在高压釜中水热合成。

除对应于加热的第三步以外，程序完全相同。在此方法的第三步中，已将混合物封装在钢反应器中并且已在150℃下在烘箱中加热2小时。

在离心之后，除去上清液并且超声分散，获得纳米粒子的水性溶液，其中与第一种方法相比，产率类似。

已经相应地合成镧系离子纳米粒子的不同实例，并且在下表1中示出：

要求保护的配体L1、L2和L3通过以下合成步骤和以下中间化合物1到7制备：

化合物1分通过以下两步获得：在存在NaOH的情况下通过KMnO

TLC:R

化合物2通过在EtOH中通过KOH的控制的化合物1的皂化获得，其中产率为76％。

TLC:R

化合物3通过在乙腈中使用EDCI和HOBt并且在存在三乙胺的情况下将化合物2与1,3-二氨基-2-丙醇肽偶联获得，其中产率为74％。

TLC:R

化合物4通过在78℃下在THF中使用化合物3、叔丁酸钾和叔丁基溴乙酸酯Williamson型亲核取代一小时获得，其中在纯化之后产率为51％。

TLC:R

化合物5通过在50℃下在二氯甲烷中使用三氟乙酸使叔丁基酯基去保护获得，其中产率为70％。

TLC:R

化合物6在0℃下在乙腈中使用EDCI和HOBt通过在5和-6-氨基己基氨基甲酸叔丁酯之间的肽偶联获得，其中产率为61％。

TLC:R

-1.30(m,4H,CH

化合物7通过在-78℃下在二氯甲烷中使用BBr

TLC:R

配体L1通过化合物7与对苯基-双异硫氰酸酯的反应获得，其中产率为88％。

TLC:R

配体L2通过在存在三乙胺的情况下在DMF中化合物7与2,5-二氧代吡咯啶-1-基-2-碘乙酸酯的反应获得，其中产率为57％。

配体L3通过在室温下在含有N-甲基吗啉的DMF中2,5-二氧代吡咯啶-1-基-3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酸酯和化合物7的反应获得，其中产率为53％。

要求保护的配体L4通过以下合成步骤和以下中间化合物1、2、10和11制备：

化合物1通过使用SOCl

化合物10通过在含有三乙胺的乙腈中使用EDCI和HOBt化合物2和(2-(双(2-氨基乙基)氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯的肽偶联获得，其中产率为84％。

TLC:R

化合物11在两步中获得，其在-78℃下在CH

TLC:R

配体L4通过在0℃下在含有Et

TLC:R

配体L5通过遵循下文合成步骤制备：

在a步骤中，以在存在碘甲烷(MeI)和碳酸钾(K

第二步b为在H

合成的最后一步c为在存在HBr/AcOH(50/50)的溶液的情况下通过O-去甲基化使化合物14的苯酚盐官能团去保护。配体L5通过沉淀和离心获得，其中产率为60％。

配体L6通过遵循下文合成步骤制备：

化合物2溶解在亚硫酰氯中。将溶液在90℃下加热5h。在蒸发之后，添加乙醇胺和蒸馏的三乙胺。提取粗产物。在使用硅胶通过FPLC纯化之后，获得化合物15。

TLC：0.3(SiOH,DCM/MeOH)；NMR

化合物15溶解在具有BBr

TLC：0.87(C

配体L7通过遵循下文合成步骤制备：

Fmoc-Lys(Boc)-OH溶解在三氟乙酸中。将溶液在室温搅拌过夜。在减压下蒸发溶液，以得到化合物16。

NMR

化合物16溶解在具有3-(氯甲酰基)-2-甲氧基苯甲酸乙酯和二异丙基乙胺的蒸馏的THF(100mL)中。通过H

NMR

化合物18已通过固体支撑物合成。化合物18用BBr

ESI

配体L8通过遵循下文合成步骤制备：

如先前，2-甲氧基间苯二甲酸的羧酸已经被亚硫酰氯活化，并且在蒸发溶剂之后，添加具有三乙胺的乙醇以形成二酯1。

ESI

元素分析C

第二步为用单当量的NaOH的典型皂化，以在提取之后得到一元酸2。

ESI

元素分析纯C

同时，用二碳酸二叔丁酯实现己二胺连接基的保护，以具有叔丁氧羰基(BOC)基团，得到化合物19。

ESI

元素分析C

ESI

元素分析C

对于步骤e，得到化合物21的反应为通过BBr

ESI

元素分析C

对于在产物21上的游离羧酸和游离胺，在连接基团上的胺的活化对于促进其后的偶联是必需的。选择使用N,N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯将伯胺变成活化的氨基甲酸酯L8。

ESI

元素分析C

配体L9通过遵循下文合成步骤制备：

从白屈氨酸开始，合成的第一步是通过使用Robison方法活化羧酸和通过亚硫酰氯活化4-氧位，并且用EtOH酯化，以形成4-氯吡啶-2,6-二甲酸二乙酯(22)。

在超声下在存在大量碘化钠和乙酰氯的情况下，氯离子被碘离子取代(23)。

HRMS(MALDI-TOF)：m/z＝349.66([M+H]

Sonogashira偶联用于用四(三苯基膦)钯(0)、碘化铜(I)、三乙胺和三甲基硅烷基乙炔(TMS-乙炔)将乙炔基团添加到结构(24)

HRMS(MALDI-TOF)：m/z＝320.07([M+H]

在纯化之后，三甲基甲硅烷基可在THF中通过四正丁基氟化铵(TBAF)去保护，以得到化合物25。

HRMS(MALDI-TOF)：m/z＝248.00([M+H]

化合物26通过在化合物25和4-碘苯甲酸之间的Sonogashira偶联获得。

HRMS(MALDI-TOF)：m/z＝367.39([M+H]

合成的最后一步为用NaOH皂化酯，以产生配体L9。

HRMS(MALDI-TOF)：m/z＝311.94([M+H]

链霉亲和素为四聚体蛋白，其与生物素具有非常强的亲和力。由于可为抗原和抗体之间的相互作用，生物技术中经常使用的此强相互作用代表生物强相互作用的典型实例。

在此实例中，配体L1用于标志链霉亲和素，其目的是产生能够固定生物素的超亮发光纳米粒子。

在存在10当量的化合物L1的情况下，在室温下在缓冲水性溶液中标记链霉亲和素。标记的链霉亲和素通过在尺寸排阻过滤器(密理博(Millipore)，截留10kDa)上离心来纯化。通过UV-可见吸收确定链霉亲和素的标志率(配体L1比链霉亲和素的数)，其中标记的链霉亲和素的光谱被解卷积为单独的链霉亲和素的光谱和配体L1的线性组合。获得配体比链霉亲和素的标志率为2.1。

马妥珠单抗抗体为人单克隆抗体，其特异性地识别在一些癌症(肺、食道、胃...)中过度表达的表皮生长因子受体(EGFR)。通过马妥珠单抗标记的发光纳米粒子可用于表皮生长因子受体的发光显微镜成像或通过氟免疫学在溶液中检测发光纳米粒子。

在此实例中，配体L1用于标志马妥珠单抗抗体，其目的是产生能够固定表皮生长因子受体的超亮发光纳米粒子。

将13.2μL的3.23mM于DMSO中的配体L1溶液添加到10.4μL的含有马妥珠单抗的1mg.mL-1溶液(128μM)和176μL的pH 9.0碳酸盐缓冲液(L1/马妥珠单抗比＝32/1)。混合样品，安置在铝片中，然后在常规搅动下在室温下保温4小时30分钟。在通过超离心纯化之后，用pH 8.04 TRIS/HCl缓冲液洗脱和冲洗，获得体积80μL的最终溶液。将最终溶液用TRIS/HCl缓冲液稀释五倍。

抗体和配体浓度通过UV-可见吸收光谱确定。获得抗体浓度为1.49μM，并且配体比抗体的标志率为2.9-3.0。

肽KLVFF为负责形成淀粉状蛋白纤维的氨基酸序列。选择此肽是因为发现它在区域中折叠成β-片，淀粉状蛋白纤维的特征结构形成，并且将产生与突触的更好的相互作用。知道这些β-淀粉状蛋白纤维在海马体中大大聚集，想法是用肽KLVFF特异性地靶向这些纤维(图25)，以进行阿尔茨海默病的早期诊断。

在此实例中，肽KLVFF已与配体L8偶联，其目的是产生能够固定β-淀粉状蛋白纤维的超亮发光纳米粒子。

将肽KLVFF(37mg，5.67×10

使用PerkinElmer Lambda 950光谱仪或来自Jena Analytics的Specord光谱仪在1cm光径石英超硅电池(豪玛(Hellma))中记录UV-Vis吸收光谱。

使用450W氙灯和Hamamatzu R928红色光电倍增器在FLP920 EdinburghInstrument分光光度计上记录发光光谱。使用供应商提供的仪器功能校正所有光谱。当必要时，使用399nm高通滤波器去除二次伪影。

根据描述于以下的常规程序用光学稀释溶液(光密度<0.05)测量发光量子产率：《分子荧光：原理和应用(olecular Fluorescence:Principles and Applications)》,第2版；Valeur,B.,Berberan-Santos,M.N.编；威立-德国化学学会出版社：魏因海姆，2013，使用在水中的[Ru(bipy)

量子产率的估计误差为±15％。

亮度被计算为在激发波长处的摩尔吸收系数(通过将比尔-朗伯定律应用于吸收光谱来计算)乘发光量子产率的乘积。

使用在10Hz下工作的100W氙闪光灯在MCS模式下将发光寿命记录在同一台仪器上，时间窗口至少是所测量的最长激发态寿命的五倍。激发和发射狭缝通常设置为5和3nm的孔径。在存在配体的情况下，在纳米粒子的最大激发光谱的最大值处，选择激发波长随配体变化。当最大强度达到10 000计数时，停止采集。

寿命估计错误为±10％。

在所有实验中，用1984μL的在pH 7.0下的0.1M TRIS/HCl缓冲液稀释16μL的纳米粒子的母液。然后通过在相同的缓冲液中添加增加量的配体的5×10

如已经宣布，本发明提供在激发态寿命方面杰出的结果。

遵循上文详细描述的测量方法，通过在根据本发明的纳米粒子的几个实例上实现的实验测量已经展示这类有利结果。

在对应于配体L5吸收的波长λ

在下表2中已经收集获得的结果：

对于每种实例化合物，最长测量激发态寿命(τ

如可观察到，最长测量激发态寿命(τ

另外，并且如在现有技术中从未获得的，这些格外长的激发态寿命测量值非常接近于铕的辐射寿命理论值，所述理论值为计算值每种元素的理论值，其构成此元素的激发态寿命的最大可达值。

对于铕水性离子，此辐射寿命理论值对应于9.7毫秒，如通过Bünzli,J.C.G.《化学评论》2010,110,2731公开于现有技术中。

此外，根据本发明的纳米粒子的此格外长激发态寿命不以纳米粒子的亮度为代价获得。实际上，还遵循上文详细描述的测量方法测量根据本发明的化合物的重要亮度值。

在下表3中已经收集测量的亮度结果：

同样，测量值示出根据本发明的纳米粒子的亮度远高于10

如上文展示，根据本发明的发光镧系纳米粒子为技术问题提供非常有效的解决方案，远超过在现有技术中提出的那些解决方案。

显然，本发明不限于上文所描述的优选的实施例，并且在各个图中示出，所属领域的技术人员能够在不超出如在所附权利要求书中定义的本发明的框架和范围的情况下进行许多修改并且设想其它实施例。