获得抗尖孢镰刀菌香石竹无性系的方法

摘要

本发明涉及获得抗尖孢镰刀菌香石竹无性系的方法，属于植物组织培养技术领域，本发明利用香石竹诱导愈伤组织，采用甲基磺酸乙酯（EMS）诱变并附加尖孢镰刀菌毒素筛选，以获得抗尖孢镰刀菌的育种中间材料。本方法利用细胞无性系诱变后将病原菌毒素加入培养基中筛选抗病性种质的技术，可以在较小空间内培养和处理大量细胞；在细胞水平上直接诱发与筛选突变体，是高等植物抗性育种微生物化的一种尝试；可以缩短抗病育种周期，且进行定向选育，选择效率高，效果好，节省了田间育种周期，为香石竹抗病育种提供了新的方法。

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体的说，涉及获得抗尖孢镰刀菌香石竹无性系的方法。

背景技术

香石竹(Dianthus caryophyllusL.)又名康乃馨(Carnation)，为石竹科(Caryophyllaceae)石竹属(Dianthus Linn)多年生草本植物，与月季、菊花并列为三大切花(郭志刚和张伟，1996)，在全世界鲜切花销售额中占15％。自20世纪80年代末，香石竹在云南大规模生产以来，香石竹占据云南鲜切花中近1/3的比重，成为云南主要出口的鲜切花之一。据统计，2014年云南切花香石竹生产面积为2.84万亩，年产切花20余亿支，主产区分布在昆明、玉溪、红河、楚雄、曲靖等地。

病虫害问题一直是制约香石竹种苗和切花生产质量提高的首要因素。由尖孢镰刀菌香石竹专化型土传真菌(Fusariumoxysporumf.sp.diathi)引起的枯萎病是香石竹生产中最严重的土传病害之一(Say etal.,1992)，全世界香石竹种植区均有感染和为害的报道。该病在我国各香石竹生产区普遍发生，危害较重，防治困难，造成了严重的经济损失。香石竹镰刀菌枯萎病菌主要危害香石竹植株的根部，引起维管束枯萎，造成植株枯萎死亡，危害症状该病初期植株下部枝、叶褪绿和枯萎。典型病株只有植株的一面受到侵害，后期常常出现“歪脖”病状。

为有效控制香石竹枯萎病，多年来国内外科研工作者对这种病害的病原生物学、防治方法、抗性生理机制等方面进行了研究，摸清了香石竹枯萎病菌的生长习性、枯萎病的发生规律及部分抗性生理机制，在防治上选育和合理利用抗病品种依然是最有效的手段之一。采用体细胞无性系变异离体筛选技术，可加速抗病育种进程，但目前在香石竹上还没有相关报道。

发明内容

本发明提供了一种获得抗尖孢镰刀菌香石竹无性系的方法，操作方便，周期短，可获得具有中抗水平的抗尖孢镰刀菌香石竹无性系离体，可用于香石竹的抗病育种。

为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

所述的获得抗尖孢镰刀菌香石竹无性系的方法，具体包括如下步骤：

1)香石竹愈伤组织的诱导：

采用香石竹组培苗的茎段、叶片或茎尖进行诱导获取愈伤组织；一般培养30d可以获得愈伤组织，之后需要继代2-3次后可以获得黄色、疏松胚性较好的愈伤组织；

2)愈伤组织悬浮培养及EMS诱变：

取黄色、疏松胚性较好的愈伤组织压碎，接种至含Dicamaba浓度1.0mg·L

配置体积百分比浓度为0.8％的EMS溶液；选择生长基本一致且均是黄色疏松状态的香石竹悬浮细胞团浸泡于EMS溶液中4-6h后，用无菌水冲洗3遍；

3)尖孢镰刀菌毒素加压筛选：

配制含体积分数80％的尖孢镰刀菌毒素提取液的毒素选择培养基；；将经EMS诱变的悬浮细胞团接种于毒素选择培养基上，10d后将存活的细胞团转入未添加毒素的毒素选择培养基上培养10d，再转入毒素液体选择培养基进行筛选，如此反复筛选3次；

4)再生培养：

将存活的细胞团转入再生培养基中诱导分化30d，获得抗尖孢镰刀菌的香石竹无性系离体。

进一步优选，步骤1)中，诱导愈伤组织的培养基配方为MS+Dicamaba 0.5-2mg·L

进一步优选，步骤1)中，诱导愈伤组织的培养基配方为MS+Dicamaba 1mg·L

进一步优选，步骤3)中，毒素选择培养基为MS+BA 0.8mg·L

进一步优选，步骤4)中，再生培养基为MS+BA 0.5mg·L-1+TDZ 0.1mg·L-1+NAA0.1mg·L-1。

进一步优选，步骤2)中，恒温摇床振荡培养的条件为25℃、120rpm。

进一步优选，步骤2)中，香石竹悬浮细胞团28d继代一次，继代时，倒掉1/3的旧悬浮培养液后再加入等量的新悬浮培养液。

本发明的有益效果：

本方法利用细胞无性系诱变后将病原菌毒素加入培养基中筛选抗病性种质的技术，可以在较小空间内培养和处理大量细胞；在细胞水平上直接诱发与筛选突变体，是高等植物抗性育种微生物化的一种尝试；可以缩短抗病育种周期，且进行定向选育，选择效率高，效果好，节省了田间育种周期，为香石竹抗病育种提供了新的方法。

附图说明

图1是香石竹组培苗不同部位愈伤组织的诱导，其中，A叶片培养15d以后形成的愈伤组织；B茎尖培养20d以后形成的愈伤组织；C茎段培养20d以后形成的愈伤组织。

图2是不同部位悬浮培养的增殖情况。

图3是香石竹细胞团加压筛选后的再生情况；A刚分化出来的小芽；B再生植株的形成；C大量再生植株的形成。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。

实施例

供试材料为感病的香石竹多头品种“紫蝴蝶”的组培苗。培养方法如下：

1)香石竹愈伤组织的诱导

采用香石竹组培苗的茎段、叶片或茎尖进行诱导获取愈伤组织，诱导愈伤组织的培养基配方为MS+Dicamaba 1mg·L

茎段、叶片、茎尖出愈率均为85％以上，且叶片的出愈率最高，为94.44％，诱导出的愈伤组织生长较好，均为疏松的黄色愈伤组织(图1)。

2)愈伤组织悬浮培养及EMS诱变

取2g鲜重黄色、疏松胚性较好的愈伤组织，用灭菌玻璃棒轻轻将其压碎，接种至含Dicamaba浓度1.0mg·L

配置体积百分比浓度为0.8％的EMS溶液；选择生长基本一致(黄色疏松状态)的香石竹悬浮细胞团浸泡于EMS溶液中4h后，处理完后用无菌水冲洗3遍；然后转接到继代培养基(MS+Dicamaba 1mg·L

3)尖孢镰刀菌毒素加压筛选

将香石竹多头品种“紫蝴蝶”经EMS诱变的悬浮培养细胞团接种于含体积分数80％的尖孢镰刀菌毒素提取液的毒素选择培养基(MS+BA 0.8mg·L

经尖孢镰刀菌粗毒素筛选后，120个香石竹多头品种“紫蝴蝶”的细胞团有13个存活，存活率为10.83％，其中又有3个分化出了不定芽，分化率为23.08％，突变率为2.5％。

4)将最终存活的细胞团转入再生培养基中诱导分化，30d后统计分化率。再生培养基配方为MS+BA 0.5mg·L

再生植株在再生培养基(BA 0.5mg·L

5)抗尖孢镰刀菌无性系再生苗的抗病性鉴定

对香石竹多头品种“紫蝴蝶”的组培小苗和筛选出来的抗病再生苗人工接种香石竹枯萎病菌孢子悬浮液(孢子1×10

如图3所示，以紫蝴蝶组培小苗为对照，对比筛选株的抗病性。紫蝴蝶抗尖孢镰刀菌无性系人工接种镰刀菌孢子悬浮液后10d，其植株正常生长，对枯萎病表现出一定的抗性。紫蝴蝶的相对抗病性指数为0.11，为高感品种，而经毒素加压筛选获得的紫蝴蝶抗病无性系的相对抗病性指数为0.45，为中抗水平。

实验分析

供试材料为感病的香石竹多头品种“紫蝴蝶”的组培苗。

所用尖孢镰刀菌香石竹专化型(Fusarium oxysporum f.sp.diathi)菌株为从香石竹枯萎病株上分离得到，并用王继华等(2004)的方法经PCR鉴定和常规培养技术鉴定，于马铃薯(PSA)培养基上保存待用。

1、香石竹愈伤组织的诱导

采用组培苗的茎段、叶片、茎尖分别诱导愈伤组织，培养基添加的糖为糖30g/L，pH值5.8，水解酪蛋白300mg·L

愈伤组织诱导结果：诱导出较好的香石竹愈伤组织，同时比较了香石竹不同部位和Dicamaba不同浓度的诱导效率，使用了不同浓度的Dicamaba对香石竹组培苗的茎段、叶片和茎尖进行处理，结果见表1。茎段、叶片、茎尖在Dicamaba 1.0mg·L-1时诱导率最高，并且与Dicamaba其他浓度差异性显著，出愈率均为85％以上，且叶片的出愈率最高，为94.44％，诱导出的愈伤组织生长较好，均为疏松的黄色愈伤组织。

表1不同浓度的麦草畏(Dicamaba)对紫蝴蝶组培苗不同部位愈伤组织诱导的影响

注：同一列中不同小写字母为使用Duncan多重范围检测在0.05水平差异显著性。

2、愈伤组织悬浮培养及EMS诱变

取2g鲜重疏松易碎的愈伤组织，用灭菌玻璃棒轻轻将其压碎，接种至100ml锥形瓶中，瓶内为40mlDicamaba浓度1.0mg·L

在悬浮培养初期，悬浮培养物呈颗粒状，28d继代一次，通过不断的增殖，28d后建立起悬浮培养系。悬浮培养过程中对各悬浮系称重发现，不同悬浮系的增殖速度不同，结果如图2所示。悬浮物在前7d都有一个生长延滞期，之后悬浮物增殖速度逐渐加快，在14-28d达到对数期，此时营养和悬浮物生长环境比较适宜。此后生长较稳定，但需要更换新鲜的培养液。从图2中还可看出，来源于叶片的悬浮物增速最明显，悬浮培养28d后，鲜重增至4.25g。

3、EMS诱变

配置体积百分比浓度分别为0.2％、0.4％、0.6％、0.8％的EMS溶液，以不加EMS的无菌水为对照，选择生长基本一致的香石竹细胞团浸泡于各浓度的EMS溶液中分别处理1h、2h、4h、6h，处理完后用无菌水冲洗3遍，然后转接到继代培养基中继续培养，20d后观察细胞团的存活状态并统计存活率。

在相同EMS浓度处理下，细胞团随着处理时间的增加存活的比率降低；在同一处理时间下，细胞团随着EMS浓度增加存活的比率也在降低。用EMS处理1h时，对细胞团的杀伤力较弱，生理损伤不严重，没有致迟效应，各EMS浓度处理对胚性细胞团的伤害效果差别不显著，存活率都在60％以上。但随着处理时间的延长，存活率呈下降趋势，当处理时间为6h时，各处理浓度的胚性细胞团都变褐且存活率极低。最终根据对细胞团处理的50％致死剂量确定细胞团的EMS最佳处理组合为0.4％处理4h。

表2香石竹细胞团经过EMS处理后的存活率(％)

注：同一列中不同小写字母为使用Duncan多重范围检测在0.05水平差异显著性。

4、尖孢镰刀菌毒素的制备

将马铃薯蔗糖培养基上的尖孢镰刀菌落切成约5mm×5mm的方块，接种于装有150ml马铃薯蔗糖培养液的三角瓶中，每瓶3块，置于控温摇床上，振荡培养15d。摇床转速120rpm，温度25℃。待菌丝体长出，且营养液由混浊变为澄清时，用双层纱布过滤掉菌丝和孢子，滤液300rpm离心20min后，去沉淀，上清液煮沸15min，冷却后，用细菌过滤器过滤灭菌，即得到无菌毒素粗提液(台莲梅等，2005)。

5、尖孢镰刀菌毒素筛选压的确定

分别配制含体积分数20％、40％、60％、80％的毒素粗提液的毒素选择培养基(MS+BA 0.8mg·L

由表3可看出，毒素对香石竹愈伤组织的生长均表现抑制作用。随着毒素体积分数的提高，愈伤组织存活率降低，抑制效果愈明显。80％毒素粗提液体积分数下，愈伤组织的存活率为23.67％。从愈伤组织表现状态上看，10d时，80％毒素粗提液处理的愈伤组织松散，褐化死亡，只有极少数存活，因此，80％毒素体积分数处理10d可视为大部分细胞生长的1个拐点，在抗尖孢镰刀菌无性系筛选试验中，80％毒素就是临界致死浓度，可使用含80％毒素的培养基作为毒素选择培养基。

表3粗毒素胁迫对香石竹愈伤组织存活率和想对生长量的影响

注：同一列中不同小写字母为使用Duncan多重范围检测在0.05水平差异显著性。

6、尖孢镰刀菌毒素加压筛选

将香石竹多头品种“紫蝴蝶”经EMS诱变的悬浮培养细胞团接种于毒素液体选择培养基上，10d后将存活的细胞团转入未添加毒素的液体悬浮继代培养基上培养10d，再转入毒素液体选择培养基进行筛选，如此反复筛选3次。将最终存活的细胞团转入再生培养基中诱导分化，30d后统计分化率。不同的再生培养基配方为1、MS+BA 1.0mg·L

采用一步选择法经尖孢镰刀菌粗毒素筛选后，120个香石竹多头品种“紫蝴蝶”的细胞团有13个存活，存活率为10.83％，其中又有3个分化出了不定芽，分化率为23.08％，突变率为2.5％。以上结果表明，经毒素处理过的细胞已经发生突变，并且部分抗镰刀菌毒素的突变基因得到表达，从而使细胞团能在镰刀菌毒素的临界致死浓度下生存下来。

为提高抗尖孢镰刀菌无性系的再生能力及繁殖系数，采用了不同的激素组合培养分化出来的不定芽，结果发现再生植株生长较好的激素组合是BA 0.5mg·L

表4不同激素组合对香石竹细胞团加压筛选后再生率的影响

注：同一列中不同小写字母为使用Duncan多重范围检测在0.05水平差异显著性。

7、抗尖孢镰刀菌无性系再生苗的抗病性鉴定

对香石竹多头品种“紫蝴蝶”的组培小苗和筛选出来的抗病再生苗人工接种香石竹枯萎病菌孢子悬浮液(孢子1×10

本方法将经EMS诱变后的香石竹多头品种‘紫蝴蝶’的细胞团接种在含临界致死浓度镰刀菌毒素粗提液的培养基上，反复筛选最终得到了抗尖孢镰刀菌无性系植株。利用真菌毒素作为选择剂，必须注意适宜的筛选浓度和筛选周期，同时在起始筛选时，必须有较大的供选群体。采用“适量”毒素浓度是抗病筛选的关键，浓度过高，不易得到数量较多的愈伤组织或细胞；浓度过低，不易筛选出抗性材料。

最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。