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人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体在治疗和/或预防糖尿病中的应用

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本发明公开了人工脂蛋白颗粒apoA‑Ⅳ脂肪体在治疗和/或预防糖尿病中的应用。本发明公开的人工脂蛋白颗粒apoA‑Ⅳ脂肪体由脂肪体招募载脂蛋白apoA‑Ⅳ得到。本发明的人工脂蛋白颗粒apoA‑Ⅳ脂肪体可以显著地提高动物的糖耐受水平，并且该颗粒效果的显著性高于游离蛋白apoA‑Ⅳ，效果更好。因此，本发明的人工脂蛋白颗粒apoA‑Ⅳ脂肪体及其制备方法，在治疗和/或预防动物糖尿病、提高动物糖耐受水平以及食品、医疗中具有广阔且巨大的应用前景。

著录项

公开/公告号CN112546201A

专利类型发明专利
公开/公告日2021-03-26

原文格式PDF
申请/专利权人中国科学院生物物理研究所;
展开▼

申请/专利号CN201910916045.6
发明设计人刘平生;曹震;周畅;徐式孟;
展开▼

申请日2019-09-26
分类号A61K38/17(20060101);A61K9/16(20060101);A61K47/24(20060101);A61P3/10(20060101);C07K14/775(20060101);C12N15/12(20060101);
代理机构11245 北京纪凯知识产权代理有限公司;
代理人魏少伟
地址 100101 北京市朝阳区大屯路15号
入库时间 2023-06-19 10:25:58

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体在治疗和/或预防糖尿病中的应用。

背景技术

人类体内存在两类由单层磷脂膜包裹中性脂的结构，一类是广泛存在于动物、植物、微生物的脂滴，它是一种细胞器，由中性脂质核心，单层磷脂膜与相关蛋白组成。许多人类的疾病，特别是脂肪肝、动脉粥样硬化、糖尿病等代谢性疾病，与脂滴的形成和动态变化息息相关。另一类是主要存在于血液和细胞外液中运输疏水性脂质的脂蛋白颗粒，不同的脂蛋白颗粒表面有不同的载脂蛋白，脂蛋白颗粒的种类和比例对人体健康有着非常重要的影响，它们与脂肪肝、动脉粥样硬化、糖尿病等代谢性疾病密切相关。虽然脂蛋白颗粒与脂滴的结构非常类似，但二者在体内的分布不同，表面的蛋白质种类不同：脂滴存在于细胞中，而脂蛋白颗粒主要存在于血液中；脂滴上的主要蛋白为脂滴固有/结构蛋白，而脂蛋白颗粒上的主要蛋白为载脂蛋白。其中，载脂蛋白Apolipoprotein A-IV(apoA-Ⅳ)是载脂蛋白家族A中的一员，主要在小肠中表达和分泌，在血液中主要以乳糜微粒(Chylomicron，CM)，高密度脂蛋白(High Density Lipoprotein，HDL)，低密度脂蛋白(Low DensityLipoprotein，LDL)形式存在于血清中。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何开发安全有效的药物用于治疗和/或预防动物糖尿病和提高动物糖耐受水平。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体在制备治疗和/或预防糖尿病产品或制备提高糖耐受水平产品中的应用；

所述脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体由脂肪体招募载脂蛋白apoA-Ⅳ得到。

上述应用中，所述载脂蛋白apoA-Ⅳ可为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；

A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

A3)所述蛋白质具体可为序列表中序列3或序列5所示的蛋白质。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

上述A2)中的蛋白质，为与序列2所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述A2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列1所示的DNA分子编码序列2所示的蛋白质。

所述载脂蛋白apoA-Ⅳ可由原核细胞或真核细胞表达得到。所述原核细胞可为病毒，细菌，所述真核细胞可为酵母细胞，昆虫细胞，哺乳动物细胞。

上述应用中，所述脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体可由脂肪体招募载脂蛋白apoA-Ⅳ得到。

上述应用中，所述糖尿病可为哺乳动物糖尿病，所述糖耐受水平可为哺乳动物糖耐受水平。在本发明的一个实施例中，所述哺乳动物为C57BL/6J小鼠。

所述脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体，也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了所述脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体的制备方法，所述方法包括：由脂肪体招募载脂蛋白apoA-Ⅳ得到所述脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体。

本发明还提供了一种成套试剂，所述成套试剂可由脂肪体和载脂蛋白apoA-Ⅳ组成，或由脂肪体和与载脂蛋白apoA-Ⅳ相关的生物材料组成；

所述生物材料为下述B1)至B4)中的任一种：

B1)编码载脂蛋白apoA-Ⅳ的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物。

上述成套试剂中，B1)所述核酸分子可为如下b11)或b12)或b13)或b14)：

b11)编码序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；

b12)序列表中序列1所示的DNA分子；

b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码载脂蛋白apoA-Ⅳ的cDNA分子或DNA分子；

b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码载脂蛋白apoA-Ⅳ的cDNA分子或DNA分子。

所述成套试剂可用于制备脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体，或制备治疗和/或预防糖尿病产品，或制备提高糖耐受水平产品。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码载脂蛋白apoA-Ⅳ的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的载脂蛋白apoA-Ⅳ的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码载脂蛋白apoA-Ⅳ且具有载脂蛋白apoA-Ⅳ功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述成套试剂中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述成套试剂中，B2)所述的含有编码载脂蛋白apoA-Ⅳ的核酸分子的表达盒(载脂蛋白apoA-Ⅳ基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达载脂蛋白apoA-Ⅳ的DNA，该DNA不但可包括启动载脂蛋白apoA-Ⅳ基因转录的启动子，还可包括终止载脂蛋白apoA-Ⅳ基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

可用现有的表达载体构建含有所述载脂蛋白apoA-Ⅳ基因表达盒的重组载体。

上述成套试剂中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为载体pET28a-SMT3。

B3)所述重组载体具体可为pET28a-SMT3-apoA-Ⅳ。所述pET28a-SMT3-apoA-Ⅳ为将载体pET28a-SMT3载体的BamHⅠ和HindⅢ识别序列间的DNA片段替换为序列1所示的DNA片段得到的重组载体。

上述成套试剂中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为大肠杆菌，如大肠杆菌E.coli Rosetta。

所述成套试剂在制备治疗和/或预防糖尿病产品或制备提高糖耐受水平产品中的应用，也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述糖尿病可为哺乳动物糖尿病，所述糖耐受水平可为哺乳动物糖耐受水平。所述哺乳动物可为人或小鼠。在本发明的一个实施例中，所述哺乳动物为C57BL/6J小鼠。

上文中，所述脂肪体可按照包括如下步骤的方法制备：

a1)将磷脂和中性脂质在缓冲液中进行涡旋以实现两者的反应，然后进行离心，收集上层液相，从上层液相中分离得到脂肪体。

所述“从上层液相中分离得到脂肪体”可包括如下步骤：

a2)将所述上层液相进行两次以上的纯化；每次纯化的方法可为：将上层液相与所述缓冲液混匀，然后使其分层，收集上层液相；

a3)将步骤a2)得到的上层液相与所述缓冲液混合，然后使其分层，收集下层液相，其中含有脂肪体。

所述缓冲液可为缓冲液B。

所述缓冲液B的溶质及其在缓冲液中浓度可为：15mM～25mM HEPES，80mM～120mMKCl，1.5～2.5mM的MgCl

所述缓冲液B的溶质及其在缓冲液中浓度具体可为：20mM HEPES，100mM KCl，2mM的MgCl

所述步骤a1)中，所述涡旋的参数可为：总时长为3～5min；

所述步骤a1)中，所述离心的参数可为：18000～22000g、3～7min。

所述步骤a1)中，所述涡旋的参数具体可为：总时长4min。

所述步骤a1)中，所述离心的参数具体可为：20000g、5min。

所述步骤a2)中，所述“上层液相进行两次以上的纯化”中的次数以上层液相与所述缓冲液混匀，分层后无沉淀为准。

所述步骤a2)中，所述“使其分层”是通过离心实现的，所述离心的参数可为：18000～22000g、3～7min。

所述步骤a2)中，所述“使其分层”是通过离心实现的，所述离心的参数具体可为：20000g、5min。

所述步骤a3)中，所述“使其分层”是通过离心实现的，所述离心的参数可为：800～1200g、3～7min。

所述步骤a3)中，所述“使其分层”是通过离心实现的，所述离心的参数具体可为：1000g、5min。

所述磷脂为b1)、b2)或b3)：

b1)1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)；

b2)1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)和1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)；

b3)1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)和1，2-二-十八碳烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。

所述中性脂质为c1)或c2)：

c1)甘油三酯；

c2)胆固醇油酸酯(cholesteryl oleate,CO)和甘油三酯。

所述b2)中，1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱和1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油-3磷酸乙醇胺的质量比可为1:0.01～2；

所述b3)中，1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱和1，2-二-十八碳烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱的质量比可为1:0.01～2；

所述c2)中，甘油三酯和胆固醇油酸酯的质量比可为1～5：1。

所述b2)中，1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱和1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺的质量比具体可为2:1、1:1或1:2；

所述b3)中，1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱和1，2-二-十八碳烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱的质量比具体可为2:1、1:1或1:2；

所述c2)中，甘油三酯和胆固醇油酸酯的质量比具体可为5:1、4:1、3:1或2:1。

所述甘油三酯(triacylglycerol，TAG)的制备方法可如下：(1)取死亡的SD大鼠1只，取皮下脂肪与大网膜脂肪，剪碎；(2)将步骤(1)得到的碎组织置于离心管中，加入萃脂液甲(氯仿：去离子水＝1：1，v/v)，剧烈涡旋1分钟，然后8000g离心10分钟；(3)取步骤(2)得到的下层有机相，置于新的离心管中，如果发现其浑浊的话按照步骤(2)中的萃取方法进行重复萃取直至其澄清；(4)取步骤(3)得到的下层有机相，在高纯氮下吹干(若吹干过程中发现其变浑浊的话则按照步骤(2)中的萃取方法进行重复萃取)；(5)取步骤(4)得到的下层有机相，在高纯氮下吹干(连续3次称重质量不变)，产物即为甘油三酯。

所述甘油三酯可为甘油三油酸酯(triolein，TO)。

所述甘油三油酸酯(triolein,TO)具体可为Sigma公司的产品，产品目录号为92860。

所述磷脂和所述中性脂质的质量比可为(d1)至(d6)中的任一种：

(d1)0.25～3:5；

(d2)3:5；

(d3)2:5；

(d4)1:5；

(d5)1:10；

(d6)1:20。

本发明中，所述产品可为药物。

本发明利用人工构建的脂肪体作为一种新的纳米药物载体，携带载脂蛋白apoA-Ⅳ，所形成的人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体具有显著优势：(1)载脂蛋白apoA-Ⅳ在体内主要以脂蛋白颗粒的形式存在，因此人工构建的该颗粒可以有效模拟体内脂蛋白颗粒，更接近生理状态，更安全有效。(2)外源给予脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体，可以显著地提高动物的糖耐受水平，并且该颗粒效果的显著性高于游离蛋白apoA-Ⅳ，效果更好。因此，本发明的人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体及其制备方法，在治疗和/或预防动物糖尿病、提高动物糖耐受水平以及食品、医疗中具有广阔且巨大的应用前景。

附图说明

图1为载体构建示意图。

图2为原核系统来源的重组蛋白apoA-Ⅳ的鉴定结果。a是银染结果，b是Westernblot结果。

图3为真核系统来源的带有His标签的重组蛋白apoA-Ⅳ的鉴定结果。a是R250染色结果，b是WB结果。泳道1是商业化的BSA标准品，泳道2是纯化的还原后的重组蛋白apoA-Ⅳ，泳道3是纯化的非还原后的重组蛋白apoA-Ⅳ。

图4为脂肪体的检测。

A：脂肪体的形态，上图是微分干涉相衬光学显微镜结果，下图是荧光显微镜结果，比例尺是1μm。

B：脂肪体的尺寸，上图是脂肪体尺寸的分布，下图是脂肪体的大小。

C：脂肪体的脂质组成。

图5为人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体构建的检测结果。

A：蛋白与脂肪体孵育后的银染结果。各泳道从左至右依次为蛋白质分子量标准，HIS-SMT3-GFP蛋白，上层脂肪体2，下层溶液2，HIS-SMT3-apoA-Ⅳ-GFP蛋白，上层脂肪体1，下层溶液1。

B：蛋白与脂肪体孵育后所得脂肪体的荧光显微镜结果。a1-a3是HIS-SMT3-GFP和脂肪体孵育的结果，b1-b3是HIS-SMT3-apoA-Ⅳ-GFP和脂肪体孵育的结果，b2白色箭头所示是HIS-SMT3-apoA-Ⅳ-GFP形成的圆圈，比例尺是1μm，a3与b3左下角实线白色方框是虚线白框所处放大的图片。

C：不同浓度HIS-SMT3-apoA-Ⅳ-GFP与脂肪体孵育后所得脂肪体的银染结果。泳道1，2，3，4，5，6分别是0.02，0.05，0.1，0.2，0.3，0.5μg/μl的HIS-SMT3-apoA-Ⅳ-GFP。上图为不同浓度蛋白分别和同等量脂肪体孵育的银染结果，下图为不同浓度蛋白分别和同等量脂肪体孵育后对应的WB结果,所用一抗为Anti-His antiboby(Imagen Biosciences公司)，二抗为山羊抗小鼠IgG/辣根过氧化物酶(中杉金桥公司)。

图6为人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体特性分析。a：银染分析招募到脂肪体上apoA-Ⅳ的浓度，箭头所示为人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体，溶液是没有被招募到脂肪体上游离的apoA-Ⅳ蛋白。b：SDS-PAGE(变性胶)分析单独的脂肪体(adiposome)、游离的apoA-Ⅳ和人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体上的apoA-Ⅳ，上图为银染结果，下图为WB结果。c：Native-PAGE(非变性胶)分析单独的脂肪体(adiposome)、游离的apoA-Ⅳ和人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体上的apoA-Ⅳ，上图为银染结果，下图为WB结果。所用apoA-Ⅳ蛋白为游离的不带任何标签的原核系统来源的apoA-Ⅳ蛋白，即apoA-Ⅳ(B)。

图7人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体显著地提高小鼠糖耐受水平。图A为原核来源的apoA-Ⅳ(B)构建的人工纳米脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ(B)脂肪体显著提高小鼠糖耐受水平。a：银染分析招募到脂肪体上apoA-Ⅳ(B)的浓度：0.7μg/10μl，泳道1，2，3，4是未结合脂肪体的apoA-Ⅳ蛋白，浓度分别是0.125，0.25，0.5，1μg/10μl，箭头所示为人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ(B)脂肪体，溶液是没有被招募到脂肪体上游离的apoA-Ⅳ(B)。b：注射葡萄糖后不同时间点的血糖值，c：注射不同样品后的葡萄糖曲线下面积。每组3只小鼠，注射的样品分别是100μlSaline，100μl apoA-Ⅳ(B)(终浓度为0.5mg/kg),100μl脂肪体，100μl apoA-Ⅳ(B)脂肪体(终浓度为0.5mg/kg，以apoA-Ⅳ(B)计)。图B为真核来源的apoA-Ⅳ(C)构建的人工纳米脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ(C)脂肪体显著提高小鼠糖耐受水平。a：银染分析招募到脂肪体上apoA-Ⅳ(C)的浓度：0.8μg/10μl，泳道1，2，3，4是未结合脂肪体的apoA-Ⅳ蛋白，浓度分别是0，0.125，0.25，0.5，1，2μg/10μl，箭头所示为人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ(C)脂肪体，溶液是没有被招募到脂肪体上游离的apoA-Ⅳ(C)。b：注射葡萄糖后不同时间点的血糖值，c：注射不同样品后的葡萄糖曲线下面积。每组4只小鼠，注射的样品分别是100μl Saline，100μl apoA-Ⅳ(C)(终浓度为0.5mg/kg，以apoA-Ⅳ(C)计),100μl脂肪体，100μl apoA-Ⅳ(C)脂肪体(终浓度为0.5mg/kg)。统计分析，数据显示是Means±SEM，两组显著性分析是Student’s t-test(two-tailed)。*表示P≤0.05，**表示P≤0.01。所用apoA-Ⅳ蛋白为游离的不带任何标签的原核系统来源的apoA-Ⅳ蛋白，即apoA-Ⅳ(B)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

载体pET28a为Novagen公司产品，载体pET28a-SMT3在载体pET28a基础上改造得到。载体pET28a-SMT3和蛋白Ulp1获得的具体方法如文献所述：Hu et al.,Resonanceassignments for the substrate binding domain of Hsp70 chaperone Ssa1 fromSaccharomyces cerevisiae，Biomol NMR Assign.2015Oct；9(2):329-32(https://doi.org/10.1007/s12104-015-9603-5)。载体pET28a-SMT3在该文献中描述为pET28aplasmid containing an N-terminal 6XHis tag and a SUMO tag。

大肠杆菌E.coli Rosetta为TIANGEN公司产品。

缓冲液A配方：500mM Tris,1.5M氯化钠,40％甘油(v/v)，加盐酸调PH至7.8。

2xSample Buffer配方：100mM Tris，8％SDS(m/v)，20％甘油(v/v)，0.2％溴酚蓝(m/v)，200mM DTT。

40mM的咪唑为向缓冲液A中添加咪唑得到的咪唑浓度为40mM的溶液。

500mM的咪唑为向缓冲液A中添加咪唑得到的咪唑浓度为500mM的溶液。

JG-1A高压细胞破碎仪为广州聚能生物科技有限公司产品。

螯合有镍离子的Chelating Sepharose Fast Flow为GE Healthcare公司产品，柱子为Thermo公司产品。

2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)为Avanti公司的产品。

缓冲液B配方：20mM HEPES，100mM氯化钾，2mM氯化镁，加盐酸调PH至7.4。

C57BL/6J小鼠：北京维通利华实验动物技术有限公司。

血糖测量仪和血糖试纸：罗氏公司。

生理盐水(Saline)：国药集团化学试剂有限公司。

葡萄糖，异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，咪唑，DTT，SDS，溴酚蓝，生理盐水(Saline)，氯化钠，甘油：国药集团化学试剂有限公司。

HEPES，甘油三酯(TAG)：Sigma-Aldrich公司。LipidTox Green和LipidTox Red：Invitrogen公司。

OptimaTM MAX型超速离心机为Beckman公司产品,FV1000激光共聚焦显微镜为Olympus公司产品，动态光散射仪为Beckman公司产品。

实施例1、载脂蛋白apoA-Ⅳ(apoA4)的制备

一)原核系统来源的重组蛋白apoA-Ⅳ的制备

1.载体构建

将载体pET28a-SMT3的限制性核酸内切酶BamHⅠ和HindⅢ识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列1所示的apoA-Ⅳ基因，得到重组载体，将得到的序列正确的重组载体记为pET28a-SMT3-apoA-Ⅳ，pET28a-SMT3-apoA-Ⅳ能表达apoA-Ⅳ蛋白(氨基酸序列为序列表中序列2)与SMT3、6×His形成的融合蛋白质，将该融合蛋白记为HIS-SMT3-apoA-Ⅳ，HIS-SMT3-apoA-Ⅳ的表达由T7启动子驱动。

载体构建示意图见图1,虚线矩形框标记的是插入的apoA-Ⅳ基因序列。

2.蛋白纯化

将构建完成的重组载体pET28a-SMT3-apoA-Ⅳ导入大肠杆菌E.coli Rosetta中得到重组菌，将得到的重组菌记为E-pET28a-SMT3-apoA-Ⅳ。

将E-pET28a-SMT3-apoA-Ⅳ接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，放至37℃，200rpm摇床中进行培养，当菌液浓度达到OD600＝0.6时，向培养体系中加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，使IPTG在培养体系中的终浓度为0.4mM，然后将培养体系于16℃下诱导培养24h。收集诱导培养菌液，用缓冲液A重悬菌液，然后用JG-1A高压细胞破碎仪进行破碎得到细菌裂解液，将得到的细胞裂解液进行超速离心，离心条件为30000g，60min，收集上清液。取50μl上清液加入等体积的2xSample Buffer，将得到的混合液作为样品1(上清组分)。将剩余上清液与螯合有镍离子的填料Chelating Sepharose Fast Flow进行孵育，4℃孵育2h后转移至4ml的柱子，收集流川的液体(即流川液)，取50μl流川液加入等体积的2xSampleBuffer，将得到的混合液作为样品2(流川组分)。先用40mM的咪唑重悬柱子中的填料清洗非特异性条带，收集流出的清洗液，取50μl清洗液加入等体积的2xSample Buffer，将得到的混合液作为样品3(40mM组分)。再用500mM的咪唑重悬柱子中的填料洗脱目的蛋白，收集流出的洗脱液，取50μl洗脱液加入等体积的2xSample Buffer，将得到的混合液作为样品4(500mM组分)。最后，另取洗脱液向其中加入Ulp1，用于酶切目的蛋白氮端的SMT3标签，并将酶切产物再次加入柱子中进行反挂去除SMT3标签，收集流出液即获得重组蛋白apoA-Ⅳ溶液。取50μl重组蛋白apoA-Ⅳ溶液加入2xSample Buffer，将得到的混合液作为样品5(apoA-Ⅳ组分)。将上述样品1-5利用SDS-PAGE分析，然后进行银染和免疫印迹(Westernblot，WB)分析鉴定。Westernblot所用一抗为一抗为Anti-His antiboby(Imagen Biosciences公司)，二抗为山羊抗小鼠IgG/辣根过氧化物酶(中杉金桥公司)。

结果见图2,图a是银染结果，图b是WB结果。样品1，2所处泳道中有许多非特异性条带，并且目的融合蛋白主要在样品1中，样品3，4所处泳道在72kDa分子量的位置富集目的融合蛋白，样品5所处泳道在45kDa分子量的位置富集酶切去掉SMT3标签的重组蛋白apoA-Ⅳ。结果表明，通过上述方法成功获得了原核系统来源的重组蛋白apoA-Ⅳ,将其简称为apoA-Ⅳ(B)。

二)真核系统来源的重组蛋白apoA-Ⅳ的制备

委托德泰生物科技(南京)有限公司利用HEK293细胞获得真核系统来源的纯化的带有His标签的重组蛋白apoA-Ⅳ(其氨基酸序列为序列表中序列3)，所用apoA-Ⅳ基因序列为序列表中序列1。结果见图3，图a是R250染色结果，图b是Westernblot结果。Westernblot所用一抗为Anti-His antiboby(Imagen Biosciences公司)，二抗为山羊抗小鼠IgG/辣根过氧化物酶(中杉金桥公司)。泳道1是商业化的牛血清白蛋白(BSA)标准品，泳道2是纯化的还原后的重组蛋白apoA-Ⅳ，泳道3是纯化的非还原后的重组蛋白apoA-Ⅳ。结果表明，成功获得了真核系统来源的带有His标签的重组蛋白apoA-Ⅳ，并且纯度达到90％以上，将其简称为apoA-Ⅳ(C)。

实施例2、人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体的制备

一、脂肪体的制备

利用涡旋和两步法离心制备脂肪体，步骤如下：

(1)取80μl 2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱溶液(含有2mg DOPC)加入到微量离心管中，用高纯氮气吹干溶剂。

(2)完成步骤(1)后，向微量离心管中加入100μl缓冲液B和5mg甘油三酯(TAG)，涡旋4min(涡旋10s，停止10s)，得到乳白色的脂质混合物1(即初始制备组分)，将该脂质混合物1以20000g离心5min(实际应用中18000-22000g离心3-7min均可)。离心后，微量离心管中底部为沉淀组分1，液相体系呈现两层分层(上层为白色带1，白色带1以下的部分为溶液1)。

(3)完成步骤(2)后，通过抽取的方式弃除溶液1与沉淀组分1，保留白色带1，加入100μl缓冲液B，涡旋，得到乳白色的脂质混合物2。

(4)将步骤(3)得到的脂质混合物2涡旋混匀，1000g离心5min(实际应用中800-1200g离心3-7min均可)，离心后，液相体系呈现两层分层(上层为白色带2，白色带2以下的部分为溶液2)，收集溶液2，即为脂肪体。

通过FV1000激光共聚焦显微观察脂肪体结构，动态光散射仪测定脂肪体的尺寸，薄层层析分析分析脂肪体的脂质组成。结果见图4，图A是脂肪体的形态，左图是FV1000激光共聚焦显微镜结果，右图是微分干涉相衬光学显微镜结果，比例尺是5μm，绿色所示是构建的脂肪体，由中性脂特异性染料LipidTox Green着色。图B是脂肪体的尺寸，上图是脂肪体尺寸的分布，下图是脂肪体的大小，脂肪体的平均大小在150.6nm左右。图C是脂肪体的脂质组成，由TAG和DOPC组成。

二、人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体的构建

1、HIS-SMT3-apoA-Ⅳ-GFP的制备

将载体pET28a-SMT3的限制性核酸内切酶BamHⅠ和HindⅢ识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列4所示的DNA片段(即apoA-Ⅳ与GFP的融合基因)，将得到的重组载体记为pET28a-SMT3-apoA-Ⅳ-GFP，pET28a-SMT3-apoA-Ⅳ-GFP能表达apoA-Ⅳ与GFP、SMT3、6×His形成的融合蛋白质，将该融合蛋白记为HIS-SMT3-apoA-Ⅳ-GFP。该融合蛋白质中自apoA-Ⅳ至GFP的氨基酸序列为序列表中序列5。

按照实施例1中步骤一中2的方法，将重组载体pET28a-SMT3-apoA-Ⅳ替换为pET28a-SMT3-apoA-Ⅳ-GFP，所用蛋白未进行Ulp1酶切，含有标签，其他步骤均不变，进行蛋白的表达纯化制备带有6×His和SMT3标签的融合蛋白质HIS-SMT3-apoA-Ⅳ-GFP。

2、HIS-SMT3-GFP的制备

将载体pET28a-SMT3的限制性核酸内切酶BamHⅠ和HindⅢ识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列4的第1147-1866位所示的GFP基因，将得到的重组载体记为pET28a-SMT3-GFP，pET28a-SMT3-GFP能表达GFP与SMT3、6×His形成的融合蛋白质，将该融合蛋白记为HIS-SMT3-GFP。该融合蛋白质中GFP的氨基酸序列为序列表中序列5的第383-621位。

按照实施例1中步骤一中2的方法，将重组载体pET28a-SMT3-apoA-Ⅳ替换为pET28a-SMT3-GFP，所用蛋白未进行Ulp1酶切，含有标签，其他步骤均不变，进行蛋白的表达纯化制备带有6×His和SMT3标签的融合蛋白质HIS-SMT3-GFP。

3、人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体的构建

取70μl步骤一制备好的脂肪体，向其中加入终浓度为0.3μg/μl的蛋白HIS-SMT3-apoA-Ⅳ-GFP得到混合体系，将其室温放置1小时，每隔10min，轻弹试管涡旋。然后清洗脂滴，共计三次，具体方法如下：将其20000g，室温离心5min，液相体系呈现两层分层(上层为脂肪体1)，抽去下层溶液1，保留上层，用100μl缓冲液B重悬上层脂肪体1，得到脂肪体悬液，即得到人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体。

按照上述方法，将HIS-SMT3-apoA-Ⅳ-GFP替换为HIS-SMT3-GFP，其他步骤均不变，得到人工脂蛋白颗粒GFP脂肪体。该过程中，液相体系的两层分别为上层脂肪体2，下层溶液2。

按照上述方法，将HIS-SMT3-apoA-Ⅳ-GFP分别替换为实施例1的apoA-Ⅳ(B)和apoA-Ⅳ(C)，其他步骤均不变，将得到人工脂蛋白颗粒分别记为人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ(B)脂肪体和人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ(C)脂肪体。该过程中，液相体系的两层分别为上层脂肪体2，下层溶液2。

之后分别取HIS-SMT3-apoA-Ⅳ-GFP蛋白，上层脂肪体1，下层溶液1，HIS-SMT3-GFP蛋白，上层脂肪体2，下层溶液2进行分析。

结果见图5，图A是HIS-SMT3-GFP和HIS-SMT3-apoA-Ⅳ-GFP与脂肪体孵育后的银染结果，蛋白HIS-SMT3-GFP与脂肪体孵育后的脂肪体组分(即上层脂肪体2)所处泳道没有条带，而蛋白HIS-SMT3-apoA-Ⅳ-GFP与脂肪体孵育后的脂肪体组分(即上层脂肪体1)所处泳道有明显的条带，表明蛋白HIS-SMT3-GFP不能被招募到脂肪体，而蛋白HIS-SMT3-apoA-Ⅳ-GFP可以特异性的被招募到脂肪体。

图B是HIS-SMT3-GFP和HIS-SMT3-apoA-Ⅳ-GFP与脂肪体孵育后所得脂肪体的荧光显微镜结果。图a1-a3是HIS-SMT3-GFP和脂肪体孵育所得脂肪体的结果，a1脂肪体被中性脂特异性染料LipidTox Red染成红色，a2中没有检测到GFP信号，a3是a1和a2融合的图，红色是构建的脂肪体。荧光显微镜结果进一步表明蛋白GFP不能被招募到脂肪体。图b1-b3是HIS-SMT3-apoA-Ⅳ-GFP和脂肪体孵育所得脂肪体的结果，b1是脂肪体的形态，b2是HIS-SMT3-apoA-Ⅳ-GFP的信号，白色箭头所示是HIS-SMT3-apoA-Ⅳ-GFP形成的圆圈，b3是b1和b2融合的图，左下角实线白色方框是虚线白框所处放大的图片，绿色荧光信号显示HIS-SMT3-apoA-Ⅳ-GFP可以很好的定位在红色信号脂肪体表面，进一步表明蛋白apoA-Ⅳ可以特异性的被招募到脂肪体。

上述结果表明，脂肪体可以特异性的招募载脂蛋白apoA-Ⅳ，其结构与天然的脂蛋白颗粒非常相似。

为了测量脂肪体结合HIS-SMT3-apoA-Ⅳ-GFP的饱和浓度，因此用不同浓度的HIS-SMT3-apoA-Ⅳ-GFP和相同量的脂肪体按照上述人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体制备方法进行实验，然后对得到的孵育后的脂肪体进行SDS-PAGE银染分析。

图C为不同浓度HIS-SMT3-apoA-Ⅳ-GFP与等体积且等量脂肪体(体积是70μl,浓度以OD600计算，OD600为3.4)孵育后所得脂肪体的银染结果。泳道1，2，3，4，5，6的反应体系中分别为0.02，0.05，0.1，0.2，0.3，0.5μg/μl的HIS-SMT3-apoA-Ⅳ-GFP，随着蛋白浓度的提升，泳道1，2，3，4出现的条带逐渐变粗，泳道5，6出现的条带粗细无明显变化，结果表明当蛋白浓度达到0.3μg/μl时，脂肪体招募HIS-SMT3-apoA-Ⅳ-GFP的浓度达到饱和。

4、人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体的特性和优势

检测人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体的特性，结果见图6。图a是步骤3得到的人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体中apoA-Ⅳ浓度的银染结果，泳道1，2，3，4，5，6，7是未结合脂肪体的apoA-Ⅳ蛋白(游离的不带任何标签的原核系统来源的apoA-Ⅳ蛋白，即apoA-Ⅳ(B))，浓度分别是0，0.0625，0.125，0.25，0.5，1，2μg/10μl，箭头所示是结合在脂肪体上的apoA-Ⅳ(即步骤3得到的人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体)，通过ImageJ和EXCEL软件分析，人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体所携带的apoA-Ⅳ量是1.2μg/10μl。

不同浓度apoA-Ⅳ蛋白的银染条带灰度如下：

根据上表的内容得到蛋白浓度与银染条带灰度的方程：y＝96748x+42715，人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体中apoA-Ⅳ的银染条带灰度为161247，根据上述方程得到人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体中apoA-Ⅳ蛋白浓度为1.2μg/10μl。

图b是脂肪体，apoA-Ⅳ(即apoA-Ⅳ(B))和人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体的SDS-PAGE(变性胶)的银染和Westernblot结果，只有apoA-Ⅳ和人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体组分所处泳道中只有单一条带。图c是脂肪体，apoA-Ⅳ和人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体的Native-PAGE(非变性胶)的银染和Westernblot结果，apoA-Ⅳ组分所处泳道出现两个条带，其中上面的条带是二聚体的apoA-Ⅳ，下面的条带是单体的apoA-Ⅳ，人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体组分所处泳道只有单一条带，并且是单体的apoA-Ⅳ。表明，脂肪体选择性地招募单体的apoA-Ⅳ。

Westernblot所用一抗为apoA-Ⅳ抗体(武汉云克隆科技股份有限公司)，二抗为山羊抗兔IgG/辣根过氧化物酶(中杉金桥公司)。

实施例3、人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体显著地提高小鼠糖耐受水平

检测实施例2得到的人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ(B)脂肪体和人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ(C)脂肪体在小鼠糖耐受中的作用，所用小鼠为C57BL/6J小鼠，13周龄。

首先将小鼠饥饿16h，然后分别尾静脉注射等体积的如下样品：生理盐水(Saline)100μl,实施例1的apoA-Ⅳ(B)注射量为0.5mg/kg体重，apoA-Ⅳ(C)的注射量为0.5mg/kg体重，实施例2步骤一得到的脂肪体100μl(OD600为3.4)，人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ(B)脂肪体(注射量以apoA-Ⅳ(B)计，为0.5mg/kg体重)，人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ(C)脂肪体(注射量以apoA-Ⅳ(C)计，为0.5mg/kg体重)。

注射上述样品半小时后，再分别腹腔注射150μl葡萄糖溶液(利用去离子水溶解葡萄糖)，注射量为2g葡萄糖/kg体重，然后用血糖测量仪分别测量葡萄糖注射0，15，30，60，120min后的血糖水平，检测和比较上述样品在改善小鼠糖耐受水平上的效果。

人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ(B)脂肪体上apoA-Ⅳ浓度的银染检测结果见图7中A，泳道1，2，3，4是未结合脂肪体的apoA-Ⅳ蛋白(游离的不带任何标签的原核系统来源的apoA-Ⅳ蛋白，即apoA-Ⅳ(B))，浓度分别是0.125，0.25，0.5，1μg/10μl，箭头所示是人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ(B)脂肪体，通过与实施例2步骤二中4同样的计算方法得到人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ(B)脂肪体所携带apoA-Ⅳ(B)浓度是0.7μg/10μl。

葡萄糖注射后不同时间点的血糖值见表1。

表1、葡萄糖注射后不同时间点的血糖检测结果(mM)

表1中，每种样品注射的小鼠均为3只，显著性分析中P值越小越显著。

结果表明，相对于生理盐水处理组，脂肪体处理组不能改善小鼠糖耐受水平，而游离蛋白apoA-Ⅳ(B)处理组和人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ(B)脂肪体处理组均可以显著地提高小鼠糖耐受水平，比较各组的曲线下面积，人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ(B)脂肪体处理组显著性更高(P＝0.0017)相对于游离蛋白apoA-Ⅳ(B)处理组(P＝0.0132)效果更好。

人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ(C)脂肪体上apoA-Ⅳ浓度的银染检测结果见图7中B，泳道1，2，3，4，5，6是未结合脂肪体的apoA-Ⅳ蛋白(游离的不带任何标签的原核系统来源的apoA-Ⅳ蛋白，即apoA-Ⅳ(B))，浓度分别是0，0.125，0.25，0.5，1，2μg/10μl，箭头所示是人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ(C)脂肪体，通过实施例2步骤二中4同样的计算方法得到人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ(C)脂肪体所携带的apoA-Ⅳ(C)浓度是0.8μg/10μl。

葡萄糖注射后不同时间点的血糖值见表2。

表2、葡萄糖注射后不同时间点的血糖检测结果(mM)

表2中，每种样品注射的小鼠均为4只，显著性分析中P值越小越显著。

结果表明，相对于生理盐水处理组，脂肪体处理组不能改善小鼠糖耐受水平，而游离蛋白apoA-Ⅳ(C)处理组和人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ(C)脂肪体处理组均可以显著地提高小鼠糖耐受水平，比较各组的曲线下面积，人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ(C)脂肪体处理组显著性更高(P＝0.0096)，相对于游离蛋白apoA-Ⅳ(C)处理组(P＝0.0288)，效果更好。

<110> 中国科学院生物物理研究所

<120> 人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体在治疗和/或预防糖尿病中的应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1146

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

gaggtcactt cggaccaggt ggccaatgtg gtgtgggatt actttaccca gctaagcaac 60

aatgccaagg aggctgtaga acagtttcag aagacggatg tcactcagca gctcagtacc 120

ctcttccagg acaaacttgg ggatgctagt acgtatgctg atggggtgca caacaagctg 180

gtgccctttg tcgtacagct gagtgggcat ctagcccagg aaactgagag ggtgaaggaa 240

gagatcaaga aggagctgga ggacctacgt gaccgcatga tgccccatgc caacaaagta 300

acccagacgt tcggggagaa catgcagaag ttgcaggagc acctgaagcc ctatgccgtg 360

gacctgcaag atcagatcaa cacacagacc caggaaatga agctccagct gaccccatac 420

atccagcgca tgcagaccac gatcaaggag aatgtggaca acctgcacac ctcgatgatg 480

ccccttgcca ccaacttaaa ggacaagttt aacaggaata tggaagagct caaggggcac 540

ctaacccccc gtgccaacga gctgaaggcc acgatcgacc agaacctgga ggatctgcgc 600

cgcagcctgg cccctctgac ggtgggcgtg caggagaaac tcaaccatca gatggagggc 660

ctggccttcc agatgaagaa gaacgcggag gagctccaga ccaaggtctc cgcaaaaatc 720

gaccagctgc agaagaatct ggccccgctg gtggaagacg tgcagagcaa ggtgaagggc 780

aacacggaag ggctgcagaa gtctctggaa gacctgaaca ggcagctgga gcagcaggtg 840

gaggagttcc gacgcactgt ggagcccatg ggagagatgt tcaacaaggc tctggtgcag 900

cagctggaac agttcagaca gcagctgggt cccaattcgg gggaggtgga aagccacttg 960

agcttcctgg agaagagcct gagggagaag gtcaactcct ttatgagcac cctggaaaaa 1020

aaggggagcc cagaccagcc tcaagccctc cccctcccgg agcaggccca ggagcaggct 1080

caggagcagg ctcaggagca ggtgcagccc aaacctctgg agagccatca tcatcatcat 1140

cactga 1146

<210> 2

<211> 375

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

Glu Val Thr Ser Asp Gln Val Ala Asn Val Val Trp Asp Tyr Phe Thr

1 5 10 15

Gln Leu Ser Asn Asn Ala Lys Glu Ala Val Glu Gln Phe Gln Lys Thr

20 25 30

Asp Val Thr Gln Gln Leu Ser Thr Leu Phe Gln Asp Lys Leu Gly Asp

35 40 45

Ala Ser Thr Tyr Ala Asp Gly Val His Asn Lys Leu Val Pro Phe Val

50 55 60

Val Gln Leu Ser Gly His Leu Ala Gln Glu Thr Glu Arg Val Lys Glu

65 70 75 80

Glu Ile Lys Lys Glu Leu Glu Asp Leu Arg Asp Arg Met Met Pro His

85 90 95

Ala Asn Lys Val Thr Gln Thr Phe Gly Glu Asn Met Gln Lys Leu Gln

100 105 110

Glu His Leu Lys Pro Tyr Ala Val Asp Leu Gln Asp Gln Ile Asn Thr

115 120 125

Gln Thr Gln Glu Met Lys Leu Gln Leu Thr Pro Tyr Ile Gln Arg Met

130 135 140

Gln Thr Thr Ile Lys Glu Asn Val Asp Asn Leu His Thr Ser Met Met

145 150 155 160

Pro Leu Ala Thr Asn Leu Lys Asp Lys Phe Asn Arg Asn Met Glu Glu

165 170 175

Leu Lys Gly His Leu Thr Pro Arg Ala Asn Glu Leu Lys Ala Thr Ile

180 185 190

Asp Gln Asn Leu Glu Asp Leu Arg Arg Ser Leu Ala Pro Leu Thr Val

195 200 205

Gly Val Gln Glu Lys Leu Asn His Gln Met Glu Gly Leu Ala Phe Gln

210 215 220

Met Lys Lys Asn Ala Glu Glu Leu Gln Thr Lys Val Ser Ala Lys Ile

225 230 235 240

Asp Gln Leu Gln Lys Asn Leu Ala Pro Leu Val Glu Asp Val Gln Ser

245 250 255

Lys Val Lys Gly Asn Thr Glu Gly Leu Gln Lys Ser Leu Glu Asp Leu

260 265 270

Asn Arg Gln Leu Glu Gln Gln Val Glu Glu Phe Arg Arg Thr Val Glu

275 280 285

Pro Met Gly Glu Met Phe Asn Lys Ala Leu Val Gln Gln Leu Glu Gln

290 295 300

Phe Arg Gln Gln Leu Gly Pro Asn Ser Gly Glu Val Glu Ser His Leu

305 310 315 320

Ser Phe Leu Glu Lys Ser Leu Arg Glu Lys Val Asn Ser Phe Met Ser

325 330 335

Thr Leu Glu Lys Lys Gly Ser Pro Asp Gln Pro Gln Ala Leu Pro Leu

340 345 350

Pro Glu Gln Ala Gln Glu Gln Ala Gln Glu Gln Ala Gln Glu Gln Val

355 360 365

Gln Pro Lys Pro Leu Glu Ser

370 375

<210> 3

<211> 381

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

Glu Val Thr Ser Asp Gln Val Ala Asn Val Val Trp Asp Tyr Phe Thr

1 5 10 15

Gln Leu Ser Asn Asn Ala Lys Glu Ala Val Glu Gln Phe Gln Lys Thr

20 25 30

Asp Val Thr Gln Gln Leu Ser Thr Leu Phe Gln Asp Lys Leu Gly Asp

35 40 45

Ala Ser Thr Tyr Ala Asp Gly Val His Asn Lys Leu Val Pro Phe Val

50 55 60

Val Gln Leu Ser Gly His Leu Ala Gln Glu Thr Glu Arg Val Lys Glu

65 70 75 80

Glu Ile Lys Lys Glu Leu Glu Asp Leu Arg Asp Arg Met Met Pro His

85 90 95

Ala Asn Lys Val Thr Gln Thr Phe Gly Glu Asn Met Gln Lys Leu Gln

100 105 110

Glu His Leu Lys Pro Tyr Ala Val Asp Leu Gln Asp Gln Ile Asn Thr

115 120 125

Gln Thr Gln Glu Met Lys Leu Gln Leu Thr Pro Tyr Ile Gln Arg Met

130 135 140

Gln Thr Thr Ile Lys Glu Asn Val Asp Asn Leu His Thr Ser Met Met

145 150 155 160

Pro Leu Ala Thr Asn Leu Lys Asp Lys Phe Asn Arg Asn Met Glu Glu

165 170 175

Leu Lys Gly His Leu Thr Pro Arg Ala Asn Glu Leu Lys Ala Thr Ile

180 185 190

Asp Gln Asn Leu Glu Asp Leu Arg Arg Ser Leu Ala Pro Leu Thr Val

195 200 205

Gly Val Gln Glu Lys Leu Asn His Gln Met Glu Gly Leu Ala Phe Gln

210 215 220

Met Lys Lys Asn Ala Glu Glu Leu Gln Thr Lys Val Ser Ala Lys Ile

225 230 235 240

Asp Gln Leu Gln Lys Asn Leu Ala Pro Leu Val Glu Asp Val Gln Ser

245 250 255

Lys Val Lys Gly Asn Thr Glu Gly Leu Gln Lys Ser Leu Glu Asp Leu

260 265 270

Asn Arg Gln Leu Glu Gln Gln Val Glu Glu Phe Arg Arg Thr Val Glu

275 280 285

Pro Met Gly Glu Met Phe Asn Lys Ala Leu Val Gln Gln Leu Glu Gln

290 295 300

Phe Arg Gln Gln Leu Gly Pro Asn Ser Gly Glu Val Glu Ser His Leu

305 310 315 320

Ser Phe Leu Glu Lys Ser Leu Arg Glu Lys Val Asn Ser Phe Met Ser

325 330 335

Thr Leu Glu Lys Lys Gly Ser Pro Asp Gln Pro Gln Ala Leu Pro Leu

340 345 350

Pro Glu Gln Ala Gln Glu Gln Ala Gln Glu Gln Ala Gln Glu Gln Val

355 360 365

Gln Pro Lys Pro Leu Glu Ser His His His His His His

370 375 380

<210> 4

<211> 1866

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4