油红O的应用及定量检测组织或细胞内脂质的方法

摘要

本发明属于生物医药领域，具体涉及油红O或其化学结构可接受的盐应用于制备标记脂滴的荧光染料，在细胞或组织水平对脂滴进行荧光标记，实现定量检测脂滴。油红O或其化学结构可接受的盐具有特异性标记、荧光信号稳定等特点，可应用于制备与脂质(脂滴)代谢相关疾病的诊断试剂，科研和医疗具有方面有的广阔应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药和诊断试剂技术领域，具体而言，本发明涉及对油红O染料荧光属性的发现与荧光属性参数的确定，并在细胞水平和组织水平对于细胞内脂滴定量检测的应用。

背景技术

油红O(oil-red O，ORO)又名苏丹红5B，是一种分子式为C

油红O染料通常被用于脂质染色，其染色原理一般被认为是物理上的溶解作用或吸附作用，通过自身的亲脂和显色特性指示生物样本内的脂质成分，即先把油红O染料溶于有机溶剂中，细胞样本或冰冻切片内的脂质对于油红O染料的溶解度较在原溶剂中的溶解度更大，所以染料就从有机溶剂转移入脂质而使脂肪染色。因此，在科学研究和临床诊断中，油红O染色常用于显示细胞、组织和器官的脂肪变性和类脂质的异常沉着，在代谢、心血管、内分泌和肿瘤等疾病领域被广泛应用。

脂滴(lipid droplets,LDs)是细胞内中性脂的主要贮存场所，广泛存在于细菌、酵母、植物、昆虫以及动物细胞中。脂滴是一种呈球状的细胞器，它的核心由中性脂肪组成，主要包括甘油三酯和胆固醇酯，主要功能是动态调节细胞的能量平衡。在脂肪组织中，脂滴主要用于脂质(甘油三酯)的储存，而在其它组织中细胞内出现大量脂滴的现象被称为脂肪变性。当肝细胞内大量脂滴蓄积(脂肪水平大于5％)则是判断脂肪肝的诊断标准。随着对于脂滴研究的日益深入，发现细胞内脂滴的数量、大小和分布受到多基因调控，并与细胞内应激、自噬等多种调控机制紧密联系。因此，脂滴作为胞内微环境的重要表型，对其的标记在生物医药研究中具有重大的意义。

油红O染料能够对细胞内脂滴进行标记，但传统的油红O染色在临床中仅能对脂肪变性进行定性鉴别，或基于主观判断的严重程度诊断，在科研中则限于定性和定位的实验结果。目前还没有利用油红O染色来定量测定脂肪的报道。

荧光信号的标记和示踪作用目前被广泛应用于生命科学研究中，其中荧光染料、荧光标记抗体和荧光蛋白作为信号载体常被应用于对各种生物分子的定量检测。在形态学研究领域，荧光标记在传统研究方法中(如免疫荧光)主要用于对特定生命靶标的定性和定位研究。然而，结合现代高通量成像设备和图像分析软件，荧光信号高特异性和低背景信号的特点在图像定量分析中具有独特的优势。如运用现代高内涵成像技术，不仅能获得高通量生物学图像信息，还能通过相关分析软件对荧光信号进行荧光面积、荧光强度、位置关系等各类参数的分析，并且获得以细胞为单位的检测结果。

我们在前期研究中发现油红O染料能够被激发出特异性荧光信号，其荧光染料属性有望拓展对脂滴研究的应用范围，并实现对脂滴的多参数定量分析。

通过油红O对脂滴的标记，在高通量图像采集和分析系统中获取其荧光信号，即能实现对细胞内脂滴数量、大小(分级)、强度、分布信息的收集和定量分析，为脂滴相关的生命科学研究提供了有力的研究工具。

发明内容

本发明旨在提供油红O或其化学结构上可接受的盐的应用。

本发明另一个目的在于提供定量检测脂质(脂滴)的方法，尤其是定量检测细胞内脂滴的方法。

技术方案为，将油红O或其化学结构上可接受的盐应用于制备标记脂质(脂滴)的荧光染料。具体的，在细胞或组织水平对脂质(脂滴)进行荧光标记，将油红O或其化学结构上可接受的盐应用制备在细胞水平或组织水平定量检测脂质(脂滴)的荧光染料。

油红O或其化学结构上可接受的盐的理论激发波长为628nm，发射波长为684nm。油红O或其化学结构上可接受的盐的激发波长为530-680nm，发射波长为575-770nm。

本发明另一个技术方案，一种定量检测脂质(脂滴)的方法，包括以下步骤：

(1)用油红O溶液或其化学结构上可接受的盐溶液对样本的脂质(脂滴)进行标记；

(2)在530-680nm下激发，采集575-770nm下染色样本的荧光信号图像；

(3)对荧光信号图像进行定量分析。

采用该方法，尤其用于定量检测组织或细胞内脂滴。通过上述方法，利用高通量图像采集和分析系统获取荧光信号，就可以实现对组织或细胞内脂滴数量、大小(分级)、含量、分布信息的收集和定量分析。

优选的，步骤(1)中所述的样本为细胞或组织样本。

优选的，步骤(2)中，在617-645nm下激发，采集672-712nm下染色样本的荧光信号图像。

优选的，步骤(2)中，用荧光酶标仪、激光扫描系统、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、切片扫描系统或高内涵成像系统采集染色样本的荧光信号或图像。

更优选的，用高内涵成像系统采集染色样本的荧光信号图像。并且，步骤(3)中，采用荧光面积分析、荧光强度分析、颗粒计数分析、颗粒大小分析等方法，检测脂滴数量、大小(分级)、含量、分布等信息。

更为优选的，步骤(2)中，在628nm下激发，采集684nm下染色样本的荧光信号图像。

我们在研究中发现油红O染料及其化学结构上可接受的盐能够被激发出特异性荧光信号，可以发射红色荧光，特异性好，信号稳定，可以反映脂质(脂滴)浸润程度。因此利用其荧光染料属性拓展对脂质(脂滴)研究的应用范围，并实现对脂质(脂滴)的多参数定量分析。

因此，油红O或其化学结构上可接受的盐能够应用于制备脂质代谢相关疾病的临床诊断试剂和科研检测试剂。

通过油红O对脂滴的标记，在高通量图像采集和分析系统中获取其荧光信号，即能实现对组织内或细胞内脂滴数量、大小(分级)、含量、分布等信息的收集和定量分析，为脂质相关的生命科学研究提供了有力的研究工具和临床诊断工具。

本发明的有益效果在于，利用油红O或其化学结构上可接受的盐的荧光属性，且具有特异性标记、荧光信号稳定等特点，将其作为荧光染料应用于标记脂滴，尤其是在细胞或组织水平对脂质(脂滴)的荧光标记。油红O在或其化学结构上可接受的盐在特定波长下被激发，并收集发射波长下的荧光信号图像，实现组织内或细胞内脂滴定量检测。并且可用于制备与脂质代谢相关疾病的临床诊断试剂和科研检测试剂，科研和医疗的应用前景广阔。

附图说明

图1为油红O染料荧光参数检测流程

图2为不同波长范围下，通过光谱扫描递进式确定油红O特异性激发波长与发射波长

图3为油红O特异性激发波长/发射波长的确定

图4为油红O染料在荧光显微镜中荧光成像的应用

图5为油红O染料在激光共聚焦显微镜中荧光成像的应用

图6为油红O染料在激光扫描系统中特异性荧光信号的获取

图7为油红O染料在小鼠肝组织切片中的成像(分别为明场下和荧光下正常小鼠与脂肪肝模型小鼠肝组织切片图)

图8为空白对照肝细胞样本与不同浓度脂肪酸诱导的肝细胞样本经油红O染色后，在高内涵成像系统中的具有量效关系的荧光图像

图9为通过高内涵成像分析获得的细胞内脂滴平均荧光面积(MGA)的分析结果(A)及根据MGA分析结果获得的函数关系拟合(B)

图10为通过高内涵成像分析获得的脂滴平均荧光强度(AGI)的分析结果(A)及根据AGI分析结果获得函数关系拟合(B)

图11为通过高内涵成像分析获得的细胞内脂滴颗粒数(GPC)分级计数的定量结果

图12为通过高内涵成像分析获得的细胞内不同粒径脂滴颗粒数(GPC)计数的统计结果，粒径为1.6-3μm

具体实施方式

实验材料(一)细胞株

人肝癌细胞HepG2和小鼠肝实质细胞AML12，均购自于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

表1.细胞株及培养条件

(二)实验试剂

pH7.4磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline，PBS)；碳酸氢钠；

DMEM(Dulbecco's modification of Eagle's medium)高糖培养基，Gibco(美国)；配制时加入碳酸氢钠校准pH值，加入表1中培养液添加试剂，后用超纯水溶解并过膜除菌。

DMEM/F-12培养液，美仑生物(中国)，批号MA0214-JAN-07F；配制时加入表1中培养液添加试剂，后用超纯水溶解并过膜除菌。

胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，Gibco；抗生素(penicillin-streptomycin-glutamine，100X)；棕榈酸；油酸。

油红O(粉末)，Merk/Sigma-Aldrich(德国)；用异丙醇将粉末溶解后配置成(w/v＝0.5％)的油红饱和储备液，4℃冰箱避光保存。

DAPI荧光染料，ThermoFisher(美国)，货号D1306。

棕榈酸钠；胰蛋白酶，Gibco；异丙醇。

(三)实验仪器

多功能酶标仪Molecular Devices-Spectra Max 190(美国)；

倒置荧光显微镜Olympus-IX71(日本)；

激光共聚焦显微镜Leica-SP8(德国)；

荧光扫描成像系统GE-TyphoonFLA9500(美国)；

高内涵成像分析系统Molecular Devices-ImageXpress Micro 4(美国)；

多光谱切片扫描分析系统Perkin Elmer-Vectra(美国)；

Eppendorf微量移液器，德国；

ESCO培养箱CCL-170B-8，新加坡；

生物安全柜ESCO-AC2-4S1(新加坡)；

冷冻离心机Eppendorf-5810R(德国)；

二氧化碳培养箱ESCO-CCL-170B-8(新加坡)。

实施例1油红O染料荧光属性参数的确定

通过确定油红O染料的各荧光参数明确其荧光染料属性，并通过油红O染料在各种荧光信号检测设备中的应用验证其实际使用范围。其检测流程如图1所示。

(一)脂滴浸润肝细胞样本的制备

(1)游离脂肪酸(FFAs)悬液的制备

以油酸/棕榈酸＝2:1的比例进行混合(FFAs的浓度为油酸与棕榈酸物质浓度总和)。工作液浓度为2×悬液，倍比稀释为梯度浓度，实现终浓度分别为900、450、225、112.5、56.25、28.125、14.0625和7.03125μM。

(2)脂滴浸润肝细胞样本的制备

根据检测方法选择适用的培养板，肝细胞株HepG2或AML12悬液进行铺板(1×10

贴壁24h后，加入相应浓度的FFAs工作液，设无FFAs诱导的贴壁细胞样本为对照孔(Control)，Blank补足培养液体积。FFAs作用48h后，显微镜下能观察到肝细胞内不同程度的脂滴浸润表型。

肝细胞株HepG2和AML12的培养液分别为DMEM和DMEM/F-12培养液，并加入表1中培养液的添加试剂。

(二)油红O染色

(1)染色工作液的制备

将油红饱和溶液(w/v＝0.5％)与水以3:2的比例混匀，静置10min后滤纸过滤，使用前再次震荡混匀。用PBS稀释DAPI储备液至工作液浓度125ng/ml。染色工作液均需现配现用。

(2)细胞固定与染色

用福尔马林固定细胞样本1h后，弃去固定液，PBS清洗2遍。使用油红O工作液染色15min后，弃去染液，PBS清洗2～3遍。再用DAPI染液工作液染色10min后，弃去染液，PBS清洗2～3遍。最后加入PBS防止干燥。

(三)油红O染料荧光参数的检测

油红O染料发射红色荧光，故将酶标仪初始激发光波长范围设定为500～700nm，发射光波长范围设定为550～750nm，步进为20nm，进行荧光扫描。根据扫描结果，缩小扫描范围和步进值。结果如图2。直至步进为1nm时，确定油红O染料的最佳激发波长，和发射波峰值。然后，以确定的激发波长读取相应范围内(步进＝10nm)的各点荧光强度，并绘制油红O染料的荧光发射波形图。最后通过不同荧光检测设备进一步确定油红O染料的荧光属性，并对其荧光参数进行验证(具体实验流程见图1)。

1.油红O染色在荧光显微镜中的成像

使用倒置荧光显微镜观察并记录蓝色荧光通道(DAPI)和红色荧光通道(油红O)的成像结果，油红O染料荧光成像的主要光学参数如下。

光源：12V100W汞灯

滤光块：WIG为530-550nm绿色激发/大于575nm红色荧光(长通滤光)

物镜倍数：20倍与40倍

2.油红O染色在激光共聚焦显微镜中的成像

用35mm玻璃底培养皿，AML12(1×10

激发光源：638nm激光

发射光检测范围：655-690nm

物镜倍数：25倍与100倍

3.油红O染色在激光扫描系统中的荧光信号

使用激光扫描系统，在cy5[CH.2]通道下，对油红O染色的不同脂滴浸润程度的肝细胞样本进行Pixel Size＝50μm的扫描，所获得的图像用Image Quant TL软件进行分析。油红O染料荧光信号的主要光学参数如下。

激发光源：635nm激光

发射光检测范围：大于660nm长通滤光(long red pass,LPR)

感光器件：250v光电倍增管(PMT)

4.油红O染色在多光谱扫描系统中的组织成像

小鼠肝组织经冷冻切片，片厚为8μm，使其粘附于载玻片后，室温干燥，并按照以下步骤进行染色：60％异丙醇浸润1min→油红O染色，37℃烘箱30min→60％异丙醇分化1min→流水冲洗→苏木精复染30s→流水冲洗→1％HCl乙醇分化10s→流水冲洗至镜下可见肝细胞胞核返蓝→DAPI室温染色10min→流水冲洗→水溶性封片剂封固。

油红O染料荧光成像的主要光学参数如下。

LED光源：560-680nm

发射光检测范围：630-770nm

物镜倍数：20倍

5.油红O染色在高内涵成像系统中的成像

使用高内涵成像系统，在cy5通道下，对油红O染色的不同脂滴浸润程度的肝细胞样本进行图像采集，所获得的图像用MetaXpress软件进行分析。油红O染料荧光成像的主要光学参数如下。

激发光源：LED固态光源617-645nm

发射光范围：672-712nm

物镜倍数：20倍(四)实验结果

1.关于油红O染料荧光激发波长与发射波长的确定

在不断缩小扫描范围(从500-750nm至620-684nm)和减小步进值(从20nm至1nm)(见图2、表2)，最终通过多次在步进为1nm光谱扫描条件下，确定油红O染料的荧光激发波长在628nm附近，发射波长在684nm附近(见图3)。然后，以628nm为激发波长读取630-810nm(步进＝10nm)的各点荧光强度，并绘制油红O染料的荧光发射波形图。

表2.通过光谱扫描确定油红O特异性激发波长/发射波长范围

2.油红O染料在荧光显微镜中的成像

在20倍与40倍物镜下分别观察油红O染料(红色荧光通道)和DAPI(蓝色荧光通道)的成像结果，并拍摄典型视野的成像图片。在红色荧光通道能够明显观察到油红O的荧光信号，其定位主要分布在细胞质中，与脂滴的胞内定位基本重合。但由于以汞灯为光源，且可供选择的WIG滤光块(530-550nm绿色激发/大于575nm红色发射)可能并不是油红O染料荧光的最佳Ex/Em检测参数，因此成像质量相对模糊(见图4)。

3.油红O染料在激光共聚焦显微镜中的成像

用激光共聚焦显微镜对油红O与DAPI染色的脂滴浸润肝细胞样本进行观察。在638nm激发波长和655-690nm发射波长检测范围中，能明显记录到油红O染料的荧光发射。而在100倍物镜条件下，不仅能清晰呈现脂滴在细胞胞质中的定位特征，且脂滴的数量、大小、分布等关键表型特征也均能被观察和记录(见图5)。

4.油红O染料在激光扫描系统中的荧光信号

以激光作为激发光源，在激光扫描系统(Typhoon 9500)的cy5荧光通道(LRP-635nm)下能检测到特异性荧光信号。对不同浓度FFAs诱导的脂滴浸润肝细胞进行观察，结果如图6。与FFAs诱导样本比较，对照(Control)样本孔显示为极低的本底荧光信，而随FFAs诱导浓度的增加，油红O的荧光型号也呈现为梯度的增加。值得注意的是，激光扫描的培养孔板检测是以培养孔作为观测和分析单位，除了能反映细胞内脂滴浸润程度，也受到孔内细胞数量的影响，如干预因素对细胞具有损伤作用或抑制其增殖，则实验结果需要进行综合评价。

5.油红O染料在组织切片中的成像

运用多光谱切片扫描分析系统分别采集小鼠肝组织明场与荧光图像，样本组织分别来自于正常小鼠与脂肪肝模型小鼠肝组织。明场成像样品通过油红O/苏木素染色，并在同一样品进行DAPI染色，获得油红O/DAPI荧光成像，结果如图7。实验结果显示，油红O不仅能够在明场中对脂滴进行显色，同样具有荧光属性，对组织中的脂质(脂滴)具有特异性标记作用，其标记区域与显色强度均与明场一致，与DAPI共染则可为后期组织成像分析提供更优的图像数据。

6.油红O染料在高内涵成像系统中的图像采集

使用高内涵成像系统，在cy5通道下，对油红O染色的不同脂滴浸润程度的肝细胞样本进行图像采集。细胞成像结果显示，油红O染色的荧光标记作用能够对细胞内脂滴有效标记。随FFAs诱导浓度的增加，油红O荧光面积与荧光强度均浓度依赖的增加。无FFAs诱导细胞样本也含有低水平的胞内脂滴，油红O染色也够清晰标记，而并非表现为非特异性的弥散本地分布。并且在20倍物镜拍摄条件下，已能获取可供后期分析的脂滴表型特征(见图8)。与酶标仪与激光扫描系统的量化检测不同，在用DAPI进行细胞核标记的前提下，高内涵成像系统可进行以细胞为单位的形态学表型分析，即可将细胞数量的变化与脂滴表型的变化进行分类评价。

7.油红O染料的荧光属性参数

油红O作为一种常用脂质标记染料，被长期应用于细胞或组织脂质浸润的观察。而其荧光染料属性尚未被应用于实验研究和临床检验。通过荧光酶标仪光谱扫描，确定油红O染料的最适激发波长和发射波长分别为628nm和684nm。而在各种荧光检测设备中验证，在相应光学通道中均能获得特异性荧光信号和高质量荧光成像结果，汇总的荧光参数具体见表3。由于荧光信号的低背景特点，则可为后期的图像分析与表型量化提供更有价值的成像结果。

表3.油红O染料在不同检测设备中的荧光参数列表

实施例2油红O荧光染料对于细胞内脂滴的定量分析

以高内涵图像分析为典型分析方法，建立对细胞脂肪变性程度和脂滴特征性指数的量化分析方法。

(一)油红O标记脂滴的高内涵定量分析

通过梯度浓度FFAs(7.03125-900μM)诱导的脂滴浸润肝细胞模型的制备，在进行油红O核DAPI染色后，用高内涵采集细胞荧光图像。通过MetaXpress(Granularity Module)软件对图像进行分析，得到颗粒总数(Granules)，每个细胞的颗粒数(Granules PerCell)、总颗粒面积(Total Granule Area)、平均颗粒面积(Mean Granule Area)、综合颗粒强度(Integrated Granules Intensity)、核总数(Nucle)和将脂滴分级后的各级颗粒总数。综合评价脂滴浸润细胞的脂肪变性程度核脂滴特征性。

(二)统计学分析

本实验数据使用Graphpad Prism 7.0.0进行统计学分析并作图，统计方法采用t检验(Student's t test)和单因素方差分析(Oneway-ANOVA)，结果以Mean±SD表示。当p<0.05表明具有显著性差异。

(三)实验结果

1.油红O荧光染料在高内涵中的脂滴荧光面积(MGA)分析

通过MetaXpress(Granularity Module)软件分析，我们发现平均颗粒面积(MGA)、平均颗粒强度(AGI)与FFAs浓度有明显的量效关系。通过HepG2与AML12制备的脂滴浸润肝细胞模型均能获得良好的重复性。

计算方法：平均颗粒面积(μm

高内涵脂滴荧光面积(MGA)分析及函数关系拟合如图9。MGA分析结果显示，在FFAs7.03125-900μM浓度范围内，MGA均显示出明显的量效关系，且FFAs 14.0625μM浓度以上与对照细胞比较均具有显著的统计学差异。将FFAs 28.125-450μM浓度范围内的结果进行函数关系拟合，能够获得良好的线性关系(R

2.油红O荧光染料在高内涵中的荧光强度(AGI)分析

计算方法：平均颗粒强度(AGI)＝总荧光像素强度/细胞核数

高内涵脂滴荧光强度(AGI)分析及函数关系拟合如图10，AGI分析结果显示，在FFAs 7.03125-900μM浓度范围内，AGI均显示出明显的量效关系，且FFAs 14.0625μM浓度以上与对照细胞比较均具有显著的统计学差异。将FFAs28.125-450μM浓度范围内的结果进行函数关系拟合，能够获得良好的线性关系(R

3.油红O荧光染料在高内涵中的细胞脂滴颗粒计数(GPC)分析

计算方法：细胞脂滴颗粒数(GPC)＝总脂滴颗粒数/细胞核数

脂滴颗粒数分级统计结果如图11，GPC分析结果显示，在FFAs7.03125-900μM浓度范围内，观察视野的平均颗粒数同样显示出量效关。将颗粒按面积分为小1.6-3μm