一种发酵河鲀鱼肠的制备工艺

摘要

本发明公开了一种发酵河鲀鱼肠的制备工艺，属于河鲀鱼肠发酵技术领域，一种发酵河鲀鱼肠的制备工艺，包括：(1)分别将冻干菌种活化，分别进行扩大培养，浓度均调整为107CFU/mL，按照1:1:1混合后得发酵菌悬液，放入0℃‑4℃冰箱待用，(2)对河鲀进行前处理、采肉、清洗，并在0℃‑4℃条件下沥干水分，(3)低温斩拌河鲀鱼肉，斩拌过程中添加发酵菌悬液和辅料混合均匀，(4)将斩拌好的河鲀鱼肉进行分装灌肠，(5)将灌制好的河鲀鱼肠放入生化培养箱中恒温发酵，(6)发酵结束后进行加热熟制，然后用冰水迅速冷却。本发明的发酵河鲀鱼肠的制备工艺，制得的发酵河鲀鱼肠品质佳。

说明书

技术领域

本发明属于河鲀鱼肠发酵技术领域，尤其涉及一种发酵河鲀鱼肠的制备工艺。

背景技术

发酵食品是指利用有益的微生物，对食品进行加工，从而改变其原有营养成分并产生独特风味物质的一种食品。河鲀鱼肉质肥美，且富含鱼油和八种必需氨基酸等高营养价值物质。目前，河鲀已成为广受消费者喜爱的水产食品，但是河鲀在4℃条件下冷藏，仅有4天左右的货架期，因此延长河鲀的货架期成了亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提出一种发酵河鲀鱼肠的制备工艺，通过添加有益微生物，不仅能增添营养成分并赋予独特风味，而且能抑制部分腐败微生物的繁殖延长货架期，通过对发酵工艺的优化，制得的发酵河鲀鱼肠品质佳。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供的一种发酵河鲀鱼肠的制备工艺，包括：(1)分别将戊糖片球菌冻干菌种、植物乳杆菌冻干菌种、木糖葡萄球菌冻干菌种活化，然后分别进行扩大培养，菌落计数后将戊糖片球菌菌悬液、植物乳杆菌菌悬液、木糖葡萄球菌菌悬液的浓度均调整为10

优选地，戊糖片球菌冻干菌种、植物乳杆菌冻干菌种、木糖葡萄球菌冻干菌种的活化和扩大培养的具体步骤均为：将菌种保藏管在超净工作台内打开，用无菌1mL枪尖吸取肉汤培养基溶解冻干菌粉，用接种环挑取菌悬液在琼脂培养基上四区划线，放入生化培养箱培养12h，培养温度为37℃，培养结束后用接种针挑取5个单菌落，分别接种到液体培养基中放入振荡摇床扩大培养12h，培养温度为37℃，收获菌悬液后使用无菌生理盐水离心洗涤2次，洗涤时间为5min，离心速度为4000rpm，将菌体重悬后，10倍梯度稀释6个梯度，然后分别取10

优选地，发酵菌悬液的接种量为河鲀鱼糜质量的2-4％。

优选地，辅料包括马铃薯淀粉、葡萄糖、以及食用盐，马铃薯淀粉的添加量为河鲀鱼肉质量的6-12％，葡萄糖的添加量为河鲀鱼肉质量的2-4％，食用盐的添加量为河鲀鱼肉质量的0.5-2.5％。

优选地，葡萄糖的添加量为河鲀鱼肉质量的3％，食用盐的添加量为河鲀鱼肉质量的2％、马铃薯淀粉的添加量为河鲀鱼肉质量的10％，发酵菌悬液的接种量为河鲀鱼糜质量的3.5％，河鲀鱼肠的发酵时间为10h，河鲀鱼肠的发酵温度为35℃。

优选地，二段加热具体为：先以40℃-50℃加热1h，再以90℃-97℃加热30min。

优选地，斩拌过程中，先将河鲀鱼肉空擂1min，然后加入发酵菌悬液和辅料，再继续斩拌2min，使其混合均匀。

优选地，采用斩拌机进行斩拌，并且斩拌机外层加入冰水混合物，冰水混合物温度为0℃-4℃。

优选地，河鲀前处理和河鲀鱼肠罐制过程中河鲀鱼肉均置于冰上，以维持温度为0℃-4℃。

优选地，河鲀鱼糜的原料选用新鲜暗纹东方鲀、新鲜菊黄东方鲀、新鲜红鳍东方鲀中的一种。

本发明的有益效果为：

通过添加有益微生物，不仅能增添营养成分并赋予独特风味，而且能抑制部分腐败微生物的繁殖延长货架期，通过对发酵工艺的优化，制得的发酵河鲀鱼肠品质佳。

具体实施方式

现结合具体实施方式对本发明进一步说明。

本实施例中提供的一种发酵河鲀鱼肠的制备工艺，包括：

(1)分别将戊糖片球菌冻干菌种、植物乳杆菌冻干菌种、木糖葡萄球菌冻干菌种活化，然后分别进行扩大培养，菌落计数后将戊糖片球菌菌悬液、植物乳杆菌菌悬液、木糖葡萄球菌菌悬液的浓度均调整为10

戊糖片球菌冻干菌种、植物乳杆菌冻干菌种、木糖葡萄球菌冻干菌种的活化和扩大培养的具体步骤均为：按照打管说明将菌种保藏管在超净工作台内打开，用无菌1mL枪尖吸取肉汤培养基溶解冻干菌粉，用接种环挑取菌悬液在琼脂培养基上四区划线，放入生化培养箱培养12h，培养温度为37℃，培养结束后用接种针挑取5个单菌落，分别接种到液体培养基中放入振荡摇床扩大培养12h，培养温度为37℃，收获菌悬液后使用无菌生理盐水离心洗涤2次，洗涤时间为5min，离心速度为4000rpm，将菌体重悬后，10倍梯度稀释6个梯度，然后分别取10

(2)对河鲀进行前处理、采肉、清洗，并在4℃条件下沥干水分，原料选用新鲜暗纹东方鲀。

(3)采用小型高速斩拌机(SZ-18)对河鲀鱼肉进行斩拌，并且斩拌机外层加入冰水混合物，冰水混合物温度为0℃-4℃，具体的，先将河鲀鱼肉空擂1min，然后添加发酵菌悬液和辅料，再继续斩拌2min，使其混合均匀。其中，发酵菌悬液的接种量为河鲀鱼糜质量的3.5％；辅料包括马铃薯淀粉、葡萄糖、以及食用盐，马铃薯淀粉的添加量为河鲀鱼肉质量的10％，葡萄糖的添加量为河鲀鱼肉质量的3％，食用盐的添加量为河鲀鱼肉质量的2％。

(4)将斩拌好的河鲀鱼肉进行分装灌肠，(5)将灌制好的河鲀鱼肠放入生化培养箱中恒温发酵，发酵时间为8-16h，发酵温度为25℃-45℃，(6)发酵结束后先以45℃加热1h，再以95℃加热30min对发酵河鲀鱼肠进行加热熟制，然后用冰水迅速冷却。需要进行实验时，冰水迅速冷却后需放入4℃平衡12h备用。

进一步的，河鲀前处理和河鲀鱼肠罐制过程中河鲀鱼肉均置于冰上，以维持温度为0℃-4℃。

通过电子鼻分析仪、电子舌味觉分析系统以及质构分析仪对发酵河鲀鱼肠的感官评价进行客观分析，再辅以模糊数学评价法和正交试验设计法分别对发酵河鲀鱼肠的辅料添加量与发酵条件进行优化，通过模糊数学评价法得到了发酵河鲀鱼肠的最优辅料配方为：葡萄糖添加量为河鲀鱼糜质量的3％、食用盐添加量为河鲀鱼糜质量的2％、马铃薯淀粉添加量为河鲀鱼糜质量的10％，通过正交试验设计法对发酵条件进行优化，根据正交试验直观分析结果得出最佳发酵条件：接种量为河鲀鱼糜质量的3.5％、发酵时间10h、发酵温度35℃。

具体的，葡萄糖添加量组加入不同质量比(0％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％)的葡萄糖；食用盐添加量组加入不同质量比(0％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％)的食用盐；马铃薯淀粉添加量组加入不同质量比(0％、6％、8％、10％、12％)的马铃薯淀粉，其余辅料添加量不变。采用单因素轮换实验依次优化发酵剂接种量(0％、1％、2％、3％、4％、5％)；发酵时间(0h、8h、12h、16h、20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h、48h)；发酵温度(0℃、25℃、35℃、45℃、55℃)。发酵河鲀鱼肠与对照组经二段加热4℃平衡后按照GB 5009.237-2016测定pH。使用电子天平分别在顶空瓶中称取5g切碎的样品，每组样品设置3个平行。在室温下静止1h以上使气味充分挥发后进行实验。使用电子天平分别在玻璃罐中称取25g切碎的样品，加入100mL水放入沸水中煮20min，使其味道充分溶解在水里。将煮沸后的液体倒入100mL离心管中离心(8000rpm，10min)取上清液进行实验。将4℃平衡后的鱼肠剥去肠衣，切成24mm鱼肠段，切面应光滑整齐。将上述切好的鱼肠置于质构仪载物台上，使用P/5探头对准鱼肠中心进行全质构实验；采用直径为5mm的圆柱形P/5探头，参数设置：压缩程度30％，触发力5g，测试停留间隔时间5s，测试前速度3mm/s，测试速度1mm/s，测试后速度3mm/s。请10位经过专业培训具有食品感官评价经验的专业人员对发酵后的14个样品进行感官评价。利用模糊综合评价法得出葡萄糖、食用盐、马铃薯淀粉的最佳添加量。感官评价细则见表1：

表1

根据感官评价细则设定感官评定论域U＝{口感(u

pH测定结果为：实验组发酵后pH值均降低到5.5以下，pH值变化与辅料的添加量并没有直接关系。发酵剂接种量与pH值变化有一定联系，当发酵剂接种量越高，乳酸菌数量越多产酸也越多，所有pH值越低。pH值随着发酵时间的增加在逐渐下降，同时发酵36h的鱼肠已经彻底腐败，伴随发酵时间的延长，乳酸菌累积产生的乳酸越多，同时也会有次级代谢产物的生成，使得鱼肠酸败变质。随着发酵温度的上升，pH值也逐渐降低，当温度升高，菌体开始大量繁殖，同时产生大量乳酸，但是当发酵温度达到55℃，菌体生长收到抑制，所以pH值没有降低。

电子鼻检测结果：辅料添加量组的电子鼻分析结果表明，实验组和对照组在挥发性气味上有明显的区别，但是实验组间没有明显区别。发酵剂接种量组和发酵时间组的电子鼻响应值分析结果表明，实验组和对照组在挥发性气味上有显著的差异，但是实验组之间并没有明显区别。发酵温度组的电子鼻响应值分析结果显示，实验组和对照组在挥发性气味上有明显的区别，同时发酵温度35℃与其它实验组有较大的区别。分析原因，35℃为菌体生长适宜温度，细菌快速生长繁殖，产生各类代谢物，挥发性物质的量比其它实验组更丰富，当温度超过45℃后菌体生长受到抑制，发酵延迟，代谢产生的挥发性物质较少，与对照组相当。

电子舌检测结果：辅料添加量实验组与对照组之间味觉信号差异并不明显，结果表明，葡萄糖与马铃薯淀粉的含量增加对滋味成分的改变不大，随着食用盐添加量的增加，其咸味响应值也增强。酸味响应值与发酵剂接种量和发酵时间呈正相关，分析原因，当微生物数量增加发酵时间延长，产生积累的酸也越多，可能引起pH值降低，酸味信号增强。随着发酵温度的上升，菌体的活力也增加，菌体代谢产酸增多，所以酸味的响应值逐渐增强，但是当温度达到55℃时，菌体生长受到抑制，所以发酵温度55℃的各种味道响应值和对照组没有明显差别。

葡萄糖添加量全质构分析(TPA)：葡萄糖添加量组的各项质构特性参数差异并不明显，只有恢复性和咀嚼性随着葡萄糖添加量的增加而逐渐增强。弹性对比对照组都有增加25.31％～33.92％。恢复性也有增加16.83％～29.22％。同样的咀嚼性也有增加32.21％～52.82％。内聚性也增加了18.73％～25.74％。黏着性均有降低11.24％～29.33％，所有组的硬度参数没有太大变化。

食用盐添加量TPA分析：食用盐添加量组的各项质构参数差异并不明显，只有恢复性、咀嚼性和硬度随着食用盐添加量的增加而出现规律性变化。分析原因，盐可以促进盐溶性蛋白胶联，促进凝胶体形成，所以随着食用盐含量的增加，发酵鱼肠的硬度逐渐增加。食盐添加量0.5％的弹性对比对照组增加了16.92％。与对照组相比，恢复性随着食用盐添加量增加而增加12.91％～20.43％。食用盐含量0.5％～1.5％的咀嚼性分别降低18.51％、36.43％、14.33％，食用盐含量2％和2.5％分别增加了15.51％和11.54％。食用盐含量1.5％的内聚性比对照组增强14.83％。食用盐含量0.5％的黏着性最低，比对照组低77.32％，其余组没有明显变化。食用盐含量0.5％～1.5％的硬度对比对照组分别降低26.21％、21.23％、5.95％，其余组没有明显差异。

马铃薯淀粉添加量TPA分析：马铃薯淀粉添加量组的各项质构参数并没有明显规律，只有黏着性随着淀粉添加量增高而增强。淀粉添加量12％的弹性对比对照组降低35.33％，其余组差异不大。淀粉添加量8％和12％的恢复性对比对照组有下降，分别降低16.72％、40.84％，添加量10％恢复性增加13.72％。淀粉添加量10％的咀嚼性对比对照组有明显增强，增加44.94％，但是，淀粉添加量12％的咀嚼性降低25.42％。淀粉添加量12％内聚性较低，与对照组相比降低37.23％，其余组没有明显变化。淀粉添加量6％的黏着性对比对照组有所降低，减小71.31％，添加量12％的黏着性有增强，对比对照组增加79.82％。添加量10％和12％的硬度对比对照组有增强，分别增加44.63％和42.15％，其余组没有明显变化。

发酵剂接种量TPA分析：发酵剂接种量组的各项质构参数随着接种量的增加呈现先升高后降低的趋势，分析原因，当菌体浓度增大后蛋白质等物质的降解更加彻底，所以鱼肠结构更为松散不致密，质构参数呈现下降趋势。发酵后鱼肠的弹性与对照组相比，增大约10.12％～26.24％，其中接种量4％的弹性最高，增加26.24％。恢复性也有增强，与对照组相比增强约10.23％～24.92％，其中接种量3％的恢复性最高，增加了24.92％。发酵后鱼肠咀嚼性差异较大，与对照组相比增加约75.17％～83.26％，其中接种量3％的咀嚼性最强，增大83.26％。内聚性的差异较小，但是实验组依然高于对照组，增大约10.31％～19.91％，其中接种量4％最高，比对照组高19.91％。随着接种量增加，黏着性有所降低，与对照组相比降低约20.11％～54.94％，其中接种量4％的黏着性最低，为－104.363g

发酵时间TPA分析：随着发酵时间的延长，质构参数均逐渐下降，但是当发酵时间在36h之后，各项参数又有所上升，并且此时的鱼肠已经腐败变质。除了发酵时间8h弹性上升14.22％，其余实验组的弹性全部下降，与对照组相比降低23.91％～31.26％。发酵时间8h的恢复性上升4.13％，其余实验组的恢复性下降约30.25％～56.16％。同样的，发酵时间8h的咀嚼性比对照组高57.14％，剩下的实验组降低20.52％～71.54％。发酵时间8h的内聚性比对照组高10.43％，剩余实验组均降低约10.12％～36.93％。实验组的8h与36h的黏着性对比对照组分别降低了15.57％、46.25％，其余实验组黏着性增加约14.52％～29.67％。与对照组相比发酵时间8h、12h、16h的硬度有增加，分别增大25.51％、29.64％、16.17％，其余实验组均降低。

发酵温度TPA分析：随着发酵温度的升高，各项质构参数均逐渐下降，但是当温度上升至55℃时，其各项质构指标均与对照组相当，分析原因，55℃不再适宜菌体生长，菌体活力受到抑制，鱼肉没有被发酵，所有发酵温度55℃与对照组没有明显差别。发酵温度25℃～45℃有明显的变化，发酵温度25℃、35℃、45℃的弹性对比对照组有所下降，分别下降15.72％、39.12％、43.23％，恢复性也有降低，分别降低7.64％、35.62％、36.33％。发酵温度35℃、45℃咀嚼性有降低，分别减小51.84％、52.86％，但发酵温度25℃咀嚼性有增强，对比对照组提高了31.71％。发酵温度25℃、35℃、45℃的内聚性有降低，分别降低11.92％、30.15％、32.36％。黏着性没有较大的差异变化。只有发酵温度25℃的硬度有增强，对比对照组增强了46.35％，其余组没有明显变化。

汇总整理辅料添加量感官评价实验结果得到模糊关系综合评判集，如表2所示：

表2

以样品1的口感感官评分为例，选择优的2人，选择良的1人，选择中的2人，选择一般5人，选择差的0人，将上述评价人数除以总参与人数10人，得到模糊矩阵R，即：

模糊矩阵结果与权重因素集通过模糊变换得到模糊综合评价值，以第一组为例：

其中Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

将感官评价等级设置为优100分，较好80分，中等60分，一般40分，差20分，即评价等级集K＝(100，80，60，40，20)，将矩阵结果和评价集经过计算得出感官评分，结果如表3所示：

表3

根据感官评价结果得出辅料最佳添加量：葡萄糖添加量3％，食用盐添加量2％，马铃薯淀粉添加量10％。

发酵条件单因素实验感官评价结果：对发酵条件单因素实验样品进行感官评价，同时，发酵36h后鱼肠变质，因此发酵时间感官评价实验在36h结束。选择每组平均分最高的发酵参数：发酵菌悬液接种量3％、发酵时间12h、发酵温度35℃，做为正交试验的基础。结果如表4(发酵河鲀鱼肠发酵剂接种量感官评价结果)，表5(发酵河鲀鱼肠发酵时间感官评价结果)，表6(发酵河鲀鱼肠发酵温度感官评价结果)所示：

表4

表5

表6

发酵条件正交试验优化：考察接种量(A)、发酵时间(B)、发酵温度(C)这3个因素对感官评价结果的影响，以感官评分为考察指标，确定发酵工艺条件。正交试验结果如表7所示：

表7

根据正交试验直观分析结果可以得知，对感官评价结果的影响主次顺序为：发酵时间＞接种量＞发酵温度。最佳发酵工艺条件为A3B1C2，即接种量3.5％、发酵时间10h、发酵温度35℃。

按照最佳发酵条件制作发酵河鲀鱼肠，实验组感官评分为79.70分，对照实验组感官评分为72.50分。说明发酵后的鱼肠风味口感有所改善。

利用PCA分析(主成分分析)对电子鼻响应值进行降维分析，发酵结束后实验组与对照组的挥发性气味在第一主成分上有显著差异，实验组之间没有明显差别。但是，当发酵温度为55℃时，与其它实验组有明显不同，可能是该温度不适宜细菌繁殖，菌体生长受到抑制，产生的各类代谢物较少。

对电子舌五大味觉(酸苦涩鲜咸)的响应值进行分析，结果发现，酸味响应值与发酵剂添加量、发酵时间、发酵温度的增加呈正相关，随着食用盐添加量的增加其咸味响应值也增强，但是葡萄糖添加量和马铃薯淀粉添加量的变化对味觉没有明显影响。

分析对比TPA六大参数(弹性、恢复性、咀嚼性、内聚性、黏着性、硬度)，结果发现，随着葡萄糖添加量的增加其恢复性和咀嚼性逐渐增强；伴随食用盐添加量的增加其恢复性和硬度逐渐增强，但咀嚼性先降低后升高；随着马铃薯淀粉添加量的增加其黏着性也增高；随着发酵剂添加量的增加各项参数均有先升高后下降的趋势；伴随发酵时间的延长，各项质构参数均呈现逐渐下降的趋势；随着发酵温度的升高，各项质构参数均逐渐下降，但是55℃时菌体生长受到抑制，其各项质构参数与对照组相当。

使用模糊数学感官评价法优化发酵鱼肠辅料的添加量，得到辅料最佳添加量：葡萄糖添加量3％、食用盐添加量2％、马铃薯淀粉添加量10％。根据单因素实验得到的最佳发酵条件：接种量3％、发酵时间12h、发酵温度35℃，同时，在此基础上，利用正交试验设计法得出最优鱼肠发酵条件：接种量3.5％、发酵时间10h、发酵温度35℃。

进一步的，在葡萄糖添加量为河鲀鱼糜质量的3％、食用盐添加量为河鲀鱼糜质量的2％、马铃薯淀粉添加量为河鲀鱼糜质量的10％，接种量为河鲀鱼糜质量的3.5％、发酵温度35℃的基础上，设计6个添加有发酵菌种的实验组，分别为：pedi(戊糖片球菌冻干菌种)、lact(植物乳杆菌冻干菌种)、stap(木糖葡萄球菌冻干菌种)、pedi+stap(戊糖片球菌冻干菌种+木糖葡萄球菌冻干菌种、lact+stap(植物乳杆菌冻干菌种+木糖葡萄球菌冻干菌种)、pedi+lact+stap(戊糖片球菌冻干菌种+植物乳杆菌冻干菌种+木糖葡萄球菌冻干菌种)，同时制作不添加任何发酵菌种的CK组(对照组)和fresh组(新鲜鱼肉空白组)，设定每个样本发酵0h和发酵10h后进行理化分析，分析发酵前后河鲀鱼肠的理化特性的变化，从理化分析结果得出：戊糖片球菌冻干菌种+植物乳杆菌冻干菌种+木糖葡萄球菌冻干菌种实验组发酵10h后的各项理化指标均优于不添加任何发酵菌种的对照组、新鲜鱼肉空白组、以及其它实验组。

具体的，发酵河鲀鱼肠pH值的测定：发酵河鲀鱼肠与CK组经二段加热4℃平衡后按照GB 5009.237-2016的方法测定其pH。

发酵河鲀鱼肠中性蛋白酶活力的测定：发酵后河鲀鱼肠用料理机搅碎，均匀的平铺于玻璃平皿内，厚度不超过5mm，表面覆盖一层扎过孔的锡箔纸，放入真空冷冻干燥机，72h后取出样品，搅碎待用。在100mL离心管中分别称取5g样品，加入45mL磷酸缓冲液用涡旋振荡仪混合均匀，冰水浴超声处理10min，再离心(4℃，4000rpm，5min)取上清备用。配制L-酪氨酸标准溶液，绘制L-酪氨酸标准曲线计算回归方程公式。在15mL离心管内加入1mL上清溶液，放入30℃恒温水浴中预热2min。加入1mL酪蛋白溶液涡旋混匀，放入30℃恒温水浴反应10min，加入2mL三氯乙酸终止反应，静置10min后，吸取1mL上清溶液到另一个15mL离心管中，加入5mL碳酸钠溶液再加入1mL福林试剂，涡旋混匀，放入30℃恒温水浴显色20min。fresh组其酪蛋白溶液和三氯乙酸的添加顺序相反，其余步骤相同。计算公式：

发酵河鲀鱼肠总酸度的测定：用烧杯称取5g搅碎后的样品，用80℃左右的up水分数次洗入100mL烧杯中，待冷却至室温后转移到100mL容量瓶内，加入新煮沸的up水定容至100mL混匀。静置3min后吸取10mL上清液体到200mL烧杯中，并加入60mL新煮沸的up水，置于磁力搅拌器上，插入pH计探头，用标定过的NaOH标准溶液(0.0565mol/L)滴定至pH值为8.2，记录消耗的NaOH的体积。计算公式：

发酵河鲀鱼肠氨基酸态氮含量的测定：在总酸度测定的基础上，继续实验，加入10mL甲醛溶液，用NaOH标准溶液继续滴定至pH值为9.2，记录消耗的NaOH的体积。空白实验，取新煮沸的up水80mL，用NaOH标准溶液滴定至pH值为8.2，再加入10mL甲醛溶液，继续滴定至pH值为9.2，记录消耗的NaOH的体积。计算公式：

发酵河鲀鱼肠抑制羟自由基能力的测定：在100mL离心管中分别称取5g冷冻干燥后的样品，加入45mL磷酸缓冲液用涡旋振荡仪混合均匀，再离心(4℃，4000rpm，5min)取上清备用。按照试剂盒说明书实验步骤进行试验，使用分光光度计于550nm波长得到各组吸光度值，独立重复三次。计算公式：

发酵河鲀鱼肠抗超氧阴离子自由基能力的测定：按照抑制羟自由基能力的测定的制备方法得到样品，根据试剂盒说明书实验步骤进行试验，使用分光光度计于550nm波长得到各组吸光度值，独立重复三次。计算公式：

发酵河鲀鱼肠游离脂肪酸含量的测定：按照抑制羟自由基能力的测定的制备方法得到样品，根据试剂盒说明书实验步骤进行试验，使用分光光度计于550nm波长得到各组吸光度值，独立重复三次。计算公式：

发酵河鲀鱼肠游离氨基酸含量的测定：按照中性蛋白酶活力测定的样品制备的方法冻干样品后，称取0.5g于10mL离心管中，加入0.01M盐酸5mL涡旋混匀，沸水浴30min后再离心(10000rpm，10min)取上清备用。沉淀加入0.01M盐酸2mL，冰水浴超声5min后离心(10000rpm，10min)取上清合并待用。加入30％乙酸锌水溶液1mL定容至10mL混匀后离心(10000rpm，10min)上清过0.22μm滤头后待用。在线柱前衍生：采用安捷伦公司自动在线衍生化方法，一级氨基酸与邻苯二甲醛(OPA)、二级氨基酸与芴甲氧羰酰氯(FMOC)衍生后过柱检测；色谱条件：ZORBAX Eclipse AAA(4.6x75mm，3.5μm)；检测信号：紫外338nm，荧光(EX＝266nm，EM＝305nm)；流动相A：40mM磷酸二氢钠(pH7.8)；流动相B：乙腈/甲醇/水＝45/45/10；流速：1.0mL/min。发酵河鲀鱼肠挥发性风味成分分析：称取5g鱼肠于20mL萃取瓶中，加入100μg丁位辛内酯作为内标物密封，置于90℃水浴中20min后，插入萃取针萃取30min。萃取针使用前，在气质进样口250℃活化20min。气相条件：进样口温度250℃，气质接口温度250℃，载气流速1.5mL/min。质谱条件：离子源的温度230℃，四级杆温度150℃，EI电离70eV，全扫描35～550da。升温程序：保持50℃1min，以5℃/min升温到100℃维持2min；再以4℃/min升温到180℃维持3min；以5℃/min升温到250℃维持5min。

结果分析：发酵河鲀鱼肠的pH值：添加发酵剂的鱼肠经过10h恒温发酵后，pH值均降低至5.5以下，且明显比CK更低。由于乳酸菌产乳酸，使得发酵后鱼肠的pH值降低。发酵河鲀鱼肠的中性蛋白酶活力：L-酪氨酸标准曲线为y＝0.0105x－0.0005，y为吸光值，x为L-酪氨酸浓度，当吸光值设为1时，计算吸光常数K，其范围在95～100内，符合要求。

发酵后的河鲀鱼肠其蛋白酶活力明显高于发酵前，同时添加发酵剂的实验组其蛋白酶活力明显高于CK组。发酵后pedi+lact+stap组蛋白酶活力为506.82U/g，对比CK增强了54.62％，比所有发酵后鱼肠的酶活力值都高，说明复合发酵剂组的酶活力比单一菌种发酵更强。

发酵HT鱼肠的总酸度:发酵后河鲀鱼肠的总酸度明显高于发酵前。添加发酵剂的实验组比CK和fresh的总酸度高，其中发酵后pedi+lact+stap组的总酸度为6.02mL/10g，与CK相比增加了43.74％，明显高于其它实验组，说明复合发酵剂的产酸能力更强。

发酵河鲀鱼肠的氨基酸态氮(AAN)含量：氨基酸态氮含量越高，其氨基酸含量也越高、鲜味更浓，AAN含量是判定发酵产品其发酵程度的特性指标。发酵后的鱼肠其AAN含量明显高于发酵之前。同时实验组发酵后的AAN含量明显高于对照组发酵后，其中pedi+lact+stap组的AAN含量为0.72％，略高于其它实验组，比CK含量高出了19.45％。说明pedi+lact+stap组的鲜味物质更丰富，蛋白质降解更完全，发酵效率更高。

发酵河鲀鱼肠的抑制羟自由基能力：实验组发酵后抑制羟自由基的能力明显增强，但是CK组发酵后与发酵前比较没有明显变化，说明加入发酵剂有助于提高鱼肠抑制羟自由基的能力，同时发酵后pedi+lact+stap组的抗羟自由基能力在实验组中最高，为47.52U/mg，比CK高43.73％。

发酵河鲀鱼肠的抗超氧阴离子自由基能力：实验组鱼肠发酵后其抗超氧阴离子的活力明显增强，同时CK组发酵前后的抗超氧阴离子能力没有明显变化，说明添加发酵剂的鱼肠其抗超氧阴离子的活力得到明显的提高，同时pedi+lact+stap组发酵后的抗超氧阴离子的活力为477.16U/g，明显高于其它实验组，比CK高75.57％，说明添加复合发酵剂对于鱼肠抗超氧阴离子活力有正向作用。

发酵河鲀鱼肠的肌收缩蛋白降解情况：孵育MYOT抗体后，可以明显观察到发酵后MYOT有降解，说明随着发酵时间增加，鱼肉内的蛋白会被各类蛋白酶降解为小分子肽或氨基酸，同时，CK组和fresh组由于腐败微生物以及自身微生物的作用，其鱼肉蛋白也有所降解。

发酵河鲀鱼肠的游离脂肪酸含量：游离脂肪酸作为风味前体物质，对食品的风味形成有着重要的作用实验组与对照组在发酵后的FFA含量均有所增加，其中pedi+lact+stap组发酵后的FFA含量为147.54μmol/g，明显高于其它组，对比CK增加了54.43％，说明添加复合发酵剂对脂类的降解更完全。

发酵河鲀鱼肠的游离氨基酸含量：当鱼肠发酵结束后产生了24种FAA，包含了所有用于合成蛋白质的20种氨基酸，和人体必需的8种氨基酸，另外瓜氨酸、肌氨酸、正缬氨酸和羟脯氨酸为非蛋白质合成氨基酸。发酵后的所有样品中丙氨酸的平均含量最高，赖氨酸其次，而肌氨酸的平均含量最低。由于新鲜鱼肉未添加发酵剂，所以更容易腐败变质，导致蛋白质降解更为彻底，其总氨基酸含量与各类必需氨基酸含量最高，分别为1791.22mg/100g和483.28mg/100g。但是，pedi+lact+stap组的鲜味氨基酸含量最高，为73.61mg/100g，相比CK增加17.82％，同时其总氨基酸含量与必需氨基酸含量为实验组内最高值，分别为1543.51mg/100g和424.04mg/100g。结果说明，pedi+lact+stap组的蛋白质降解程度比其余实验组更强，同时有益微生物参与发酵，使得鲜味氨基酸含量更多，其呈味物质与其它组相较更为丰富。

发酵河鲀鱼肠的挥发性风味物质：发酵结束后，pedi+lact+stap组共检测出51种挥发性风味物质，比CK多40种化合物。主要挥发性化合物为丁酸乙酯(1.644％)，2-乙基己醇(1.703％)，双戊烯(2.928％)，壬醛(5.567％)，己酸-2,2-二甲丙基酯(8.318％)，主要香型为果香气味。将挥发性成分按照种类进行分类。可以得知，pedi+lact+stap组挥发性物质的主要成分为酯、烷、醇、醛等，有研究表明，酯类醇类物质是形成风味成分的关键化合物。

结论：使用pedi+lact+stap来发酵河鲀鱼肉，可以显著降低鱼肠的pH，其总酸度为6.02mL/10g，对比CK增加了43.74％。并且，发酵后其AAN含量为0.72％，对比CK增加了19.45％，中性蛋白酶活力与清除羟自由基和超氧阴离子能力也有增强，分别为506.82U/g、47.52U/mg、477.16U/g，与CK相比分别增强了54.62％、43.73％、75.57％。FFA与FAA含量也明显增多，含量分别为147.54μmol/g和1543.51mg/100g，FFA含量与CK相比增加了54.43％，但FAA含量比CK低4.68％，其中鲜味FAA含量为73.61mg/100g是所有组内最高值，比CK高17.82％。同时GC-MS分析检测到51种挥发性风味物质，主要为酯、烷、醇、醛等，相对含量分别为68.334％、6.717％、3.737％、9.530％，添加复合发酵菌丰富了发酵鱼肠的风味物质组分，主要香型为果香气味。结果表明，使用复合发酵剂会显著提升发酵鱼肠的产品品质，得到营养丰富、活性成分多的优质发酵产品。

进一步的，基于LC-MS/MS技术，利用非靶向代谢组学研究发酵0h的对照组和发酵10h的实验组的代谢物组分的差异变化，结果表明：对于发酵后的河鲀鱼肠，其脂类与蛋白类物质经过微生物作用，降解成了更小的化合物分子，以各类氨基酸与有机酸以及酯类化合物为主，这几类代谢物主导着特殊的发酵呈味物质的形成与挥发性风味物质的合成，代表着微生物发酵过程中分解消耗了蛋白质、脂肪等大分子营养物质，当代谢物进一步反应，会影响发酵河鲀鱼肉的品质形成。

具体的，用液氮将样品研磨至粉状，取100mg样品置于EP管中，加入含有0.1％甲酸的80％甲醇水溶液500μL，振荡混匀后置于冰上静止5min，再离心(4℃，15000rpm，10min)取上清至新的离心管中，加入质谱级用水，将甲醇含量稀释至53％，再次离心(4℃，15000g，10min)收集上清备用。从每个实验样本中吸取等体积试样混合作质量控制样本，用含0.1％甲酸的53％甲醇水溶液作空白样本。色谱柱柱温40℃，流速0.2mL/min，正离子模式下，流动相A为0.1％甲酸，流动相B为甲醇，负离子模式下，流动相A为5mM醋酸铵(pH 9.0)，流动相B为甲醇。用梯度洗脱的方法进行分离检测。扫描范围：m/z 70～1050，ESI源设置：喷雾电压3.2kV，鞘气流速35arb，辅助气流速10arb，毛细管温度320℃。使用Compound Discoverer3.1对检测得到的原始数据进行解谱处理和数据库搜索。根据保留时间、质荷比等参数来简单筛选与峰对齐，同时对峰面积进行定量，通过分子离子峰和碎片离子进行分子式预测，与数据库比对，最后得到代谢物的定性和定量结果。将质谱谱图进行解谱处理，匹配分子特征峰和数据库搜库比对，得到代谢物定性定量结果，鉴定得到共909种化合物。同时对EG(实验组)和CK的代谢物进行PCA分析，可以观察到两组样本间的总体分布趋势，阳离子模式主成分1的贡献率为60.84％，主成分2的贡献率为7.95％，阴离子模式主成分1的贡献率为62.68％，主成分2的贡献率为9.67％。结果表明，EG和CK的代谢物成分差异较大，发酵0h与发酵10h的代谢组有显著区别。

代谢物功能及分类注释：使用KEGG、HMDB、Lipid Maps这3类数据库对鉴定得到的代谢物进行功能与分类注释，用以分析了解不同代谢物的功能特性与分类情况。KEGG功能注释：KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是用于从基因组和分子水平信息了解生物系统的高级功能和效用的资源数据库，大致分为新陈代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞加工、有机系统、人类疾病与药物开发。

KEGG具有强大的图形描述关系网络的功能，是用来介绍众多化学物质分子以及相互作用反应和形成的关系网络的系统功能知识库，能够描述众多的代谢途径以及各个途径之间的关系。通过对鉴定得到的代谢组分进行KEGG pathway分析，可以确定代谢物参与的最主要通路类别有新陈代谢、环境信息处理、有机系统等。KEGG功能注释结果表明，主要的代谢通路为新陈代谢，其中脂质代谢、氨基酸代谢以及核酸代谢注释到的化合物最多，分别注释到41种、51种、26种化合物。

HMDB分类注释：HMDB(Human Metabolome Database)是用于人体代谢物研究的标准资源库，主要包含了人体代谢物详细信息，包括其生物学作用、化学反应、疾病关联、代谢途径等信息。目前，HMDB已经广泛应用于生物化学、代谢组学、营养学、临床医学等学科中。通过HMDB分析，对代谢物进行功能本体(CFO)分类分析，可以更深入的研究代谢物本身的性质。使用HMDB对代谢物进行分类注释，将主要的代谢物进行分类注释，结果表明，主要的代谢物为脂质和类脂分子、有机酸及其衍生物、有机杂环化合物等，分别有121种、90种、55种。有机酸与脂类是香味成分形成的关键物质，为发酵后期形成呈味物质丁酸乙酯、2-乙基己醇、双戊烯、壬醛、己酸,2,2-二甲丙基酯等挥发性风味成分提供前体物质。

Lipid Maps分类注释：Lipid Maps是目前研究脂质组学的最大数据库，不仅包括脂质分类结构信息，还有脂质的定性定量方法。根据Lipid Maps提出的脂质分类系统，将脂质大体分为八大类：脂肪酰类、甘油酯类、甘油磷脂类、鞘脂类、固醇脂类、孕烯醇酮脂类、糖脂类以及聚酮类。使用Lipid Maps数据库对代谢物的脂类物质进行进一步的分类分析，分类注释结果显示，主要的脂类代谢物为固醇脂类、脂肪酰类、聚酮类，分别有19种、53种、6种。

差异代谢物筛选分析：将经过鉴定得到的代谢组成分，采用PLS-DA的第一主成分的变量投影重要度值(VIP)和差异倍数(FC)来筛选EG与CK比较后得到的差异代谢物，设定差异代谢物阈值为VIP>1.0，当FC>2.0时，该化合物为含量增加，当FC<0.5时，该化合物为含量降低。EG和CK进行比较分析得到了差异性代谢物共228种，其中含量增加的代谢物有134种，含量降低的代谢物有94种。含量增加的代谢物主要为各类氨基酸，酸类、酯类以及酮类，含量降低的代谢物主要为嘧啶类、嘌呤类以及中长链脂肪酸。结果表明，发酵后的鱼肠其脂类与蛋白类物质经过微生物作用，降解成了更小的分子化合物，以各类氨基酸与有机酸以及酯类化合物为主，这几类代谢物主导着特殊的发酵呈味物质的形成与挥发性风味物质的合成。

差异代谢物聚类分析：代谢功能相同或代谢模式相似的代谢物可能会共同参与同一代谢过程或细胞通路，因此对分析所得的差异代谢物进行层次聚类分析，可以推测某些代谢物的功能。通过聚类分析，得出相似差异代谢物的降解与合成情况。通过横向比较可以直观的显示每个样品其代谢物的聚类关系以及含量高低的情况，在CK与EG中含量增加与含量降低的化合物区别明显，说明，发酵前后的代谢物组分差异显著，同时，功能相似的代谢物的降解与合成情况也一致。

KEGG富集分析：KEGG富集分析是以KEGG Pathway为单位，通过超几何检验，计算得到P-value值，设定阈值P-value≤0.05，确定差异代谢物参与的最主要的生化代谢途径或信号转导途径。KEGG通路富集分析表明，发酵过程中主要代谢通路大多与脂质、酮类、脂肪酸、蛋白质、核苷酸的代谢有关，与微生物的发酵作用相吻合。

使用LC-MS/MS技术对发酵0h和发酵10h的河鲀鱼肉进行非靶向代谢组学研究，共检测到909种化合物，通过PCA分析可以得知，EG与CK有明显的差别，在发酵前后代谢物的组分与含量有明显的变化。对代谢物的功能与类别注释归类，可以得知，KEGG通路注释得到的通路类别有新陈代谢、环境信息处理、有机系统等，其中主要的新陈代谢途径为脂质代谢、氨基酸代谢、碳水化合物代谢等，分别注释到41种、51种、16种化合物。HMDB分类注释得到的代谢物类别主要为脂质和类脂分子、有机酸及其衍生物、有机杂环化合物等，分别有121种、90种、55种。Lipid Maps脂质分类结果表明，主要的脂类代谢物为固醇脂类、脂肪酰类、聚酮类等，分别有19种、53种、6种。

采用PLS-DA分析统计方法，对0h和10h的数据统计分析，筛选得到了228种差异性代谢物，其中含量增加的代谢物有134种，含量降低的代谢物有94种。含量增加的代谢物主要为各类氨基酸，酸类、酯类以及酮类，含量降低的代谢物主要为嘧啶类、嘌呤类以及中长链脂肪酸。对差异代谢物进行聚类分析，发现功能相似的代谢物其降解与合成情况也一致。对差异代谢物进行KEGG富集分析，结果发现，发酵过程中主要代谢通路大多与脂质、酮类、脂肪酸、蛋白质、核苷酸的代谢有关，这与微生物的发酵作用结果相吻合。

结果表明，发酵后的鱼肠其脂类与蛋白类物质经过微生物作用，降解成了更小的化合物分子，以各类氨基酸与有机酸以及酯类化合物为主，这几类代谢物主导着特殊的发酵呈味物质的形成与挥发性风味物质的合成。代表着微生物发酵过程中分解消耗了蛋白质脂肪等大分子营养物质，当代谢物进一步反应，会影响发酵鱼肉的品质形成。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解；其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。