一种制备新型冠状病毒疫苗的方法及针对其有效性的评价方法

摘要

本发明提供了一种制备新型冠状病毒疫苗的方法及针对其有效性的评价方法，所述新型冠状病毒疫苗为部分病毒膜裂解以暴露核衣壳N抗原的灭活疫苗，在制备时对疫苗毒株采取两次灭活处理，先用甲醛（HCHO）进行一次灭活，再用β丙内酯（BPL）进行二次灭活。针对新型冠状病毒疫苗的评价方法，利用包括中和抗体、Elisa抗体测定以及特异性CTL检测在内的多种检测方法，可以使疫苗的使用量更加精确，确保免疫效果的连续性和稳定性，为新冠疫苗大规模临床应用提供理论基础，也可为其他灭活疫苗抗原性的标准化提供依据。

说明书

技术领域

本发明属于疫苗技术领域，特别涉及一种制备新型冠状病毒疫苗的方法及针对其有效性的评价方法。

背景技术

新型冠状病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019, COVID-19）是由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2, SARS-CoV-2）引起的一种急性、高致病性传染病，人群对其普遍易感。目前，已在全球全面暴发，人类公共安全和生命健康正面临前所未有的挑战。基于目前的流行病学调查和确诊病例，该病起初具有一定的隐蔽性，潜伏期一般为1-14天，临床症状与流行性感冒类似，以发热、干咳、乏力为主要表现。重症患者多出现呼吸困难和/或低氧血症，严重者或出现急性呼吸窘迫综合征，进而出现多器官功能衰竭而死亡。

疫苗历来是预防传染性疾病最有效的方式之一，特别是对于新发、突发传染性疾病，在短时间内对其致病机理、治疗方法还不是很清楚的情况下，开发一种有效的疫苗是最经济、最有效控制传染病的方式。SARS-CoV-2作为一种新型冠状病毒，与其它SARS-CoV类似，编码多种结构蛋白和非结构蛋白，4种结构蛋白分别为刺突蛋白(Spike protein，S),包膜蛋白（Envelope，E），膜蛋白（Membrane，M）和核衣壳蛋白（Nucleocapsid，N）。SARS-CoV-2入侵机体首先要与细胞膜上的ACE2（Angiotensin Converting Enzyme，ACE2）受体结合，ACE2具有蛋白酶活性，可以切割和激活S蛋白，进而引导病毒和细胞膜融合，帮助病毒进入细胞。SARS-CoV-2在感染上皮细胞的过程中，病毒可能以病毒蛋白（如S、N、M、E）或其核酸分子结合的方式形成病原相关模式分子（PAMP），然后进一步结合并激活细胞内作为模式识别受体（PRR）和NF-ƙB为中心的转录体系，这些分子能够作用于从天然免疫反应到特异性免疫反应过程中的多个环节，包括非特异性炎性反应、抗原识别和递呈、免疫调节等，进而以不同的方式影响和干预机体的免疫系统。通常来讲，在机体面对病原感染时，这些紧密相连的环节能够共同协作形成一个整体而系统性的天然免疫反应，在以各种非特异方式控制病原对局部组织损伤的同时，通过抗原递呈和免疫分子调节进行获得性免疫反应的激活，通过特异性的中和抗体反应和细胞杀伤作用达到清除病原的目的。我们知道，病毒中和抗体的作用原理是特异性抗体与细胞受体的特异结合而阻断病毒进入细胞，从而避免病毒对细胞的病理损伤。但目前的恒河猴免疫保护实验来看，个别中和抗体水平较低的动物，在SARS-CoV-2野毒攻击感染时也具有保护作用。这一结果与临床研究的数据很类似，从常理推断，临床感染病人恢复期血清中病毒中和抗体水平因该维持在较高的水平，但实际情况是某些病人中中和抗体水平很低。

因此，如何对新型冠状病毒疫苗的免疫原性、安全性及保护效果进行全面、准确的评价，是急需解决的问题。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种制备新型冠状病毒疫苗的方法及针对其有效性的评价方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种制备新型冠状病毒疫苗的方法，其中，所述新型冠状病毒疫苗为部分病毒膜裂解以暴露核衣壳N抗原的灭活疫苗，在制备时对疫苗毒株采取两次灭活处理，先用甲醛（HCHO）进行一次灭活，以部分裂解病毒外膜以暴露病毒核衣壳结构蛋白，再用β丙内酯（BPL）针对病毒核酸进行二次灭活。

进一步的，甲醛的灭活处理时间为36~72小时，β丙内酯的灭活处理时间为12~36小时。

进一步的，所述甲醛采用体积浓度为100~300μg/ml的甲醛溶液。

本发明的另一方面：

一种针对新型冠状病毒疫苗有效性的评价方法，包括：

利用新型冠状病毒疫苗对受试动物在0天和第n天进行2次免疫，并在二次免疫后进行新冠病毒感染，n=5~10；

（1）病毒载量检测和病理分析：在感染后的第3, 5, 7, 9, 15分别处死1只受试动物进行病毒载量检测和病理分析；

（2）中和抗体及Elisa抗体测定：在感染后的不同时段采集上述受试动物的非抗凝血，分离血清后进行中和抗体及Elisa抗体检测；

（3）特异性CTL检测：在与中和抗体及Elisa抗体测定相应的时间点采集受试动物的外周抗凝血，进行特异性CTL检测。

进一步的，所述中和抗体的检测方法为：

将已知滴度的病毒样品10倍系列稀释至2×10

进一步的，所述特异性CTL检测的方法为：

采集的外周抗凝血分离外周血单个核细胞（PBMC）后，于含胎牛血清的培养液中低温暂时保存，对抗体预包被的ELISPOT板进行醒板，后将一定浓度的PBMC细胞加入板中，随后将抗原肽加入培养液中，随后于37℃，5% CO

本发明相比现有技术的有益效果为：

1、本发明所述制备新型冠状病毒疫苗的方法中，采取两次灭活的策略，先用甲醛溶液进行一次灭活，部分裂解病毒外膜以暴露病毒核衣壳结构蛋白，再用β丙内酯灭活，充分暴露了新冠病毒的S和N蛋白，进一步增强了灭活疫苗对机体的免疫反应，同时也保证了最终疫苗产品的安全性；

2、研究发现仅SARS-COV-2而言，单一的有效性评价指标并不适合，因此本发明所述针对新型冠状病毒疫苗有效性的评价方法，结合中和抗体、Elisa抗体测定，以及特异性CTL检测，可以使疫苗的使用量更加精确，确保免疫效果的连续性和稳定性，为新冠疫苗大规模临床应用提供理论基础，也可为其他灭活疫苗抗原性的标准化提供依据。

附图说明

图1为SARS-COV-2毒株KMS1抗原组成分析及验证结果图；

图2为不同灭活方法引起免疫反应比较结果图；

图3为恒河猴免疫实验方案示意图；

图4为恒河猴免疫灭活疫苗后中和抗体及特异性CTL反应结果图；

图5为恒河猴感染后不同组排毒情况结果图；

图6为恒河猴感染后不同组病毒载量和病理分析结果图。

具体实施方式

实施例1——灭活疫苗毒株KMS1的抗原组成及其特异性验证

本实施例所使用的SARS-CoV-2病毒分离自一例云南省传染病院住院病人COVID-19患者的呼吸道分泌物，转运至中国医学科学院医学生物学研究所P3实验室，该实验室已通过国家CNAS认可，并经国家卫生健康委批准从事SARS-CoV-2病原体操作工作。采集的样本接种于非洲绿猴肾细胞系（Vero）后3-5天，细胞出现典型的病变，使用SARS-CoV-2病毒基因组的5对特性引物经q-RT-PCR鉴定为SARS-CoV-2，再经蚀斑克隆纯化。然后经全基因序列测定，与已发表序列有＞99.9%的同源性，GenBank注册号为MT226610.1，命名为KMS1。

本实施例所用非洲绿猴肾细胞系（Vero）由中国医学科学院医学生物学研究所保存，使用含100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、10%新生牛血清的MEM培养基于5% CO

为了确定上述病毒分离株KMS1作为疫苗毒株的有效抗原性及抗原组成特征，以进一步了解这样一个毒株制备的灭活疫苗免疫抗体后，其免疫学反应表型的特征。本实施例首先利用SDS-PAGE电泳和相应Western-blot，确证了该毒株的抗原特性。

如图1所示的结果表明，该毒株纯化后电泳可以将其特征性的S蛋白和N蛋白分离，并为抗S蛋白和抗N蛋白的抗体所识别（图1A），在此基础上，我们利用2-D电泳和相应的Western-blot，对该毒株制备的灭活纯化抗原做了进一步的观察，从结果中我们可以看到，人恢复期血清对该病毒抗原的识别是多重的（图1B），而使用抗S和抗N抗体，则只分别识别其中的对应蛋白（图1A）。这一结果提示，在COVID-19病人的免疫反应中，事实上包括了多种抗病毒的抗体成分，其可能在抗病毒免疫反应中，均发挥了相应的作用。因此，我们对部分人恢复期血清的Elisa抗体检测中亦观察到，抗S抗体和抗N抗体均以接近的效价存在于血清中（图1C）。且这三种抗体之间存在着明显的相关关系，相关系数r分别为0.813（P<0.001）、0.866（P<0.001）和0.913（P<0.001）。

实施例2——新型冠状病毒疫苗制备中灭活策略与免疫原性关系分析

通过上述实施例1对KMS1抗原组成及验证分析，在灭活疫苗制备过程中要尽可能的是病毒蛋白，尤其是S和N暴露，以刺激机体更强烈的免疫反应。结合KMS1的病毒结构特点，灭活方法的选择在其中起着重要的作用。

在病毒灭活过程中，本实施例采取3种的不同的方法进行，200μg/ml甲醛（HCHO）和β丙内酯（BPL）分别直接灭活48h和24h，第3中方案是先HCHO灭活48h再用BPL灭活24h。

通过免疫电镜的方式，利用S和N特异性单克隆单体对如前过程灭活后抗原进行捕获，结果表明，直接用HCHO灭活，对病毒结构及S蛋白破坏较大。直接用BPL对病毒结构影响较小，但N蛋白暴露较少。两步灭活的方式能够充分暴露病毒的S和N蛋白，进一步增强灭活疫苗对机体的免疫反应（图2A）。对不同灭活方法制备的抗原免疫小鼠后进行中和抗体分析，无论是原倍还是按照不同稀释度，HCHO+BPL灭活方式所制备的抗原比单一灭活方法制备抗原引起的中和抗体都高（图2B）。ELISA检测（1:4-1:64）也表明，无论抗S、抗N还是全病毒抗原检测，HCHO+BPL灭活方式的数值都高于单一灭活方式。

因此，本实施例提供了一种制备新型冠状病毒疫苗的方法，在制备时对疫苗毒株采取两次灭活处理，先用HCHO溶液进行一次灭活48h，再用BPL进行二次灭活24h。

实施例3——新型冠状病毒疫苗有效性评价方法

本实施例选用的受试动物包括：

雌性BALB/c小鼠，无特定病原体级（Specific Pathogen Free, SPF），4周龄，10-15g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK（京）2016-0006-0006，按照实验动物标准饲养规程饲养。分别接种实施例2所述BPL、HCHO及BPL+HCHO灭活后的抗原，取血测定中和抗体及ELISA抗体。

恒河猴，6月龄，由中国医学科学院医学生物学研究所灵长类实验动物中心提供，实验动物许可证号：SYXK（滇）K2015-0006。实验方案如图3所示，实验共分为5组，疫苗免疫组分为200EU, 100EU, 20EU三个剂量，在0, 14天进行2次免疫。对照组为Al(OH)

本实施例提供了一种针对新型冠状病毒疫苗有效性的评价方法，包括：

利用新型冠状病毒疫苗对受试动物在0天和第n天进行2次免疫，并在二次免疫后进行新冠病毒感染，n=5~10；

（1）病毒载量检测和病理分析：在感染后的第3, 5, 7, 9, 15天分别处死1只受试动物进行病毒载量检测和病理分析；

（2）中和抗体及Elisa抗体测定：在感染后的不同时段采集上述小鼠或恒河猴的0.5mL非抗凝血，分离血清后进行中和抗体及Elisa抗体检测；

其中，中和抗体测定的具体操作为：将已知滴度的病毒样品10倍系列稀释至2×10

Elisa检测试剂盒购自北京义翘神州科技有限公司。酶标仪购自中国基因公司。按照试剂盒说明书对抗体预包被的ELISA板进行醒板，后将标准品、待检样本加入板中，同时设立阴性对照。然后按照试剂盒说明书对板子进行显色，酶标仪450nm处读取吸光度值；

（3）特异性CTL检测：在与中和抗体及Elisa抗体测定相应的时间点采集小鼠或恒河猴的外周抗凝血，进行特异性CTL检测；

采集到的小鼠或恒河猴外周抗凝血，分离PBMC后，于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中4℃暂时保存。按照试剂盒说明书对抗体预包被的ELISPOT板进行醒板，后将一定浓度的PBMC细胞加入板中。随后将抗原肽加入培养液中，随后于37℃，5% CO

从疫苗株KMS1的抗原分析及免疫血清识别、免疫电镜等各种检测来看，灭活疫苗免疫机体后，其结构蛋白S和N均能引起机体的免疫反应。基于这样的分析，本实施例选用恒河猴为模型进行后续的免疫学分析。为进一步明确免疫剂量及抗体水平和特异性CTL之间的关系。

本实施例分为3个剂量：200U、100U、20U，每组3只恒河猴，采取0, 14天的免疫程序，在二次免疫后的第7天，分别取恒河猴外周血进行中和抗体及特异性CTL反应检测。结果表明，中和抗体水平与免疫剂量呈正相关性。高、中、低剂量组，其GMT分别为107.6，25.4和2（图2A）。但从ELISA的检测结果来看，无论是针对全病毒、S或N抗原，其抗体效价并无统计学差异。从特异性CTL免疫反应分析，无论是S，还是N作为抗原刺激，二者激活的免疫反应也无明显差异。这些结果表明，针对S的中和抗体水平随免疫剂量的增加而逐渐升高，但这一指标仅是机体免疫反应一部分，N在特异性细胞免疫方面也发挥着重要的作用。

从图4所示的研究结果可以看出，灭活疫苗免疫恒河猴后可有效激活其体内的体液免疫和细胞免疫应答，为进一步评估其是否具有免疫保护性，在二次免疫后的第7天，对所有恒河猴通过鼻腔喷雾的方式进行病毒感染，感染的剂量为2×10

为进一步评估灭活疫苗对恒河猴的保护性，在攻毒后的第3, 5, 7, 9和15天每组分别处死1只，进行组织中病毒载量的检测及炎性损伤。图5所示的q-RT-PCR结果表明，免疫组恒河猴组织除了脾脏中有100拷贝/100mg外，其余组织均低于50拷贝/100mg，RBD组和佐剂对照组恒河猴在感染后的第9天和15天，在其脾脏、小肠及颈淋巴结均检测到了高拷贝数的病毒（10

SARS-COV-2的大流行已经导致数以万计的病例，开发一种安全、有效的疫苗显得尤其重要和迫切。在疫苗的研制过程中，首先要解决的科学问题是，疫苗中有效抗原成分及评价方法的问题。对于COV-2而言，其病毒蛋白与其所引起的抗原性之间的关系并不清楚。基于这样的分析，我们发现，免疫血清中针对S和N的抗体可能起着相同的作用，都能引起机体针对病毒的免疫学反应。结合S和N在病毒结构中的分布，本发明采取两步灭活的方法，使S和N都充分暴露，尽可能的刺激并激活免疫系统。在恒河猴攻毒保护实验中，这种灭活疫苗所引起的中和抗体具有剂量依赖的关系，但对特异性CTL反应而言，各种剂量均能引起较强的免疫反应。传统观点认为，中和抗体是疫苗有效性的重要评价指标，针对SARS-COV-2灭活疫苗，我们设计了RBD肽段，即S蛋白与ACE结合的区域，这种方法虽能产生较高的中和抗体水平，但随后的攻毒保护实验表明，这种免疫状态并不能有效阻击野毒的攻击感染。而部分病毒膜裂解以暴露核衣壳N抗原的灭活疫苗低剂量免疫组，虽然其中和抗体的水平很低（小于1:4），但仍能起到很好的免疫保护作用，这就说明，仅对SARS-COV-2而言，单一的有效性评价指标可能并不适合，就我们目前的实验结果而言，S和N都能有效引起机体的免疫反应，且能起到很好的免疫保护作用。由于灭活疫苗结构及成分的复杂性，其有效成分及评价指标的建立并不容易。本研究建立的不同抗原有效性评价方法，可以使疫苗的使用量更加精确，确保免疫效果的连续性和稳定性，为大规模临床应用提供理论基础，也可为其他灭活疫苗抗原性的标准化提供依据。