一种基于微液滴的集成化数字核酸扩增芯片及其使用方法和应用

摘要

本发明提供一种基于微液滴的集成化数字核酸扩增芯片及其使用方法和应用。所述集成化数字核酸扩增芯片包括上盖和底板；所述上盖包括进油口、进样口和排气口，所述底板包括液滴生成区和液滴存储区；其中，所述液滴生成区包括：进油口流道，与所述进油口相连；进样口流道，与所述进样口相连，且所述进油口流道和进样口流道的交汇处为十字交叉型通道，微液滴于所述交汇处生成；所述液滴存储区包括：收集腔流道，与所述十字交叉型通道相连；液滴存储腔，与所述收集腔流道和排气口相连。在所述芯片上可完成液滴生成、核酸扩增以及检测等过程，提高检测效率和检测准确度，促进了基于微液滴的集成化数字核酸扩增技术的快速发展。

说明书

技术领域

本发明属于核酸检测领域，具体涉及一种基于微液滴的集成化数字核酸扩增芯片及其使用方法和应用。

背景技术

目前，以核酸为检测标志物的体外诊断技术得到了越来越多的关注，现已广泛应用于临床诊断、食品安全、公共卫生等领域。特别是针对近期全球爆发的由新型冠状病毒感染引起的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)，核酸检测在鉴别诊断、临床指导、出院排查等方面发挥着重要作用，为疫情防控战役提供了强有力的手段。

此外，针对新兴的不依赖于中心实验室的即时检测应用场景，便携式、低成本、集成化的核酸检测装置的开发具有重要意义，对全面提升分级诊疗服务能力有良好的促进作用。同时，在精准医学快速发展的势头下，核酸检测呈现出单分子绝对定量检测的需求。

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)技术作为一种体外扩增特定核酸片段的分子生物学技术，是核酸检测中应用最为广泛的技术。至今，PCR技术已经发展到第三代的绝对定量数字PCR，拥有不依赖于Ct值的鉴定、不受扩增效率的影响、良好的准确度和重复性等优势。并且在分子诊断市场，涌现出了大量的商业数字PCR仪器，如

数字PCR系统主要由三部分组成：样本制备仪、核酸扩增仪、阅读分析仪。将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。在检测过程中，往往涉及到多步的移液过程，增加了操作的复杂性以及多步操作可能引起的检测误差和交叉污染。并且，现有数字PCR系统成本高昂、检测时间长、便携性差，不利于其在核酸即时检测领域中的推广。

随着微纳加工技术和分子生物学的不断发展，基于微流控技芯片的数字核酸扩增技术得到了人们越来越多的关注，并且在系统小型化、集成化方面展现出巨大潜力。目前，根据样本分散方式不同数字核酸扩增技术主要分为两类：微孔式和微液滴式。相比之下，微液滴式具有液滴通量可调、结构简单、加工容易等优点。根据对温度需求的不同，数字核酸扩增技术包括基于循环变温的数字PCR技术和恒温控制的数字等温扩增技术。

现有商品化的数字PCR芯片中，大多采用由一块芯片生成液滴，转移至PCR管内进行扩增，然后再转移到另一块检测芯片内进行荧光检测，即整个反应由“生成液滴-PCR加热反应-检测”三部分组成，操作比较繁琐，同时在液滴的转移过程中，存在液滴破碎、转移不完全、气溶胶交叉污染等情况存在，降低了数字PCR的准确度和可靠性。目前，基于微液滴的集成化数字核酸扩增芯片(包括数字PCR和数字等温扩增)还比较少，主要原因在于核酸扩增时芯片上生成液滴的热稳定性差，容易导致液滴融合从而影响检测精度。

因此，提高微液滴的热稳定性是集成化微液滴数字核酸扩增技术面临的主要挑战。

发明内容

鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种基于微液滴的集成化数字核酸扩增芯片及其使用方法和应用。所述集成化数字核酸扩增芯片能够实现液滴生成、扩增以及检测的一体化核酸扩增检测流程，促进了基于微液滴的集成化数字核酸扩增技术的快速发展。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种基于微液滴的集成化数字核酸扩增芯片，所述集成化数字核酸扩增芯片包括上盖和底板；所述上盖包括进油口、进样口和排气口；所述底板包括液滴生成区和液滴存储区。

其中，所述底板的液滴生成区包括：进油口流道，与所述进油口相连；进样口流道，与所述进样口相连，且所述进油口流道和进样口流道的交汇处为十字交叉型通道，微液滴于所述交汇处生成。

所述液滴存储区包括：收集腔流道，与所述十字交叉型通道相连；液滴存储腔，与所述收集腔流道和排气口相连。

本发明提供一种基于微液滴的集成化数字核酸扩增芯片，所述芯片结构由上盖和底板两部分构成，上盖上刻有进油口、进样口以及排气口，所述芯片的底板上包括液滴生成区和液滴存储区，其中，液滴生成去区上进样口流道和进油口流道的交汇处为十字交叉型，样品的微液滴和油相的微液滴在此处汇聚后形成完整的油相包裹的样品微滴，在核酸检测水平上实现单分子检测；

本发明提供的芯片结构简单、加工过程简单，且不依赖专门的液滴生成油，能够实现“样本进-结果出”的一体化核酸扩增检测；所述液滴生成、扩增以及检测均可在芯片上完成，减少检测过程中因为样品的转移所造成的污染，提高检测效率和检测准确度，促进了基于微液滴的集成化数字核酸扩增技术的快速发展。

作为本发明优选的技术方案，所述集成化数字核酸扩增芯片的底板上包含至少2个液滴存储腔。

优选地，所述液滴存储腔中含有5～10个支撑柱，例如可以是5个、6个、7个、8个、9个或10个等。

例如，本发明中所述液滴收集单元中液滴存储腔可以分为2个，保证液滴在进入收集腔时可以铺满，每个收集腔可以含有10根支撑柱。一方面，可以对进入收集腔的液滴进行碰撞减速，避免液滴速度过快与其它液滴产生融合，另一方面，可以对芯片收集腔起支撑作用，方便芯片键合加工，第三方面，也能在荧光检测观察时起到定位作用。

作为本发明优选的技术方案，所述液滴存储腔的深度为1～2个微液滴直径。

优选地，所述液滴存储腔的边角设置倒角。

本发明中，所述液滴收集单元中收集腔内有较大的倒圆角，保证液滴进入收集腔时边角不会留下气泡，收集腔的深度控制为1～2个液滴直径之间，保证液滴全部在同一平面内。

作为本发明优选的技术方案，所述进油口流道在交汇处前端设置缩口。

优选地，所述进样口流道为蛇形管路，在交汇处前端设置缩口。

本发明中，将进样口流道设置为蛇形管路，即使在狭小空间内便能达到所需流道长度，可以使样品有足够的流道长度进行缓冲，使其经过十字交叉处使时为速度稳定的流体，起到良好的缓冲作用。

同时，本发明中所述液滴形成单元中连续相管道和分散相管道形成十字交叉之前分别有缩口，在外界功耗最小的情况下能形成稳定均一的油包水液滴。

作为本发明优选的技术方案，所述收集腔流道中在转角处具有弧度；所述弧度是指流道在转角处并非为90°垂直形式的转弯，而是以弧形方式转弯。

本发明中，所述收集腔流道中流道在转向时转角处有一定弧度，并非为90°垂直形式的转弯，保证了液滴在转移过程中的稳定性。

本发明中，所述集成化数字核酸扩增芯片可以采用多种材料进行制备，例如聚二甲基硅氧烷、PMMA塑料、COC塑料、PC塑料、玻璃或硅等。

所述集成化数字核酸扩增芯片也可使用本领域常用的技术方法进行制备，例如光刻蚀或3D打印等。

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的集成化数字核酸扩增芯片的使用方法，所述使用方法包括如下步骤：

(1)在集成化数字核酸扩增芯片上盖的进油口和进样口分别通入油和扩增反应预混液，在注射泵的驱动下通过进油口流道和进样口流道流动；

(2)所述油和扩增反应预混液在进油口流道和进样口流道的交汇处产生微液滴；

(3)所述微液滴通过收集腔流道流入由液滴收集腔中，所述液滴收集腔中的气体由排气口排出；

(4)所述微液滴内的扩增反应完成后，采集所述集成化数字核酸扩增芯片的荧光信号，得到检测结果。

第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的集成化数字核酸扩增芯片在核酸扩增和/或核酸检测中的应用。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

(1)本发明提供的基于微液滴的集成化数字核酸扩增芯片，芯片结构简单、且使用过程中液滴生成、核酸扩增以及检测均可在芯片上完成，能够实现“样本进-结果出”的一体化核酸扩增检测，减少检测过程中因为样品的转移所造成的污染；

(2)本发明提供的芯片加工过程简单，且不依赖专门的液滴生成油，其适用范围较广，适用于多种核酸扩增和检测体系，包括环介导等温扩增(LAMP)反应在内的多种扩增体系；

(3)本发明提供的芯片能够较为稳定的生成微液滴，且通过倒角、弯曲管道以及支撑柱的设置，提高微液滴的热稳定性，在收集腔内也会单层存在，不会相互产生影响，也方便后续进行显微观察和荧光检测。

附图说明

图1为实施例1中提供的集成化数字核酸扩增芯片的结构示意图。

图2为实施例1中提供的集成化数字核酸扩增芯片的交汇处缩口示意图。

图3为实施例3中利用所述芯片得到的液滴生成结果图。

图4为实施例3中利用所述芯片完成LAMP扩增后得到的荧光结果图。

其中，1-上盖，2-底板，3-进油口，4-进样口，5-排气口，6-进油口流道，7-进样口流道，8-液滴收集腔，9-支撑柱，10-收集腔流道。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

需要理解的是，在本发明的描述中，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，在本发明的描述中，除非另有明确的规定和限定，术语“设置”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以通过具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

以下实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供一种基于微液滴的集成化数字核酸扩增芯片，其结构如图1所示：

所述集成化数字核酸扩增芯片包括上盖1和底板2；所述上盖从左到右依次包括进油3、进样口4和排气口5；

所述底板分为液滴生成区和液滴存储区，其中，所述底板的液滴生成区包括：进油口流道6和进样口流道7，分别与进油口和进样口相连，且进样口流道设置为蛇形流道结构；

所述进油口流道6和进样口流道7的交汇处为十字交叉型通道，微液滴于所述交汇处生成，同时，进油口流道6和进样口流道7在交汇前均缩小直径，形成缩口，能够在外界功耗最小的情况下形成稳定均一的油包水液滴，具体如图2所示；

所述液滴存储区包括两个平行设置的液滴收集腔8，液滴收集腔8的深度控制为1个液滴直径之间，保证液滴全部在同一平面内；

且每个收集腔内以2×5排列的方式设置十个支撑柱9；一方面可以对进入收集腔的液滴进行碰撞减速，避免液滴速度过快与其它液滴产生融合，也可以对芯片收集腔起支撑作用，方便芯片键合加工；还能在荧光检测观察时起到定位作用；

液滴收集腔8的边角均设置为倒角，保证液滴进入收集腔时边角不会留下气泡；

所述液滴收集腔8通过收集腔流道10与所述十字交叉型通道相连，达到存储液滴的目的，另一端与排气口5相连，一方面排除腔内的气体，在实验完成后，也可排除腔内的液滴。

实施例2

本实施例提供一种基于微液滴的集成化数字核酸扩增芯片的使用方法。具体包括如下步骤：

(1)首先针对目标核酸样本，制成核酸扩增反应的预混液；

(2)将矿物油和预混液分别从进油口和进样口通过精密注射泵通入芯片；所述矿物油和预混液在“十字”交叉通道处产生油包水的微液滴；

(3)并在注射泵的持续压力下将液滴收集在收集腔通道内；

(4)待液滴生成完毕，将进油口，进样口以及排气孔用密封胶封闭，将芯片放置在加热平台上完成核酸扩增反应。

(5)反应结束后，利用LED光源对扩增反应之后的样本进行激发，液滴在激发光作用下会产生荧光信号点，对荧光点的数量进行统计分析就能得到核酸序列的初始含量，从而完成核酸的数字化检测。

实施例3

本实施例中利用实施例1提供的集成化数字核酸扩增芯片生成微液滴，并进行环介导等温扩增(LAMP)反应。

本实施例中，选用双通道注射泵作为样本的驱动装置，两个通道分别连有矿物油和LAMP扩增预混液，并分别接入进油口和进样口；

将芯片置于光学显微镜平台下，观察液滴生成情况；

接好装置后，调节注射泵参数，油相流速设置为3000微升/小时，水相流速设置为1000微升/小时；

矿物油和LAMP扩增预混液从进油口和进样口通过精密注射泵通入芯片，能够观察到在“十字”通道处产生有均匀性好的液滴(如图3)；

同时，本实施例中还增加LAMP扩增预混液的流速，随着LAMP扩增预混液流速的增加，产生液滴的频率增加；

最后，将该芯片放置在烘箱(65℃)加热30分钟完成LAMP扩增反应，再将芯片内的液滴收集在盖玻片上，在蓝光激发的荧光显微镜下面拍照，获得荧光图像(如图4)；

本实施例中在集成化数字核酸扩增芯片上成功完成液滴的生成和扩增过程。

同样的，本发明所述的集成化数字核酸扩增芯片不仅能够完成LAMP反应，对于其他类型的核酸扩增反应同样适用。

综上所述，本发明提供的集成化数字核酸扩增芯片应用场景广泛，能够实现液滴生成、扩增以及检测的一体化核酸扩增检测流程，针对即时检测应用场景中便携式、低成本、集成化的核酸检测装置的开发具有重要意义，对于数字核酸扩增技术具有重要的促进作用。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。