一种大肠杆菌中高效表达禽腺病毒Fiber-2蛋白的方法

摘要

本发明属于生物工程技术领域，公开了一种大肠杆菌中高效表达禽腺病毒Fiber‑2蛋白的方法。分别以PET‑21a‑GX‑1‑fiber2质粒和PXMJ19‑C1786T‑hexon(T7)质粒为模板，通过设计的引物进行扩增，得到Fiber‑2目的片段和PXMJ19‑C1786T‑T7载体片段；然后进行同源重组，得到重组质粒PXMJ19‑T7‑his‑fiber2；最后转化至Shuffle T7‑B感受态细胞进行Fiber‑2蛋白的表达。本发明采用能提高外源基因拷贝数的质粒作为载体，构建PXMJ19‑T7‑his‑fiber2重组质粒，来增强Fiber‑2蛋白的可溶性表达。

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体为一种大肠杆菌中高效表达禽腺病毒Fiber-2蛋白的方法。

背景技术

禽腺病毒属于腺病毒科，禽腺病毒属，存在于家禽中，鸡、鸭、鹅等都是其易感宿主。禽腺病毒传染性较强且传播稳定，一般在宿主体内并不致病，是一种机会性的病原体。近年来，中国的主要流行株是血清4型和8b型禽腺病毒，其中血清4型病毒株占据主导地位。FADV4首次报道于1987年8月，发现地区在巴基斯坦安加拉。2015年爆发的血清4型流行株HN株致病性强，致死率高，与经典毒株存在较大差异，为养禽业带来了巨大的损失，因此对该流行株的研究十分迫切且必要。禽腺病毒的纤突蛋白包括Fiber-1和Fiber-2，Fiber-1蛋白较长，而Fiber-2蛋白较短，均与病毒的感染性及致病性密切相关。纤突蛋白不仅含有禽腺病毒的主要种特异性抗原决定族和次要亚属特异性抗原决定族，还能决定病毒对宿主细胞的嗜好，启动病毒的感染。Fiber-1一旦缺失会导致宿主体内的病毒数量下降，而Fiber-2缺失会造成病毒粒子无法形成。因此，血清4型流行株(HN株)的Fiber-2蛋白可能与病毒毒力增强相关，且该蛋白作为亚单位疫苗可能具有保护效价。综上所述，血清4型禽腺病毒流行株(HN株)纤突蛋白Fiber-2的抗体制备是探究Fiber-2蛋白与禽腺病毒毒力增强是否相关的前提，也是进一步探索血清4型禽腺病毒的免疫学功能和发病机制的基础，对禽腺病毒的监控预防及感染病毒后的针对性治疗也具有重要的意义。

郭浩然等公开了一种禽腺病毒4型Fiber2蛋白表达、纯化及多克隆抗体的制备.《农业生物技术学报》2019年10期。该文献公开了根据密码子优化后的FAdV-4Fiber2全基因合成序列进行了体外扩增，再将其克隆入p Cold表达载体，构建原核表达载体pCold-Fiber2。pCold-Fiber2重组质粒转化至大肠杆菌(Escherichia coli)PGTf2感受态细胞，经异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalac toside,IPTG)诱导表达后纯化Fiber2蛋白，用该蛋白免疫家兔(Oryctolagus cuniculus)，成功制备了抗FAdV-4Fiber2蛋白多克隆抗体。Western blot和间接免疫荧光试验(indirected immunofluorescence assay，IFA)结果表明，抗FAdV-4Fiber2蛋白多克隆抗体纯化后可与Fiber2蛋白和FAdV-4发生特异性反应，证明Fiber2蛋白具有良好的免疫原性。建立的FAdV-4抗体间接ELISA检测方法显示该方法检测灵敏性为96％，特异性为100％。专利CN 110128508 A公开了一种禽腺病毒fiber蛋白亚单位疫苗。使用禽腺病毒新型的抗原fiber蛋白，对序列进行优化后使fiber蛋白在大肠杆菌中获得可溶性的表达，表达产物制备亚单位疫苗。专利CN 109750036 A公开了一种核苷酸序列、使用其提高蛋白表达效率的方法及应用。所述方法包括：步骤(1)将含所述蛋白基因的所述重组载体转化大肠杆菌，所述重组载体为重组表达载体；以及步骤(2)表达所述蛋白；所述蛋白的表达为多蛋白的串联共表达或融合表达；所述蛋白基因的重组表达载体为重组pET28质粒、pColdIII质粒、或pCDFDuet质粒，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)；所述蛋白基因为鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白、禽腺病毒Penton蛋白、禽腺病毒Fiber-2蛋白、禽减蛋综合征病毒Penton蛋白、或禽减蛋综合征病毒Fiber蛋白中的一种或一种以上。

上述文献及专利方法虽然实现了Fiber2蛋白的表达，但在表达载体的制备方面及可溶性表达优化方面还有进一步改善的空间。

发明内容

针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种大肠杆菌中高效表达禽腺病毒Fiber-2蛋白的方法。本发明方法采用经改造后的PXMJ19质粒PXMJ19-C1786T-hexon(T7)为原核表达载体(来源于CN 110951767 A，一种具有高拷贝能力的棒状杆菌和大肠杆菌双表达载体及其构建方法中的PXMJ19-C1786T质粒)，构建PXMJ19-T7-his-fiber2重组质粒来促进Fiber-2蛋白的高效可溶性表达。并采用增强型菌株Shuffle T7-B促进异源蛋白的高效表达。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种大肠杆菌中高效表达禽腺病毒Fiber-2蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)以PET-21a-GX-1-fiber2质粒为模板，Fiber-2-F，Fiber-2-R为引物进行扩增，得到Fiber-2目的片段；

(2)以PXMJ19-C1786T-hexon(T7)质粒为模板，PXMJ19-T7-his-F，PXMJ19-T7-his-R为引物进行扩增，得到PXMJ19-C1786T-T7载体片段；

(3)将Fiber-2目的片段和PXMJ19-C1786T-T7载体片段进行同源重组，得到重组质粒PXMJ19-T7-his-fiber2；

(4)将重组质粒PXMJ19-T7-his-fiber2转化至Shuffle T7-B感受态细胞进行Fiber-2蛋白的表达；

所述引物序列分别如下：

Fiber-2-F：AAGAAGGAGATATAATGCTGCGTGCGC；

Fiber-2-R：AGCCGGATCTCATCAGTGGTGGTGG；

PXMJ19-T7-his-F：CCACCACCACTGATGAGATCCGGCT；

PXMJ19-T7-his-R：CACGCAGCATTATATCTCCTTCTTA；

所述PET-21a-GX-1-fiber2质粒的核苷酸序列为SEQ ID NO:6，其质粒图谱如图1所示。

所述PXMJ19-C1786T-hexon(T7)质粒的核苷酸序列为SEQ ID NO:7，其质粒图谱如图2所示。

进一步地，步骤(1)所得Fiber-2目的片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:8。

进一步地，步骤(2)所得PXMJ19-C1786T-T7载体片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:9。

进一步地，步骤(3)中所述同源重组条件为：

将Fiber-2目的片段和PXMJ19-C1786T-T7载体片段按体积比为1:2加入到反应液中，摇匀后，在37℃水浴锅中孵育30min，然后放置4℃或冰上冷却，得到重组产物。

进一步地，步骤(4)中所述将重组质粒PXMJ19-T7-his-fiber2转化至Shuffle T7-B感受态细胞的步骤为：取重组质粒PXMJ19-T7-his-fiber2加入到Shuffle T7-B感受态细胞中混匀，冰上静置30min，42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2-3min，加入SOC培养基，37℃及转速200-250rpm摇菌1h；将含氯霉素抗性的LB固体培养基在37℃培养箱中预热，离心弃掉上清液，用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒均匀涂在含氯霉素抗性的平板培养基上，37℃培养箱中倒置培养12-16h。

进一步地，步骤(4)中所述Fiber-2蛋白的表达步骤如下：

挑取转化培养后的单菌落，接种到带氯霉素抗性的LB固体培养基中，30℃，200rpm震荡培养细菌至对数生长期(OD600＝0.4-0.8)，加入终浓度为1mM的IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)，至摇床中16℃诱导15h。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)采用一种能提高外源基因拷贝数的质粒PXMJ19-C1786T-hexon(T7)(来源于CN110951767 A，一种具有高拷贝能力的棒状杆菌和大肠杆菌双表达载体及其构建方法中的PXMJ19-C1786T质粒；具体核苷酸序列为SEQ ID NO:6，质粒图谱如图2)作为载体，构建PXMJ19-T7-his-fiber2重组质粒，来增强Fiber-2蛋白的高效可溶性表达。

(2)采用特定的质粒模板分别扩增目的片段和载体片段，直接采用同源重组得到重组质粒PXMJ19-T7-his-fiber2；无需酶切及采用连接酶，减少操作步骤。

(3)本发明方法并不需要对Fiber-2目的片段进行优化或改变，而是采用突变一个碱基改造后的PXMJ19-C1786T-T7作为载体，提高目的蛋白的复制效率，相比对目的片段进行优化更简单而又降低异源序列造成的影响。

(4)本发明采用一种增强型菌株Shuffle细菌Shuffle T7-B，为Lon和OmpT蛋白酶缺陷型，适用于T7启动子启动的蛋白表达，增强Fiber-2在大肠杆菌中的表达。

(5)本发明采用不同转化条件及表达条件优化Fiber-2蛋白的可溶性表达。

附图说明

图1为本发明模板质粒PET-21a-GX-1-fiber2的结构图；

图2为本发明模板质粒PXMJ19-C1786T-hexon(T7)的结构图；

图3为实施例中Fiber-2目的片段扩增产物的凝胶电泳鉴定结果图；

图4为实施例中PXMJ19-C1786T-T7载体片段扩增产物的凝胶电泳鉴定结果图；

图5为实施例中重组产物的菌液鉴定结果图；

图6为实施例中重组产物用NdeI、SacI双酶切后的凝胶电泳鉴定结果图；

图7为实施例中在不同感受态细胞中转化及在不同温度和时间下表达所得菌体经超声裂解后，沉淀和上清进行SDS-PAGE凝胶电泳实验的结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

以下实施例中主要试剂及来源说明：

TaqDNA聚合酶、10×PCR Buffer(without Mg

以下实施例中主要仪器型号及来源说明：

双控温干式恒温器(杭州米欧仪器有限公司)；HC-2518R高速冷冻离心机(安徽中科中佳仪器有限公司)；DYY-6C型稳压稳流电泳仪(北京六一)；H6-1微型电泳槽(上海精益有机玻璃制品仪器厂)；FR980凝胶成像系统(上海复日科技有限公司)；SMA4000微量分光光度计(merinton)；PCR反应扩增仪(BIO公司)；移液器(范围100-1000μl，20-200μl，0.5-10μl)(加拿大BBI公司)；PCR仪T100(BIO-RAD)、电子天平(赛多利斯)；一恒生化培养箱；恒温培养摇床(一恒)；三孔电热恒温水槽(一恒)；脱色摇床(其林贝尔)。

以下实施例中引物设计及来源说明：

根据SnapGene软件，采用同源重组技术设计基因Fiber-2、载体PXMJ19-T7-his及菌液鉴定的通用引物L4440-F，在生工生物工程(上海)股份有限公司合成，设计引物如下表1：

表1.引物组及序列

实施例

(1)Fiber-2目的片段的扩增：

以PET-21a-GX-1-fiber2(核苷酸序列为SEQ ID NO:6，其质粒图谱如图1所示)为模板，Fiber-2-F，Fiber-2-R为引物扩增Fiber-2目的片段，扩增PCR体系和程序分别如下表2和表3所示。

表2.Fiber-2扩增PCR体系

表3.Fiber-2扩增PCR程序

PCR扩增结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定，结果如图3所示。在1505bp左右出现明显目的条带，于紫外光线下将含有目的条带的凝胶切下，尽量使切下的凝胶大小恰好包含所有目的条带，不要过大，切胶时要快速，切完立刻关闭紫外线，防止目的片段受到紫外线过度照射而降解。将切好的凝胶转移到2mL的EP管中，进行胶回收，并测定DNA浓度。扩增产物核苷酸序列为SEQ ID NO:8。

(2)载体片段PXMJ19-C1786T-T7的扩增：

以PXMJ19-C1786T-hexon(T7)质粒(核苷酸序列为SEQ ID NO:7，其质粒图谱如图2所示)为模板，PXMJ19-T7-his-F，PXMJ19-T7-his-R为引物扩增PXMJ19-C1786T-T7载体片段。扩增PCR体系和程序分别如下表4和表5所示。

表4.PXMJ19-C1786T-T7扩增PCR体系

表5.PXMJ19-C1786T-T7扩增PCR程序

PCR扩增结束后进行0.8％核酸凝胶电泳鉴定，结果如图4所示。在6516bp左右出现明显目的条带，于紫外光线下将含有目的条带的凝胶切下，尽量使切下的凝胶大小恰好包含所有目的条带，不要过大，切胶时要快速，切完立刻关闭紫外线，防止目的片段受到紫外线过度照射而降解。将切好的凝胶转移到2mL的EP管中，进行胶回收，并测定DNA浓度。扩增产物核苷酸序列为SEQ ID NO:9。

(3)将Fiber-2目的片段和PXMJ19-C1786T-T7载体片段进行同源重组：

胶回收结束后将目的片段和载体片段按照合适的体积，于冰上配置如表6的反应体系。

表6.同源重组体系

温柔的轻轻摇匀后，在37℃水浴锅中孵育30min，然后放置4℃或冰上冷却，得到重组产物。

1、对重组产物进行菌液鉴定，具体步骤如下：

在冰上解冻克隆用的化学感受态细胞shuffle-T7-B细胞，取10μl重组产物加入到100μl感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置30min。42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2-3min。加入900μl SOC培养基，37℃摇菌1h(转速200-250rpm)。将相应含氯霉素抗性的LB平板固体培养基在37℃培养箱中预热。5,000rpm离心5min，弃掉900μl上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒涂在有含氯霉素抗性的平板上轻轻涂匀。37℃培养箱中倒置过夜(12-16h)培养。过夜培养后，查看平板的菌落并分别挑取其中9个菌落，置于加有含氯霉素抗性的LP培养基的2mL EP管中，在37℃的摇床中培养约5个小时，然后进行菌液鉴定，结果如图5所示，大小均为2389bp左右，与理论值大小相符合。鉴定PCR体系如下表7所示，扩增产物核苷酸序列为SEQ ID NO:10。

表7.菌液鉴定PCR体系

2、对重组产物进行酶切鉴定及测序，具体步骤如下：

a)重组质粒提取：

取鉴定阳性的菌液100uL于加有含氯霉素抗性的LB培养基的50mL离心管中进行大摇，过夜培养。取15ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，尽量吸除上清。向留有菌体沉淀的离心管中加入500μl溶液P1(天根DP103-03质粒小提试剂盒)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。向离心管中加入500μl溶液P2(天根DP103-03质粒小提试剂盒)，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。向离心管中加入700μl溶液P3(天根DP103-03质粒小提试剂盒)，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm(～13,400×g)离心10min。注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。将收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3(使用前先进行柱平衡：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液BL，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中)中12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW(先加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。重复PW漂洗步骤，然后将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min将质粒溶液收集到离心管中，即得重组质粒。

b)酶切鉴定及测序：

用NdeI、SacI双酶切，酶切体系共300uL，分成6管，每管50uL，体系如下表8所示：

表8酶切体系

酶切结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定，结果如图6所示(M：依次是8000、5000、3000、1500、1000、500；1：NdeI、SacI双酶切片段)。片段大小分别为2714bp、5258bp，与理论值大小相符合。条带经鉴定正确后，送去生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12，与理论值完全相同。

(4)将重组质粒PXMJ19-T7-his-fiber2转化至Shuffle T7-B感受态细胞进行Fiber-2蛋白的表达(并以BL21感受态细胞作为对比)：

a)化学转化：

取重组质粒PXMJ19-T7-his-fiber2 10ng分别加入到100μl BL21、Shuffle T7-B感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置30min。42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2-3min。加入900μl SOC培养基，37℃摇菌1h(转速200-250rpm)。将相应含氯霉素抗性的LB平板固体培养基在37℃培养箱中预热。5,000rpm离心5min，弃掉900μl上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒涂在有含氯霉素抗性的平板上轻轻涂匀。37℃培养箱中倒置培养12-16h。标记转化至感受态细胞BL21的板为A，转化至感受态细胞Shuffle T7-B的板为B。

b)蛋白表达：

在板A、B中挑取单菌落，分别接种到含10ml带氯霉素抗性的LB培养基中；均过夜培养，抽取1mL添加至20mL的氯霉素抗性LB培养基中；30℃，200rpm震荡培养细菌至对数生长期(OD600＝0.4-0.8)；把两瓶菌液各等分成2瓶，每瓶均10mL，每瓶加入IPTG到终浓度为1mM，分别移至摇床中，均按30℃诱导8小时、16℃诱导过夜(15h)进行实验；诱导完成后，离心收集菌体；加入无菌的PBS和万分之一的EDTA；超声波裂解，直至溶液清亮，12000rpm离心1min，分别收集包涵体沉淀和裂解上清；包涵体沉淀再用PBS重悬(含万分之一的EDTA)。

对所得沉淀和上清进行SDS-PAGE凝胶电泳实验，结果如图7所示(从左至右分别是180KDa maker、Fiber-2阳性样品(+)、重组质粒PXMJ19-T7-fiber2在Shuffle细胞上清和沉淀表达、PXMJ19-T7-fiber2在BL21细胞中的上清和沉淀中的表达；其中s代指上清，p代表沉淀)。由图7结果可知：

1)重组质粒在BL21细胞中，菌液上清和沉淀中的Fiber-2的蛋白表达较少，明显低于重组质粒在shuffle细胞中Fiber-2的蛋白表达。

2)重组质粒在shuffle细胞中，菌液上清和沉淀中的Fiber-2蛋白表达，在16℃诱导培养15h后高于30℃诱导培养8h，可见低温及增加培养时间有助于蛋白结构的溶解和折叠；而对于两者不同条件的蛋白表达，显示菌液上清表达要优于沉淀中表达。

综上：通过以点突变来增强外源蛋白拷贝水平的PXMJ19-C1786T-hexon(T7)质粒作为模板，构建重组质粒PXMJ19-T7-his-fiber2，进而在增强型菌株Shuffle T7-B细胞中进行原核表达，在菌液上清可见有较高的Fiber-2蛋白表达，可见：经优化后的Fiber-2蛋白表达有较好的可溶性，为后续疫苗的研制奠定实验基础。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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<212> DNA

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cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

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acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

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ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

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tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 600

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taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 2400

gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg 2460

tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat 2520

cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 2580

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gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct 2700

catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt 2760

tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg 2820

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ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa 3000

aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta 3060

gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg 3120

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atcccggtgc ctaatgagtg agctaactta cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 3660

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atgccctcat tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct 4080

tcccgttccg ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga 4140

cgcagacgcg ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc 4200

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tccacagcaa tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt 4380

tgcgcgagaa gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc 4440

gacaccacca cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc 4500

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atggtgtccg ggatctcgac gctctccctt atgcgactcc tgcattagga agcagcccag 4860

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<210> 7

<211> 7711

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

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ccaacagcct gagctatccg gataccattg tggtgccgcc gccggaagac tatgacgact 2460

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tgttagcggg cccattaagt tctgtctcgg cgcgtctgcg tctggctggc tggcataaat 3660

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accggcctta accacaccag cagaccagcg ggaaaacatg gaatcctcaa acgccttgag 5820

ttcatcgtca gacagtggac gatccaagaa caacagcatg ttgcggtgca agtgccaacc 5880

gttcgcccaa gagtctgtga cctcatagtc actataggtg tgctccaccc cgtaccgtgc 5940

acgttctttc ttccactgag atgttttcac catcgaagag tacgcagtct taatacccgc 6000

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<210> 8

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<212> DNA

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ttttttggac accatcgaat ggtgcaaaac ctttcgcggt atggcatgat agcgcccgga 180

agagagtcaa ttcagggtgg tgaatgtgaa accagtaacg ttatacgatg tcgcagagta 240

tgccggtgtc tcttatcaga ccgtttcccg cgtggtgaac caggccagcc acgtttctgc 300

gaaaacgcgg gaaaaagtgg aagcggcgat ggcggagctg aattacattc ccaaccgcgt 360

ggcacaacaa ctggcgggca aacagtcgtt gctgattggc gttgccacct ccagtctggc 420

cctgcacgcg ccgtcgcaaa ttgtcgcggc gattaaatct cgcgccgatc aactgggtgc 480

cagcgtggtg gtgtcgatgg tagaacgaag cggcgtcgaa gcctgtaaag cggcggtgca 540

caatcttctc gcgcaacgcg tcagtgggct gatcattaac tatccgctgg atgaccagga 600

tgccattgct gtggaagctg cctgcactaa tgttccggcg ttatttcttg atgtctctga 660

ccagacaccc atcaacagta ttattttctc ccatgaagac ggtacgcgac tgggcgtgga 720

gcatctggtc gcattgggtc accagcaaat cgcgctgtta gcgggcccat taagttctgt 780

ctcggcgcgt ctgcgtctgg ctggctggca taaatatctc actcgcaatc aaattcagcc 840

gatagcggaa cgggaaggcg actggagtgc catgtccggt tttcaacaaa ccatgcaaat 900

gctgaatgag ggcatcgttc ccactgcgat gctggttgcc aacgatcaga tggcgctggg 960

cgcaatgcgc gccattaccg agtccgggct gcgcgttggt gcggatatct cggtagtggg 1020

atacgacgat accgaagaca gctcatgtta tatcccgccg ttaaccacca tcaaacagga 1080

ttttcgcctg ctggggcaaa ccacgtggac cgcttgctgc aactctctca gggccaggcg 1140

gtgaagggca atcagctgtt gcccgtctca ctggtgaaaa gaaaaaccac cctggcgccg 1200

gggatcagcc ccggatgctt tggatacggt ctatgagctg gcagcgtatt tgaccgatcc 1260

ggacacctgg gataatgtgt ggattttgtc ggatcagctt gagtaggaca aatccgccga 1320

gcttcgacga gattttcagg agctaaggaa gctaaaatgg agaaaaaaat cactggatat 1380

accaccgttg atatatccca atggcatcgt aaagaacatt ttgaggcatt tcagtcagtt 1440

gctcaatgta cctataacca gaccgttcag ctggatatta cggccttttt aaagaccgta 1500

aagaaaaata agcacaagtt ttatccggcc tttattcaca ttcttgcccg cctgatgaat 1560

gctcatccgg agttccgtat ggcaatgaaa gacggtgagc tggtgatatg ggatagtgtt 1620

cacccttgtt acaccgtttt ccatgagcaa actgaaacgt tttcatcgct ctggagtgaa 1680

taccacgacg atttccggca gtttctacac atatattcgc aagatgtggc gtgttacggt 1740

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ccctgggtga gtttcaccag ttttgattta aacgtggcca atatggacaa cttcttcgcc 1860

cccgttttca ccatgggcaa atattatacg caaggcgaca aggtgctgat gccgctggcg 1920

attcaggttc atcatgccgt ctgtgatggc ttccatgtcg gcagaatgct taatgaatta 1980

caacagtact gcgatgagtg gcagggcggg gcgtaatttt tttaaggcag ttattggtgc 2040

ccttcgaaat gaccgaccaa gcgacgccca acctgccatc acgagatttc gattccaccg 2100

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atcatagttt gcccccgcga cattgaccat aaattcatcg cacaaaatat cgaacggggt 2220

ttatgccgct tttagtgggt gcgaagaata gtctgctcat tacccgcgaa caccgccgca 2280

ttcagatcac gcttagtagc gtccccatga gtaggcagaa ccgcgtccaa gtccacatca 2340

tccataacga tcatgcacgg ggtggaatcc acacccagac ttgccagcac ctcattagcg 2400

acacgttgcg cagcggccac gtccttagcc ttatccacgc aatcgagaac gtactgccta 2460

accgcgaaat cagactgaat cagtttccaa tcatcgggct tcaccaaagc aacagcaacg 2520

cgggttgatt cgacccgttc cggtgcttcc agaccggcga gcttgtacag ttcttcttcc 2580

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ggcgtgtacg accccttaga cgcggtttta gtagcggagc cagtcagttc ctgagacatg 2820

cccttagcga ggtaggttgc cattttcgca gcgtctccac cccaggtaga cacctgatca 2880

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cggttgtgtc gaacagtgcc cacaaacatc atgagcgcgc cacccgccgc caagtgattc 3240

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tgtttggtgg ccgcctagct tggctatgcg tgccagctta cccgtactca atgttaaaga 3780

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gccccggtgc tcactgtctg taccggcggg gcaagcccca caccccgcat ggacagggtg 3900

gctccgcccc ctgcaccccc agcaatctgc atgtacatgt tttacacatt agcacgacat 3960

gactgcatgt gcatgcactg catgcagact aggtaaatat gagtatgtac gactagtaac 4020

aggagcactg cacataatga atgagttgca ggacaatgtt tgctacgcat gcgcatgaca 4080

tatcgcagga aagctactag agtcttaaag catggcaacc aaggcacagc tagaacagca 4140

actacaagaa gctcaacagg cactacaggc gcagcaagcg caggcacaag ccaccatcga 4200

agcactagaa gcgcaggcaa aggctaagcc cgtcgtggtc accgcacgcg ttcctttggc 4260

actacgtgag gacatgaagc gcgcaggcat gcagaacggt gaaaacctcc aagagttcat 4320

gatcgccgcg tttaccgagc ggctagaaaa gctcaccacc accgacaacg aggaaaacaa 4380

tgtctaaccc actagttctc tttgcccacc gtgacccggt aaatgacgtg acgttcgagt 4440

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tgcaagccct agacgaagaa gccgccctac tgccctaatg ggtgtttcat gggtgtttcc 4560

ctagtgtttc atggtgtttt cacctaagct agggaattgc gcgagaagtc tcgcaaaaat 4620

cagcaacccc cggaaccaca cagttcacgg gggttcttct atgccagaaa tcagaaaggg 4680

gaaccagtga acgaccccga atggctggat gatcctccag cgcggggatc tcatgctgga 4740

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gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac 4980

tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca 5040

ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt 5100

ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc 5160

ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg 5220

aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcat tgagaaagcg ccacgcttcc 5280

cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac 5340

gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct 5400

ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc 5460

cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt 5520

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catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc 5700

cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag 5760

cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac 5820

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aggcccagtc tttcgactga gcctttcgtt ttatttgatg cctggcagtt ccctactctc 6180

gcatggggag accccacact accatcggcg ctacggcgtt tcacttctga gttcggcatg 6240

gggtcaggtg ggaccaccgc gctactgccg ccaggcaaat tctgttttat cagaccgctt 6300

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agctgaattc gagctcggta cccggggatc ctctagagtc gacctgcagg catgcaagct 6420

ttaatacgac tcactatagg ggaattgtga gcggataaca attcccctct agaaataatt 6480

ttgtttaact ttaagaagga gatataatgc tgcgtg 6516

<210> 10

<211> 2389

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

agcgagtcag tgagcgagga agcaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga 60

aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc 120

aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg 180

caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc 240

ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 300

gaatgtattt agaaaaataa acaaaagagt ttgtagaaac gcaaaaaggc catccgtcag 360

gatggccttc tgcttaattt gatgcctggc agtttatggc gggcgtcctg cccgccaccc 420

tccgggccgt tgcttcgcaa cgttcaaatc cgctcccggc ggatttgtcc tactcaggag 480

agcgttcacc gacaaacaac agataaaacg aaaggcccag tctttcgact gagcctttcg 540

ttttatttga tgcctggcag ttccctactc tcgcatgggg agaccccaca ctaccatcgg 600

cgctacggcg tttcacttct gagttcggca tggggtcagg tgggaccacc gcgctactgc 660

cgccaggcaa attctgtttt atcagaccgc ttctgcgttc tgatttaatc tgtatcaggc 720

tgaaaatctt ctctcatccg ccaaaacagc caagctgaat tcgagctcgg tacccgggga 780

tcctctagag tcgacctgca ggcatgcaag ctttaatacg actcactata ggggaattgt 840

gagcggataa caattcccct ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag gagatataat 900

gctgcgtgcg ccgaaacgcc gtcactctga aaacggtaaa ccggaaaccg aagcgggtcc 960

gtctccggcg ccgatcaaac gtgcgaaacg tatggtgcgc gcgtctcagc tggacctggt 1020

ttacccgttc gattacgtgg cggacccggt tggcggcctg aacccgccgt tcctgggtgg 1080

ctctggcccg ctggttgacc agggcggcca gctgaccctg aacgttaccg atccgatcat 1140

cattaaaaac cgttccgttg acctggctca cgatccgtct ctggatgtga acgcgcaggg 1200

ccagctggca gtggctgttg atccggaagg cgcgctggat atcaccccgg atggtctgga 1260

tgttaaagtg gatggcgtta ccgtgatggt taacgacgat tgggaactgg cggttaaagt 1320

tgacccgtcc ggtggcctgg attctaccgc gggcggtctg ggtgtgtctg ttgatgacac 1380

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cggtgttggt gttagcgttg atgaatctct gcagattgtt aacaacaccc tggaagttaa 1620

accagatccg tctggtccgc tgaccgttag cgcgaacggt ctcggcctga aatatgacac 1680

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cccgatcgcc accttcgtgt ccggtagccc gtctctgaac acctacaacg caaccaccgt 1800

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cccaggtaac attggtatcc gtgtgctgcc ggtgccggtg agcgcgagcg gtgaacgtta 2220

caccctgctg tgctacagcc tgcagtgcac caacgcgagc atcttcaacc cgaacaactc 2280

tggtaccatg atcgttggtc cggtgctgta ctcttgcccg gcggcgagcc tgccgaagct 2340

tgcggccgca ctcgagcacc accaccacca ccactgatga gatccggct 2389

<210> 11

<211> 2714

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

tatgagttag tagctcgcac gggggtttgt cttgtctagg gactattaat ttttagtggt 60

gtttggtggc cgcctagctt ggctatgcgt gccagcttac ccgtactcaa tgttaaagat 120

ttgcatcgac atgggagggt tacgtgtccg atacctaggg ggggtatccg cgactaggtg 180

ccccggtgct cactgtctgt accggcgggg caagccccac accccgcatg gacagggtgg 240

ctccgccccc tgcaccccca gcaatctgca tgtacatgtt ttacacatta gcacgacatg 300

actgcatgtg catgcactgc atgcagacta ggtaaatatg agtatgtacg actagtaaca 360

ggagcactgc acataatgaa tgagttgcag gacaatgttt gctacgcatg cgcatgacat 420

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ctacaagaag ctcaacaggc actacaggcg cagcaagcgc aggcacaagc caccatcgaa 540

gcactagaag cgcaggcaaa ggctaagccc gtcgtggtca ccgcacgcgt tcctttggca 600

ctacgtgagg acatgaagcg cgcaggcatg cagaacggtg aaaacctcca agagttcatg 660

atcgccgcgt ttaccgagcg gctagaaaag ctcaccacca ccgacaacga ggaaaacaat 720

gtctaaccca ctagttctct ttgcccaccg tgacccggta aatgacgtga cgttcgagtg 780

cattgagcac gccacctacg acacactttc acacgctaaa gaccagatca ccgcccaaat 840

gcaagcccta gacgaagaag ccgccctact gccctaatgg gtgtttcatg ggtgtttccc 900

tagtgtttca tggtgttttc acctaagcta gggaattgcg cgagaagtct cgcaaaaatc 960

agcaaccccc ggaaccacac agttcacggg ggttcttcta tgccagaaat cagaaagggg 1020

aaccagtgaa cgaccccgaa tggctggatg atcctccagc gcggggatct catgctggag 1080

ttcttcgccc accccaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa 1140

atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 1200

tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg 1260

ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 1320

ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac 1380

cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 1440

gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 1500

gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 1560

acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagcatt gagaaagcgc cacgcttccc 1620

gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 1680

agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 1740

tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc 1800

agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt 1860

cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc 1920

gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc aaaagtgctc 1980

atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc 2040

agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc 2100

gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca 2160

cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt 2220

tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aaagagtttg 2280

tagaaacgca aaaaggccat ccgtcaggat ggccttctgc ttaatttgat gcctggcagt 2340

ttatggcggg cgtcctgccc gccaccctcc gggccgttgc ttcgcaacgt tcaaatccgc 2400

tcccggcgga tttgtcctac tcaggagagc gttcaccgac aaacaacaga taaaacgaaa 2460

ggcccagtct ttcgactgag cctttcgttt tatttgatgc ctggcagttc cctactctcg 2520

catggggaga ccccacacta ccatcggcgc tacggcgttt cacttctgag ttcggcatgg 2580

ggtcaggtgg gaccaccgcg ctactgccgc caggcaaatt ctgttttatc agaccgcttc 2640

tgcgttctga tttaatctgt atcaggctga aaatcttctc tcatccgcca aaacagccaa 2700

gctgaattcg agct 2714

<210> 12

<211> 5258

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

cggtacccgg ggatcctcta gagtcgacct gcaggcatgc aagctttaat acgactcact 60

ataggggaat tgtgagcgga taacaattcc cctctagaaa taattttgtt taactttaag 120

aaggagatat aatgctgcgt gcgccgaaac gccgtcactc tgaaaacggt aaaccggaaa 180

ccgaagcggg tccgtctccg gcgccgatca aacgtgcgaa acgtatggtg cgcgcgtctc 240

agctggacct ggtttacccg ttcgattacg tggcggaccc ggttggcggc ctgaacccgc 300

cgttcctggg tggctctggc ccgctggttg accagggcgg ccagctgacc ctgaacgtta 360

ccgatccgat catcattaaa aaccgttccg ttgacctggc tcacgatccg tctctggatg 420

tgaacgcgca gggccagctg gcagtggctg ttgatccgga aggcgcgctg gatatcaccc 480

cggatggtct ggatgttaaa gtggatggcg ttaccgtgat ggttaacgac gattgggaac 540

tggcggttaa agttgacccg tccggtggcc tggattctac cgcgggcggt ctgggtgtgt 600

ctgttgatga caccctgctg gttgatcagg gtgaactggg tgttcacctg aaccagcagg 660

gcccgatcac ggcggattct agcggcatcg acctggaaat caacccgaac atgttcaccg 720

tgaacacctc caccggttcc ggtgtgctgg aactgaacct gaaagcccag ggcggtatcc 780

aggcggcttc tagcggtgtt ggtgttagcg ttgatgaatc tctgcagatt gttaacaaca 840

ccctggaagt taaaccagat ccgtctggtc cgctgaccgt tagcgcgaac ggtctcggcc 900

tgaaatatga caccaacacc ctggcggtga ccgcgggtgc actgaccgtg gttggcggtg 960

gtagcgtttc caccccgatc gccaccttcg tgtccggtag cccgtctctg aacacctaca 1020

acgcaaccac cgttaactct tccgctaacg cgttctcctg cgcgtactac ctgcagcagt 1080

ggaacatcca gggcctgctg gttacctctc tgtacctgaa actggactcc gcgaccatgg 1140

gtaaccgtcc gggtgacctg aactctgcca acgcgaaatg gttcaccttc tgggttagcg 1200

cctacctgca gcagtgcaac ccgtccggta tccaggcggg taccgttagc ccgagcaccg 1260

caaccctgac cgacttcgaa ccgatggcga accgtagcgt gaccagcccg tggacctact 1320

ctgcaaacgg ttactacgaa ccgtccatcg gcgaattcca ggttttctct ccggttgtta 1380

ccggcgcgtg gaacccaggt aacattggta tccgtgtgct gccggtgccg gtgagcgcga 1440

gcggtgaacg ttacaccctg ctgtgctaca gcctgcagtg caccaacgcg agcatcttca 1500

acccgaacaa ctctggtacc atgatcgttg gtccggtgct gtactcttgc ccggcggcga 1560

gcctgccgaa gcttgcggcc gcactcgagc accaccacca ccaccactga tgagatccgg 1620

ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag caataactag 1680

cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttggacacc atcgaatggt 1740

gcaaaacctt tcgcggtatg gcatgatagc gcccggaaga gagtcaattc agggtggtga 1800

atgtgaaacc agtaacgtta tacgatgtcg cagagtatgc cggtgtctct tatcagaccg 1860

tttcccgcgt ggtgaaccag gccagccacg tttctgcgaa aacgcgggaa aaagtggaag 1920

cggcgatggc ggagctgaat tacattccca accgcgtggc acaacaactg gcgggcaaac 1980

agtcgttgct gattggcgtt gccacctcca gtctggccct gcacgcgccg tcgcaaattg 2040

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gcactaatgt tccggcgtta tttcttgatg tctctgacca gacacccatc aacagtatta 2280

ttttctccca tgaagacggt acgcgactgg gcgtggagca tctggtcgca ttgggtcacc 2340

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