一种离体诱导桃单倍体染色体加倍的方法

摘要

本发明公开了一种离体诱导桃单倍体染色体加倍的方法。本发明所提供的离体诱导桃单倍体染色体加倍的方法为浸泡法或培养基法。所述浸泡法包括：将桃单倍体组培苗茎段置于浓度为1000‑5000mg/L的秋水仙素溶液中浸泡处理1‑4天。所述培养基法包括：将桃单倍体组培苗茎段接种在含终浓度为500‑2000mg/L秋水仙素的培养基中共培养1‑4周。实验证明，利用本发明建立的离体诱导桃单倍体染色体加倍技术能够高效得到纯合二单倍体，本发明为桃遗传学研究及加速育种进程奠定了坚实的基础。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种离体诱导桃单倍体染色体加倍的方法。

背景技术

桃原产我国，是世界上栽培最为广泛的温带果树之一，目前栽培桃的国家和地区达70多个，是重要的经济树种。中国是世界上产桃最多的国家。它的染色体数目少(2n＝16)，基因组小，约为230MB，只有拟南芥基因组的两倍，加之其能够自交结实，实生苗开始结果早，育种周期短，世代交替快，品种类型多，基因资源丰富，是最适合进行遗传学研究的多年生果树种类。世界范围内种植的桃新品种获得的主要途径是常规杂交育种，育成的众多桃、油桃和蟠桃等系列品种在生产中得到了广泛应用。随着人们的生活水平不断提高，品种的更换速度也越来越快，农业生产对新品种的要求也越来越高。单纯依靠常规技术选育作物新品种，周期长、效率低，已不能满足当前生产对品种的需求；育种手段由传统常规技术向现代高效技术转变已是大势所趋。

现有的桃品种均为高度杂合的二倍体，很难由此作出较为准确的遗传分析结果。因此，获得纯合二单倍体有着非常重要的意义。桃单倍体植株是育种和遗传规律研究的良好材料。由于单倍体的基因没有等位基因，所以单倍体植株的每一个基因，无论显性基因或隐性基因都要表现出对性状发育的作用，因而它是研究桃基因定位、基因性质和基因作用表达的良好材料。桃单倍体多数来自于杂种实生，且杂种实生苗中出现单倍体的几率仅约为1/1000。因此，每一株单倍体资源都非常珍贵。利用单倍体人工加倍得到纯合二单倍体，将对桃遗传学研究及加速育种进程奠定坚实的基础，意义重大。

而国内目前没有桃单倍体诱导加倍的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种离体诱导桃单倍体染色体加倍的方法。

本发明所要求保护一种离体诱导桃单倍体染色体加倍的方法，可为浸泡法或者培养基法。

所述浸泡法可包括如下步骤：将桃单倍体组培苗茎段置于浓度为1000-5000mg/L的秋水仙素溶液中浸泡处理1-4天。

进一步地，所述浸泡法可包括如下步骤：将桃单倍体组培苗茎段置于浓度为2000mg/L的秋水仙素溶液中浸泡处理2-4天。

更进一步地，所述浸泡法可包括如下步骤：将桃单倍体组培苗茎段置于浓度为2000mg/L的秋水仙素溶液中浸泡处理4天。

所述方法中，将桃单倍体组培苗茎段置于秋水仙素溶液中进行浸泡处理的过程中还可以加以震荡处理(如120rpm摇床震荡)。

在将桃单倍体组培苗茎段置于秋水仙素溶液中进行浸泡处理后，还可包括如下步骤：将所述桃单倍体组培苗茎段接种到改良F

所述培养基法可包括如下步骤：将桃单倍体组培苗茎段接种在含终浓度为500-2000mg/L秋水仙素的培养基中共培养1-4周。

进一步地，所述培养基法可包括如下步骤：将桃单倍体组培苗茎段接种在含终浓度为1000mg/L秋水仙素的培养基中共培养2-3周。

在将所述桃单倍体组培苗茎段接种到含有秋水仙素的培养基中共培养后，还可包括如下步骤：将所述桃单倍体组培苗茎段转接到不含有秋水仙素的所述培养基上培养，待叶芽生长出无菌苗时(如苗长高至3-4cm时)，进行倍性鉴定(如取叶片使用流式细胞仪进行倍性鉴定)。

其中，所述培养基可为改良F

所述桃单倍体组培苗茎段可按照包括如下步骤的方法制备得到：以幼嫩茎尖为外植体，将外植体接种在改良F

在本发明中，前文所述改良F

在本发明中，前文所涉及到的所述培养的条件均可为：温度24土1℃，光周期16/8h，光照强度约为2500lx。培养3-4周后转接到新的所述改良F

在本发明中，所述桃单倍体具体为桃单倍体‘96-5-9’。

实验证明，选取特异种质桃单倍体‘96-5-9’，本发明成功建立了离体诱导桃单倍体染色体加倍技术。采用浸泡法，秋水仙素浓度2000mg/L秋水仙素处理2～4天可获得较为理想的诱变效果。采用培养基法，秋水仙素浓度浓度1000mg/L处理时间2～3周均可获得较为理想的诱变效果。利用本发明建立的离体诱导桃单倍体染色体加倍技术能够高效得到纯合二单倍体，本发明为桃遗传学研究及加速育种进程奠定了坚实的基础。

附图说明

图1为茎段浸泡法处理桃单倍体。A为组培苗茎段浸泡于诱变剂溶液中；B为处理后的茎段接种至改良F

图2为培养基法处理桃单倍体。A为组培苗茎段接种至含诱变剂的F

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

桃单倍体‘96-5-9’：记载在“郭继英等.桃单倍体植株的主要特征特性.中国园艺学会桃分会第二届学术年会，2010年9月29日”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用。

改良F

实施例1、离体诱导桃单倍体染色体加倍方法的建立

选取特异种质桃单倍体‘96-5-9’，以幼嫩茎尖为外植体，取当年生新梢，先用洗洁精漂洗，再用流水冲洗3小时。然后剪取带有叶芽的茎段于超净工作台进行消毒处理，然后用无菌水冲洗3遍，在无菌条件下修剪成1cm长带单芽茎段，接种在改良F

离体化学诱变剂处理采用浸泡法和培养基法两种方法。

①浸泡法：将桃单倍体组培苗茎段取出后放入配制好的诱变剂溶液(秋水仙素溶液)中浸泡处理，处理期间至于转速120rpm摇床，然后将处理一定时间后的茎段接种在正常的改良F

②培养基法：将桃单倍体组培苗茎段接种在预先配制的含化学诱变剂的改良F

两种方法均记录接种茎段数和处理后20天后死亡的茎段数。浸泡法和培养基法的每个处理组合茎段单独增殖扩繁，作为1个株系进行编号。当继代的每个株系达到3份时，取出1份进行倍性鉴定，其余1～2份根据鉴定结果选择去留和继续繁殖。根据化学诱变加倍的处理效果，确定该诱变剂适宜的浓度和时间组合。

待叶芽生长出无菌苗长高至3-4cm时，取约0.5cm

结果显示：

采用茎段浸泡法，在秋水仙素浓度1000mg/L至5000mg/L范围内，随着秋水仙素浓度的升高和处理时间的延长，死亡率呈上升趋势，且均产生了不同程度的变异，诱变率随秋水仙素浓度的升高和处理时间的延长表现为先上升后下降，以浓度2000mg/L秋水仙素处理效果最佳，死亡率低，变异率相对较高，并且获得了2个纯合二单倍体。浓度为2000mg/L秋水仙素处理组培苗茎段1天、2天、3天和4天的死亡率分别为5.0％、10.0％、9.5％和12.5％，而该组合诱变率分别为12.5％，25.0％、25.0％和40.0％；浓度为1000mg/L秋水仙素处理组培苗茎段1天、2天、3天和4天的死亡率分别为0.0％、4.8％、5.0％和5.4％，而该组合诱变率分别为0.0％，16.7％、11.1％和20.0％；浓度为5000mg/L只有1天处理获得变异，其它处理变异率均为0％。综合诱导结果分析，采用浸泡法，秋水仙素浓度2000mg/L秋水仙素处理2～4天可获得较为理想的诱变效果(表1和图1)。

采用培养基法，在秋水仙素浓度500mg/L至2000mg/L范围内，秋水仙素浓度的升高和处理时间的延长，死亡率略有上升，大部分可以正常生长。诱变率随秋水仙素浓度的升高而提高，诱变率随处理时间的延长表现为先上升后下降。浓度1000mg/L、2000mg/L秋水仙素处理变异率优于浓度500mg/L处理，在浓度1000mg/L和2周、3周处理中还获得了2个纯合二倍体。浓度为1000mg/L秋水仙素处理1周、2周、3周和4周的诱变率分别为63.6％、30.0％、33.3％和20.0％；浓度为2000mg/L秋水仙素处理1周、2周、3周和4周的诱变率分别为20.0％、20.0％、50.0％和100.0％。综合诱导结果分析看，采用培养基法，秋水仙素浓度1000mg/L处理时间2～3周均可获得较为理想的诱变效果(表2和图2)。

上述结果表明，利用本发明建立的离体诱导桃单倍体染色体加倍技术(浸泡法和培养基法)能够高效得到纯合二单倍体，本发明为桃遗传学研究及加速育种进程奠定了坚实的基础。

表1、秋水仙素浓度和处理时间对单倍体诱变效果的影响(离体浸泡法)

表2、秋水仙素浓度和处理时间对单倍体诱变效果的影响(培养基法)

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。