技术领域
本发明涉及DNA杂交与光学超分辨成像,主要涉及一种端粒和着丝粒超分辨成像方法及其探针。
背景技术
端粒是位于真核细胞线性染色体末端的一小段DNA-蛋白质复合体,是短的多重复的非转录序列(TTAGGG)及一些结合蛋白组成特殊结构,起到保护染色体DNA的末端,避免染色体DNA的降解、末端融合以及非正常重组等作用。对于哺乳动物而言,端粒的存在可以维持染色体末端稳定,端粒的长度会随着细胞分裂次数的增加而不断缩短,从而确保细胞内的DNA以及遗传信息能够稳定完整的存在。但是,随着端粒的不断缩短,会致使细胞内的基因组无法维持在稳定状态,最终导致细胞老化、死亡或癌变。因此,测量端粒成像有助于提供与疾病相关的重要信息。
目前已有的端粒和着丝粒成像方法主要有:电子显微镜成像、荧光染色配合光学显微镜成像等。电子显微镜的分辨率可以达到0.1nm,能够以极高的分辨率展现样品的细节。但是电子显微镜也存在各种问题,主要在于电镜的样品制备过程极为复杂苛刻,并且电镜只能看到细胞内部的结构,对于结构的判断需要其他技术辅助辨别。过去,研究人员也使用光学显微镜对端粒进行了成像,该方法通过各种荧光染色方法,可以标记特定的细胞甚至分子。但是,由于光学显微镜的分辨率受光波通过小孔径或聚焦到微小点时的衍射或“散布”的限制,该方法只能以数百纳米的中等分辨率对端粒和着丝粒进行成像,而不能实现单分子水平的成像。
这些方法在端粒研究中有很重要的贡献,但它们都存在不足,如灵敏度低、程序复杂、成本高、分辨率不足等,因此需要设计出具有高灵敏度、高准确性、广泛适用性的端粒和着丝粒成像技术。
基于单分子定位的超分辨荧光显微成像(SMLM)包括光激活定位成像(PALM)与随机光学重构超分辨成像(STORM),将有机荧光探针与超分辨光学显微成像技术紧密结合在一起,有机荧光探针为研究其超分辨成像提供了有力的工具。
利用DNA链的互补性产生类似于荧光分子闪烁的效果也可进行SMLM成像。通过调整DNA链的结合强度和浓度,可以反复产生瞬时结合,获得类似STORM中荧光染料的荧光闪烁现象。对获得的数据进行重建,就可以得到超分辨率图像。
发明内容
发明目的:为解决目前测量端粒超分辨成像方法操作复杂、灵敏度不高、成本高的问题,本发明提供了一种端粒和着丝粒超分辨成像方法及其探针,借助DNA序列的可逆结合实现端粒和着丝粒的超分辨单分子定位成像(SMLM)。
技术方案:为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:一种端粒和着丝粒超分辨成像方法,其包括如下步骤,(1)向接种有待测细胞的细胞培养板中加入固定剂固定好细胞,进行细胞膜穿透;(2)加入RNA抑制剂,进行RNA消化;(3)加入胃蛋白酶使蛋白质分解;(4)加入乙醇使细胞梯度脱水;(5)将端粒DNA探针、着丝粒DNA探针与杂交缓冲液制作成探针溶液,其中所述端粒DNA探针,其序列中包含3个重复单元,所述重复单元的序列如SEQ IDNO.1所示,所述端粒DNA探针和所述着丝粒DNA探针的5’端具有荧光分子;(6)将探针溶液加入到八孔板中进行杂交;(7)利用全内反射照明模式采集细胞上的端粒和着丝粒荧光信号,进行荧光图像的采集和超分辨单分子定位成像。
优选的,所述荧光分子包括Cy3、Cy5中的一种或几种。
优选的,所述端粒DNA探针的序列如SEQ ID NO.2所示,所述着丝粒DNA探针的序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的,步骤(1),所述固定剂包括4%多聚甲醛,所述固定的时间大于20min;所述进行细胞膜穿透,其为用0.2%曲拉通(TritonX-100)透膜,时间大于5min;步骤(2)中,所述RNA抑制剂为PBS配置的RNaseA溶液,浓度为100μg/mL,反应时间大于20min;步骤(3)中,所述胃蛋白酶为浓度0.005%(w/v)的胃蛋白酶溶液,使用浓度为10mM的稀盐酸配制,配制前将稀盐酸加热到37℃,使用前将胃蛋白酶溶液预热至45℃,所述分解的温度为37℃,分解时间大于5min;步骤(4)中,所述梯度脱水其为先后分别使用浓度为70%、85%、100%(v/v)的冰乙醇进行;步骤(5)中,所述杂交缓冲液的配方为:20mMTris-HCl,PH7.4,60%(v/v)甲酰胺,0.1μg/mL鲑鱼精DNA;步骤(6)中,所述杂交需先将八孔板加热至85℃,时间为10min,再加入DNA端粒探针和DNA着丝粒探针,然后在避光条件下进行杂交反应,杂交温度为37℃,杂交时间为3小时。
优选的,步骤(7)中,所述采集细胞上的端粒和着丝粒荧光信号,其利用激发光波长分别为647nm、561nm,收集>561nm和>642nm的荧光信号,所述进行荧光图像的采集,其图像曝光时间50毫秒,采集至少3000帧。
作为本发明的另一方面,本发明提供一种用于端粒和着丝粒超分辨成像的探针,其特征在于:探针的5’端具有荧光分子,所述荧光分子包括Cy3、Cy5中的一种或几种;所述探针包括端粒DNA探针和着丝粒DNA探针,所述端粒DNA探针的序列中包含3个重复单元,所述重复单元的序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的,所述端粒DNA探针的序列如SEQ ID NO.2所示,所述着丝粒DNA探针的序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明所提供的端粒和着丝粒超分辨成像方法及其探针,相对于现有技术,具有如下优势:
1、本方法使用的端粒和着丝粒DNA探针能够与端粒和着丝粒的结合可逆;
2、本发明使用的DNA探针在进行SMLM超分辨成像的过程中利用全内反射照明实现两种探针荧光信号的开和关,不需要特殊的仪器或操作来进行光切换;
3、本发明采用DNA探针原位杂交实现端粒超分辨成像,具有实验成本低、周期短、特异性好、准确度的优点。
附图说明
图1为本发明提出的端粒和着丝粒超分辨成像方法的示意图;
图2为本发明中使用的端粒和着丝粒DNA探针的结构示意图;
图3为在647nm和561nm两个激发光通道下分别对端粒和着丝粒探针进行SMLM超分辨成像的图像,其中,左边为端粒DNA探针的单分子定位图像,荧光的平均强度为2.57,右边为着丝粒DNA探针的单分子定位图像,荧光的平均强度为3.09,比例尺都为1μm。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
本发明中原料来源如下:
1、PBS缓冲液为pH=7.4,浓度为10mM的PBS缓冲液;
2、5’-Cy5 TTTTTCCCTAACCCTAACCCTAA-3’的端粒DNAT探针和序列为5’-Cy3TTTTTAGCTTCTGTCTAGTTT-3’的着丝粒DNA探针均由生工生物工程(上海)公司合成;
3、鲑鱼精DNA购自Sigma公司;
4、其余材料均为市售所得。
实施例1:
向接种有Hela细胞的八腔Nunc
向八孔板中加入200μL NaBH
向八孔板中加入200μL鲑鱼精DNA溶液(100μg/mL),37℃反应10min后取出,用PBS缓冲液洗涤;将八孔板至于加热板上,85℃预热10min,然后加入配好的两种探针溶液各100μL,并85℃加热10min。加热完成后取出八孔板,于室温环境下避光进行避光杂交反应,时间3h。
上述DNA探针原位杂交样品制备完成后,将八孔板固定在超高显微镜的载物平台上以用于基于单分子定位的超分辨成像。使用100倍油镜,激发光波长分别为647nm和561nm,激发强度为3%,收集>561nm和>642nm的荧光信号利用全内反射照明模式的宽场显微镜采集细胞上的端粒(Cy5)和着丝粒(Cy3)荧光信号,收集的荧光信号的波长范围为>642nm(Cy5)和>561nm(Cy3),进行荧光图像的采集和超分辨单分子定位成像,图像曝光时间50毫秒,采集至少3000帧。
本申请使用的端粒DNA探针是一种能与端粒杂交的DNA序列(SEQ ID NO.2:5’-Cy5TTTTTCCCTAACCCTAACCCTAA-3’),5’端修饰有荧光分子Cy5,共含有3个CCCTAA重复单元(SEQID NO.1),确保其与端粒杂交的过程是可逆的,着丝粒DNA探针是一种能与着丝粒杂交的DNA序列(SEQ ID NO.3:5’-Cy3TTTTTAGCTTCTGTCTAGTTT-3’),5’端修饰有荧光分子Cy3。
本发明的实验经过了一系列的探索过程,本发明最初的检测效果不佳,在细胞核区域无法观察到DNA探针的闪烁现象,对此不断调整固定和透膜的实验步骤,其中比较关键的是透膜的时间和使用曲拉通(TritonX-100)溶液的浓度。经过多次实验比较,当透膜的时间设置为10min,曲拉通(TritonX-100)的浓度设置为0.2%,在成像过程中,出现DNA探针的闪烁现象杂乱无章、背景噪声较强以及DNA探针聚集在核膜处而不是细胞核内的情况,这表面DNA探针溶液的浓度对成像有显著的影响。DNA探针浓度过大,会导致背景噪声强,并且大量探针聚集在核膜的情况;DNA探针浓度过小,则会可能使部分端粒和着丝粒的位点没有DNA探针与之结合。最终,在尝试多个浓度的DNA探针进行成像实验后,选择的DNA探针的浓度为10nM。
本发明公开了一种端粒和着丝粒超分辨成像方法,该方法需要用到两种DNA探针,一种为能与端粒杂交的端粒DNA探针,另一种为能与着丝粒杂交的着丝粒DNA探针。将端粒DNA探针和着丝粒DNA探针加入到用固定剂固定好的细胞样品上,使该两种探针能分别杂交到端粒和着丝粒上。所用端粒DNA探针和着丝粒DNA探针与端粒和着丝粒的结合可逆,利用全内反射照明实现两种探针荧光信号的开和关,进行端粒和着丝粒的超分辨单分子定位成像(SMLM)。该方法具有实验成本低、周期短、特异性好、准确度高的优点。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 东南大学
<120> 一种端粒和着丝粒超分辨成像方法及其探针
<141> 2020-12-24
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ccctaa 6
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> 5’UTR
<222> (1)..(1)
<223> Cy3或Cy5
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 2
ntttttccct aaccctaacc ctaa 24
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> 5’UTR
<222> (1)..(1)
<223> Cy5或Cy3
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 3
ntttttagct tctgtctagt tt 22
机译: 一种用于检测前列腺癌的方法,该方法使用的探针组包括myc特异性和磷酸酶以及与肌腱7、8和10号染色体相关的张力蛋白同源(pten)同源探针和着丝粒探针,以及探针组和试剂盒
机译: 用于超分辨成像生物或生物的显微镜设备以及用于超分辨成像生物或生物的方法
机译: 用于超分辨成像生物或生物的显微镜设备以及用于超分辨成像生物或生物的方法