制备高效表达旁分泌RG1-BM-MSC培养基的方法、条件培养基及应用

摘要

本发明提供了一种制备高效表达旁分泌RG1－BM－MSC培养基的方法、条件培养基及应用，方法包括以下步骤：(1)制备含不同浓度人参皂苷(RG1)的基础培养基，将骨髓间充质干细胞(BM－MSC)分别在上述浓度不同的RG1基础培养基中预激活七天；(2)将骨髓间充质干细胞转移至新鲜无血清培养基继续培养48h，得到含有高效表达旁分泌物质的一系列非浓缩基础条件培养基，将该一系列非浓缩基础条件培养基进行超滤浓缩50倍，控制截留分子量为5kDa，并在－20℃下储存；(3)将以有效剂量10Gy辐射的IEC－6细胞分别在该一系列浓缩条件培养基中连续培养七天，并测定细胞活力，以确定RG1激活骨髓间充质干细胞的最佳浓度。本发明所制备的RG1－BM－MSC培养基能够增强骨髓间充质干细胞旁分泌的效果。

说明书

技术领域

本发明属于生物医疗技术领域，具体涉及一种制备高效表达旁分泌作用的RG1-BM-MSC培养基的方法、含有高效表达的旁分泌物质的条件培养基以及人参皂苷RG1增强骨髓间充质干细胞的旁分泌作用在治疗辐射性肠损伤的药物中的应用。

背景技术

腹腔内和/或骨盆恶性肿瘤患者中常见辐射诱发的肠损伤(RIII)，放疗引起的放射损伤会触发肠道上皮细胞凋亡或最终坏死(Kumagai等，2018； Moussa等，2016)。据报道，3～10％的患者会出现严重的辐射引起的肠损伤，如肠狭窄/瘘管甚至肠源性败血症，从而影响其生活质量(Kumagai等人，2018)，但是目前仍没有有效的策略来治疗这种威胁生命的疾病。

使用间充质干细胞(MSCs)的干细胞疗法已成为治疗放射疗法相关不良反应症状中有前途的疗法(Keating，2012；Moussa et al。，2016)。尽管早期的研究将MSC的治疗作用归因于迁移和植入受损组织的能力，但现在已经认为MSC的分泌是所观察到益处的主要原因。MSC可以以旁分泌或自分泌方式分泌许多营养分子，例如生长因子以及细胞外囊泡，从而增强宿主细胞的再生(Basu and Ludlow，2016；Chang等，2012；van Poll等，2008)。尽管移植的MSC对组织再生具有有益的作用，但MSC的移植受到移植率低和致癌风险的阻碍(Hung等，2007；Menasche，2005；Stagg，2008)。包含众多营养因子的MSC衍生条件培养基(MSC-CM)成为了MSC移植的替代方法(Vizoso et al。，2017)。现有技术中也表明，MSC-CM可以通过抑制细胞凋亡，减少炎症，促进增殖和改善新血管生成而对组织再生发挥保护作用，而没有致癌和免疫排斥的风险(Chang等人，2012；Menasche，2005； Chang等，2012；Stagg，2008；van Poll等，2008)。

尽管许多研究报道了MSC-CM的有益作用，但其应用依旧受到营养因子浓度低的限制(Chen等，2015；Osugi等，2012)。例如，据报道，血管生成中血管内皮生长因子(VEGF)的最小有效浓度约为5000pg/ml，而 MSC-CM中的可检测浓度仅为217pg/ml(Angoulvant等，2011)。在另一项研究中观察到了类似的发现，BM-MSC过度表达的VEGF可以有效地修复仓鼠心力衰竭，其内含有足够水平的治疗性旁分泌因子(Zisa等，2009)，而未经修饰的BM-MSC的CM不足以改善心室功能，这表明常规MSC-CM 可能无法改善心室功能；此外，在先前的研究中，还表明炎症预激活或基因修饰增强了BM-MSC对肠道损伤的旁分泌作用，而未激活的MSC-CM由于营养浓度低而无法发挥治疗作用影响因素(Chen et al。，2015；Chen et al。，2020)。

解决该问题的一种策略是增强MSC的旁分泌作用。已证明多种刺激和条件可以改善MSC的旁分泌作用，包括促炎性刺激，低氧预处理，基因修饰(Chang等人，2013a；Chen等人，2015；Duijvestein等人，2011；Ni等，2017； Xue等，2015)。人参皂苷Rg1被认为是人参中活性最高的成分之一，具有抗炎和免疫调节作用的能力(Gu等，2016；Guo等，2017；Li等，2016)。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明提供了一种制备高效表达旁分泌 RG1-BM-MSC培养基的方法、条件培养基及应用，通过人参皂苷RG1增强骨髓间充质干细胞的旁分泌效果。

一方面，本发明提供了一种制备高效表达旁分泌作用的RG1-BM-MSC 培养基的方法，其包括以下步骤：

(1)制备含不同浓度人参皂苷(RG1)的基础培养基，将骨髓间充质干细胞(BM-MSC)分别在上述浓度不同的RG1基础培养基中预激活七天；

(2)将骨髓间充质干细胞转移至新鲜无血清培养基继续培养48h，得到含有高效表达旁分泌物质的一系列非浓缩基础条件培养基，将该一系列非浓缩基础条件培养基进行超滤浓缩50倍，控制截留分子量为5kDa，得到一系列浓缩条件培养基，并在-20℃下储存；

(3)将以有效剂量10Gy辐射的IEC-6细胞分别在该一系列浓缩条件培养基中连续培养七天，并测定细胞活力，以确定RG1激活骨髓间充质干细胞的最佳浓度。

进一步的，基础培养基中含人参皂苷(RG1)的浓度序列为：0.1μM、1μM、 10μM和100μM。

进一步的，步骤(3)中在96孔板中进行，浓缩条件培养基中的剂量为0.1毫升/天/孔，IEC-6细胞为1×104细胞/孔。

进一步的，所述的无血清基础培养基为DMEM-F12培养基。

另一方面，本发明提供了一种采用前述制备高效表达旁分泌作用的 RG1-BM-MSC培养基的方法所制备的条件培养基，其中，条件培养基中含有高效表达的旁分泌物质。

进一步的，所述条件培养基至少含有2484.2±200.6pg/ml的VEGF。

进一步的，所述条件培养基至少含有1525.6±212.5pg/ml的IL-6。

再一方面，本发明提供了一种人参皂苷RG1增强骨髓间充质干细胞的旁分泌作用在治疗辐射性肠损伤的药物中的应用。

本发明具备以下有益效果：

本发明所制备的高效表达的RG1-BM-MSC培养基，能够显著增强旁分泌作用的表达，这些旁分泌物质对辐射性肠损伤具有良好的修复作用，能够用作新的干细胞治疗辐射性肠损伤的策略。

下面结合附图对本发明作进一步的详细说明。

附图说明

图1显示了RG-1预激活了骨髓来源的间充质干细胞(BM-MSC)，而没有改变BM-MSC的表型；

图2显示了RG1以剂量依赖性方式增强了BM-MSC对照射的IEC-6细胞的旁分泌作用；

图3显示了RG1-MSC-CM改善了辐照大鼠的肠道功能和结构情况；

图4显示了RG1-MSC-CM减弱细胞凋亡并促进肠内增殖的情况；

图5显示了RG1-MSC-CM在体内和体外下调辐射诱发的炎症反应；

图6显示了RG1-MSC-CM改善了辐照大鼠肠道的血管生成情况；

图7显示了RG1-MSC-CM改善了辐照大鼠的肠道干细胞(ISC)的再生情况；

图8显示了RG1-MSC-CM通过增加VEGF和IL-6的释放来促进RIII 的恢复；

图9显示了IL-6和VEGF的治疗作用，部分通过HO-1依赖性机制介导；

图10显示了血红素加氧酶-1介导了RG1-MSC-CM分泌组的差异和治疗效果。

具体实施方式

本示例提供了一种制备高效表达旁分泌作用的RG1-BM-MSC培养基的方法，其包括以下步骤：

(1)制备含不同浓度人参皂苷(RG1)的基础培养基，将骨髓间充质干细胞(BM-MSC)分别在上述浓度不同的RG1基础培养基中预激活七天；

(2)将骨髓间充质干细胞转移至新鲜无血清培养基继续培养48h，得到含有高效表达旁分泌物质的一系列非浓缩基础条件培养基，将该一系列非浓缩基础条件培养基进行超滤浓缩50倍，控制截留分子量为5kDa，得到一系列浓缩条件培养基，并在-20℃下储存；

(3)将以有效剂量10Gy辐射的IEC-6细胞分别在该一系列浓缩条件培养基中连续培养七天，并测定细胞活力，以确定RG1激活骨髓间充质干细胞的最佳浓度。

其中，基础培养基中含人参皂苷(RG1)的浓度序列为：0.1μM、1μM、 10μM和100μM。

其中，步骤(3)中在96孔板中进行，浓缩条件培养基中的剂量为0.1 毫升/天/孔，IEC-6细胞为1×104细胞/孔。

其中，无血清基础培养基为DMEM-F12培养基。

为了验证RG1-BM-MSC培养基能否、以及如何增强BM-MSC对RIII 的旁分泌作用，进行下述的实验过程，其中下述实验中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，下述实验中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，并且这些方法是按照批准的指导方针执行的。

动物：

成年Sprague-Dawley大鼠(8周)来自中山大学(中国)实验动物中心，体重在280～350g之间。对于BM-MSC的原代培养，使用体重在60～100g， 3～4周之间的雌性的Sprague-Dawley大鼠。整个程序按照我们当地动物护理和使用委员会的指导进行。

细胞系和细胞培养：

骨髓间充质干细胞取自成年斯普拉格-道利大鼠的股骨。

将获得的骨髓间充质干细胞在杜尔贝科改良鹰培养基中培养：营养混合物F-12(DMEM-F12)，含有10％热灭活胎牛血清(FBS)、1％谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素。骨髓间充质干细胞的表型通过流式细胞术在第3代进行表征，骨髓间充质干细胞最多使用5代。

大鼠肠上皮细胞IEC6细胞来自美国典型培养物保藏中心(ATCC# CRL-1592，RRID：CVCL_0343)。细胞在DMEM培养，5％胎牛血清，0.1单位/毫升胰岛素和1％青霉素/链霉素；使用20代前的细胞；所有细胞在37℃下保持在5％CO2的潮湿气氛中。

放射性肠损伤(RIII)模型：

照射前将实验大鼠麻醉。

通过将他们的腹部以300cGy/min的剂量率暴露于线性加速器(西门子 PRIMUS)来执行辐射程序。基于我们之前的实验，选择14Gy作为检测骨髓间充质干细胞治疗作用的最佳照射剂量(陈等，2015)。在为期两周的实验过程中，对一些大鼠的存活状态进行了监测，而其余的用于组织收集。在第1、3、5、7天从大鼠的肠中收集组织样本，用于结构和功能检查。

对于体外研究，每天收集用10Gy照射的IEC-6细胞，直到第7天。

对于血红素加氧酶-1(HO-1)抑制，将IEC-6与0.1μM锌原卟啉(Zn-PP) (Sigma，St.Louis，MO)孵育(Yanaka等，2013)。

条件培养基的制备和处理：

为了制备条件培养基，将骨髓间充质干细胞在含有不同浓度 RG1(0.1μM，1μM，10μM，100μMRG1，西格玛，圣路易斯，密苏里州，美国)的培养基中预激活7天，每天刷新。细胞每2～3天传代一次。培养7 天后，移去培养基，将骨髓间充质干细胞在无血清DMEM-F12培养基中培养48小时。然后收集条件培养基用于酶联免疫吸附试验，以检测细胞因子的浓度。为了进一步使用，条件培养基通过超滤浓缩50倍，截留分子量为 5千道尔顿(毫微微孔，比勒里卡，马萨诸塞州)，并储存在-20℃。

为了确定RG-1激活骨髓间充质干细胞的最佳浓度，在96孔板中，在来源于通过不同浓度的RG-1(0.1μM，1μM，10μM，100μM)预激活的骨髓间充质干细胞的培养基(0.1毫升/天/孔)中培养以10Gy辐射的IEC-6细胞 (1×104细胞/孔)。每天用CCK8测定细胞活力，直到第7天。

对于体内研究，将大鼠腹腔内注射条件培养基4天(第0、1、2、3天)(1 毫升/天/大鼠)。

对于中和实验，收集条件培养基并与对照免疫球蛋白或单独的血管内皮生长因子中和抗体(1微克/毫升；(R&D系统公司，类别号AF564， RRID：AB_2212821))，白介素-6(1微克/毫升)；(R&D系统公司，类别号AF506， RRID：AB_355398))、白介素-10(1微克/毫升；(R&D系统公司产品类别# AF519，RRID：AB_355408))或其组合。

细胞计数试剂盒-8(CCK-8试验)：

按照说明评估细胞增殖(Dojindo细胞计数试剂盒-8)。在密度为1×104 细胞/孔的96孔培养物中培养24小时，在10Gy辐射和处理后，向每个孔中加入10ul的CCK-8，并在37℃孵育1小时。

使用多扫描光谱(Thermo Fisher)以450nm处的光密度(OD)来测量细胞增殖。

d-木糖浓度试验：

肠吸收功能通过血清中D-木糖浓度来测定。简而言之，通过胃管给大鼠喂食1.5毫升5％D-木糖溶液，然后收集血样，与间苯三酚显色剂混合，并在100℃下反应4分钟。冷却后，用分光光度法测量血清中的D-木糖浓度(Doerfler等人，2000年)。

D-latate测试：

血浆中D-latate的浓度用酶分光光度法测定(Brandt等人，1980年)。

免疫组织化学：

辐射后第1、3、5、7天处死大鼠，从特雷兹韧带和周围淋巴结获得四个2.5厘米的近端空肠连续段，将组织样品固定在10％中性缓冲福尔马林中 12小时，然后脱水并用石蜡包埋。4毫米切片用于苏木精-伊红染色(苏木精 -伊红染色)。石蜡包埋切片脱蜡，再水合，用3％过氧化氢处理。抗原回收后，切片与来自宿主的血清在室温下孵育30分钟，以阻断非特异性抗原结合位点。将切片洗涤并用抗PCNA病毒(RRID Abcam Cat#ab29：AB_303394) 孵育，用Envision试剂盒(美国加州卡皮隆尼亚州DAKO)检测信号。切片用苏木精复染。5个隐窝中阳性细胞的数量在每个切片的100个隐窝中进行评分，并报告为平均标准差。其中每组使用三只大鼠。

免疫荧光：

放射后3天处死大鼠并收集肠组织。将组织样品在10％中性缓冲的福尔马林中固定12小时，脱水并用石蜡包埋。抗原修复后，将脱石蜡的组织切片与山羊血清(Sigma-Aldrich)在室温下孵育30分钟，以封闭非特异性抗原结合位点。对于一抗，将切片与抗CD31(Abcam目录号ab28364，RRID： AB_726362)，抗Lgr5(Thermo Fisher Scientific目录号PA5-87974，RRID： AB_2804555)在4℃孵育过夜。对于二抗，将切片与抗兔Alexa Fluor 594(Cel lSignaling Technology目录号8889，RRID：AB_2716249)或抗兔Alexa Fluor 488(Abcam目录号ab150077，RRID：AB_2630356)在37℃下孵育 1h。DAPI用于核染色。在荧光显微镜(OLYMPUS BX43)下拍摄阳性信号。血管生成的量化表示为通过图像J(图像J，RRID：SCR_003070)分析的CD31+面积分数。

为了进行体外研究，将IEC-6细胞用PBS洗涤两次，固定在100％甲醇中，用0.3％Triton X-100渗透，并在实验的第3天用10％山羊血清封闭。然后将细胞与第一抗体抗PCNA(Abcam目录号ab29，RRID：AB_303394) 在4℃孵育过夜。对于二抗，将细胞与抗兔AlexaFluor 594(Cel lSignaling Technology目录号8889，RRID：AB_2716249)在37℃孵育1小时。DAPI 用于核染色。在荧光显微镜(OLYMPUS BX43)下拍摄阳性信号。

TUNEL染色：

从受照射大鼠的肠道收集样品，并使用脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)分析(原位细胞死亡检测试剂盒；罗氏应用科学，印第安纳波利斯。其中每组包含至少3只大鼠。每节100个隐窝计算5个隐窝的阳性细胞数。数据表示为平均标准差。

流式细胞术：

兔抗大鼠CD29(BD生物科学#555005，RRID：AB_395639)，CD34(圣克鲁斯生物技术#sc-74499，RRID：AB_1120394)，CD44(BD生物科学#550974， RRID：AB_393987)，CD45(BD生物科学#559135，RRID：AB_397196)，CD105 (Abcam#ab)为了细胞内染色，肠系膜淋巴结被切成小块，并在37℃搅拌下，在含有200U/ml(西格玛-奥尔德里奇)的RPMI 1640培养基中孵育50分钟。收集含有细胞的上清液，洗涤细胞并重悬于完全RPMI 1640中。然后将细胞与佛波醇肉豆蔻酸酯(50纳克/毫升)和离子霉素(750纳克/毫升)一起孵育4 小时。然后在流式细胞仪上分析标记的细胞。针对CD4的单克隆抗体(赛默菲舍科学#11-0040-81，RRID：AB_953579)和Foxp3(赛默菲舍科学# 12-5773-82，RRID：AB_465936)用于流式细胞术。

对于细胞死亡检测，在放射后1、3、5、7天，通过AnnexinV-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒(美国BD Bioscience)测量IEC-6的凋亡。简而言之，将IEC-6细胞接种在6孔板中(1×105细胞/孔)。辐射(10Gy)并在指定的时间进行干预后，将细胞用磷酸盐缓冲液洗涤两次，通过胰蛋白酶消化分离，离心(200g，5分钟)，重悬并用膜联蛋白V/碘化丙啶(PI)的试剂染色进行凋亡检测套件10分钟，通过流式细胞术确定凋亡细胞的百分比。

酶联免疫吸附试验：

用酶联免疫试剂盒(美国明尼苏达州明尼阿波利斯市R&D系统公司)测定未浓缩培养基中的血管内皮生长因子、白细胞介素6(IL6)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、白细胞介素10(IL10)、转化生长因子β(TGFβ1)。血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)用酶联免疫试剂盒(英国剑桥，阿贝歇)测定。肠组织样品用酶联免疫试剂盒(美国明尼苏达州R&D 系统公司)检测白细胞介素-1(IL1β)、IL10、肿瘤坏死因子α(TNF-α)。

测定NF-κb活化的实验方案：

根据以前的研究，使用市售的ELISA试剂盒(Active Motif，Carlsbad， CA)确定NF-κBp65的水平。简而言之，使用核提取试剂盒(Active Motif， Carlsbad，CA)制备了IEC-6(5μg)或肠(10μg)的核提取蛋白，并与含有NF-κB共有结合位点的寡核苷酸一起孵育(5＇-GGGACTTTCC-3＇)结合到96孔微量滴定板上。核提取物中的NF-κB活性形式与该共有位点特异性结合。通过使用对NF-κBp65的活化形式具有特异性的一抗和与辣根过氧化物酶偶联的二抗，通过分光光度计(Thermo Scientific)评估NF-κBp65 的活化形式，并在450nm下读取。所有样品和标准品均一式两份测量。

细胞因子制剂：

重组大鼠血管内皮生长因子0.5微克(英国剑桥大学)，重组大鼠白细胞介素-60.3微克(英国剑桥大学剑桥大学)，用于确定血管内皮生长因子和白细胞介素-6是否具有与RG1-间充质干细胞相同的治疗效果，两者在4天内相当于4毫升RG1-MSC-CM的含量。对于体外研究，在IEC-6的培养基中使用IL-6(1500pg/ml)和VEGF(2500pg/ml)。

蛋白质印迹：

将IEC-6在冰上的放射免疫沉淀(RIPA)缓冲液中裂解10分钟，然后以10，000r/min的速度离心10分钟。使用BCA试剂盒测量蛋白质浓度。将上清液在10％SDS聚丙烯酰胺电泳凝胶上分离，并转移至硝酸纤维素膜上。封闭5％脱脂牛奶(Sigma-Aldrich Corporation，St.Louis，Mo)后，将膜与指定的HO-1一抗(Abcam Cat#ab13248，RRID：AB_2118663)，p53(Abcam Cat#ab26，RRID：AB_303198)在4℃过夜，然后与过氧化物酶偶联的二抗(CellSignaling Technology Cat#7076，RRID：AB_330924)在37℃孵育1h。使用ECL系统(英国白金汉郡Amersham Life Sciences)检测膜上的抗体-抗原复合物。以1：1，000稀释度的β-微管蛋白或GAPDH抗体作为对照。集成密度通过图像J测量。

统计分析

数据使用SPSS 17.0软件进行分析(SPSS，RRID：SCR_002865)，并表示为平均标准差。数据分析采用学生t检验或单向或双向方差分析，随后采用 Bonferroni事后检验，以确定统计显著性。应用卡普兰-迈耶法分析动物存活曲线。P＜0.05的值被认为具有统计学意义。

结果

1)、RG1以剂量依赖的方式增强骨髓间充质干细胞对照射的上皮细胞 -6细胞的旁分泌作用。

体内和体外研究设计如图1A所示：

体外设计：用10Gy辐照的IEC-6用未活化的BM-MSC(MSC-CM)或通过不同浓度的RG1(RG1-MSC-CM)(0.1μM预活化)的BM-MSC的条件培养基处理，1μM，10μM，100μM)，然后每天进行细胞活力测试，直 1到第7天。

体内实验：将Sprague-Dawley大鼠随机分为未辐照(对照组)或辐照组 (IR)，腹腔为14Gy在第0天进行放射线照射，然后进行腹膜内注射(1 毫升/天，共4天)，并注入对照培养基(DMEM-F12)，MSC-CM， RG1-MSC-CM。在第1、3、5、7天处死大鼠以进行组织学检查，或者在第 1、3、7天处死大鼠以进行功能评估。剩下的大鼠在整个14天的实验中都用于生存分析。

为了评估RG-1预激活的BM-MSC的表型，我们进行了流式细胞术以鉴定表面标记，流式细胞仪显示RG1激活的BM-MSC中CD29，CD44，CD90， CD105呈阳性，而CD34和CD45呈阴性(图1B)，提示BM-MSC RG-1激活后，MSC仍保持其表型。

为了检查RG-1对BM-MSC旁分泌活性的影响，我们检查了由不同浓度的RG-1预活化的BM-MSC的CM对辐照IEC-6的影响。电离辐射(IR) +DMEM-F12组和RG1(100μM)-MSC-CM组的IEC-6细胞表现出降低的细胞活力，而RG1(0.1μM)-MSC-CM组和RG1(1μM)-MSC-CM组显示出细胞增殖的显着增加，其中1μMRG1组的改善最大。此外，RG1 (10μM)-MSC-CM组的光密度(OD)值只有有限的增加(图2A)。结果表明，1μMRG1是增强BM-MSC对RIII的旁分泌作用的最佳剂量，这将在进一步研究中使用。

为了进一步评估RG1-MSC-CM对辐射IEC-6的影响，我们对辐射IEC-6 进行了PCNA免疫荧光染色，并评估了p53的表达，p53是辐射诱导的DNA 损伤的产生者。IR+DMEM-F12和MSC-CM组的PCNA表达降低，而 RG1-MSC-CM显着提高了IEC-6照射下PCNA的表达。(图2B，2C)此外， IR+DMEM-F12组和IR+MSC-CM组中p53的表达显着升高，而 RG1-MSC-CM减弱了p53的表达(图2D)，表明RG1-MSC-CM改善了辐射引起的DNA损伤。

2)、RG1-MSC-CM通过减轻肠道的结构和功能损伤，提高暴露于14Gy 腹部照射的大鼠的存活率。

在腹部暴露于14Gy辐射后，将RG1-MSC-CM、MSC-CM和DMEM-F12 分别每天注入实验大鼠的腹部，为期4天(图2A，通过DMEM-F12，MSC-CM 或CM处理的经辐照的IEC-6细胞从不同浓度的RG1(0.1μM，1μM， 10μM，100μM)预激活的BM-MSC的细胞增殖从第0天到第7天的CCK8。数据代表三个独立实验的平均值±SD。＊＊，相对于IR+DMEM-F12，P＜0.05)。如图2B、2C所示，与MSC-CM和IR+DMEM-F12组相比，RG1-MSC-CM 组显著提高了受照大鼠的存活率(P＜0.05)。尽管MSC-CM组大鼠的存活时间比IR+DMEM-F12组大鼠长，但差异无统计学意义(P＞0.05)，上述结果表明 RG1-MSC-CM对RIII有潜在的治疗作用。

其中其中图2B显示在放射后3天用PCNA对IEC-6细胞进行免疫荧光染色。比例尺100μm，图2C显示PCNA阳性细胞的定量。数据报告为每组至少三个重复孔的每孔10个随机视野的平均值±SD，FOV，视野。＊＊，相对于IR+DMEM-F12，P＜0.05。##，相对于IR+MSC-CM，P＜0.05)，图 2D显示了用GAPDH作为内部对照，在放射3天后通过蛋白质印迹法检测 IEC-6中p53的蛋白水平。数据代表平均值±SD(n＝3)。＊＊，相对于 IR+DMEM-F12，P＜0.05。##，相对于对照，P＜0.05。图2E显示了使用 Kaplan-Meier方法分析了通过注入DMEM-F12，MSC-CM或RG1-MSC-CM (1μMRG1)暴露于14Gy腹部辐射下的大鼠的累积存活率。每个实验组中的大鼠累计数量用括号括起来。通过对数秩检验确定P值。图2F显示了平均生存时间，数据代表平均值±SD。＊＊，相对于IR+DMEM-F12，P＜0.05。 ##，相对于IR+MSC-CM，P＜0.05。除另有说明外，所有数据均通过t检验或单因素方差分析进行分析。

我们进一步研究了大鼠的结构和功能变化。为了检测羧甲基纤维素对 RIII结构损伤的影响，肠段用苏木精-伊红染色。照射后时期的组织学评估显示坏死上皮、萎缩绒毛、炎性细胞浸润和隐窝数量减少(图3A)。 RG1-MSC-CM组小肠的病理组织学损伤得到改善，与MSC-CM和 DMEM-F12组相比，上皮厚度增加(图3A)。应用RG1-MSC-CM后，第3天上皮厚度有所改善，第5天几乎恢复到与对照组相同的水平，而应用 MSC-CM，绒毛厚度仅略有变化(图3B)。

其中图3A显示了组织学通过H&E染色进行分析。比例尺100毫米，放大倍数4倍。图3B显示了上皮的形态厚度测定，每个值代表每只动物20 次独立测量的平均值(每只动物5只动物)，数值报告为平均值±SD。＊＊，相对于IR+DMEM-F12，P＜0.05，##，相对于IR+，P＜0.05。图3C显示了通过D-木糖吸收评估辐照大鼠肠道的吸收功能放射后1、3、7天进行实验。数据代表平均值±SD，＊＊，P＜0.05，相对于IR+DMEM-F12，##，与 IR+MSC-CM相比，P＜0.05。数据代表平均值±SD。图3D显示了测量大鼠的肠通透性放射后1、3、7天血浆D-乳酸的水平。数据代表平均值±SD。＊＊，P＜0.05vs IR+DMEM-F12，##，相对于IR+MSC-CM，P＜0.05。

为了评价羧甲基纤维素钠对受照大鼠功能变化的影响，分别用血清木糖水平和血浆D-latate水平来评价肠的吸收功能和通透性。如图3C、3D所示，与对照组相比，用DMEM-F12处理的辐照大鼠显示出血清木糖水平的显著降低和血浆D-latate水平的升高，表明辐射导致吸收功能和肠通透性的损害(图3C、3D)。然而，通过给予RG1-MSC-CM，这种作用被最小化，这在RG1-MSC-CM组中表现为更多的功能恢复(P＜0.05)。与DMEM-F12组相比，在MSC-CM组中也观察到了血清木糖水平和血浆D-latate水平的这种改善，但直到第7天才达到统计学显著性(图3C、3D)。总的来说，RG1-MSC-CM 显著改善了RIII的结构异常和功能损伤。

3)、RG1-MSC-CM可减轻细胞凋亡并促进肠道增殖。

TUNEL阳性细胞核的数目用于指示凋亡的严重性。与对照组相比，腹部照射在第3天引起凋亡细胞增加约10倍(图4A)。与IR+MSC-CM和 IR+DMEM-F12组相比，RG1-MSC-CM的治疗显着降低了RIII的负面作用，这通过减少第1、3、5和7天的TUNEL阳性核数目得以说明(图4B，P＜ 0.05)。尽管IR+MSC-CM组的凋亡细胞数量也减少了，但是直到第7天，与IR+DMEM-F12组相比都没有发现显着差异(图4B，P＞0.05)。

为了排除RG1-MSC-CM对细胞凋亡的抑制作用是由对免疫系统的间接作用介导的，我们在体外评估了RG1-MSC-CM对RIII的作用。如膜联蛋白 V/PI双重染色所揭示的，与RG1-MSC-CM而不是MSC-CM的共培养显着降低了辐照的IEC-6的细胞凋亡(图4C、4D)。此外，RG1-MSC-CM在第 3天和第5天显着抑制了受辐照的IEC-6中凋亡细胞的速率(P＜0.05)，而在第7天没有显着影响(图4E)。

为了研究细胞增殖，在第1、3、5、7天收集肠组织样品，并在用PCNA 进行免疫组织化学染色后进行检查。与第3天，第5天和第7天的 IR+MSC-CM和IR+DMEM-F12组相比，通过RG1-MSC-CM处理，PCNA 阳性细胞数量显着增加。MSC-CM组的增加并不显着(图4F和4G，P＞0.05)。

其中图4A具体显示了在实验的第3天通过TUNEL染色测定细胞凋亡。比例尺100μm。图4B具体显示了凋亡细胞量化，第1、3、5、7天的TUNEL 阳性细胞每组中n＝3。5个隐窝中阳性细胞的数量为每张切片100隐窝数量中的平均值，并记录为平均值±SD。＊，相对于IR+DMEM-F12，P＜0.05。 #，P＜0.05相对于IR+MSC-CM。图4C具体显示了后通过PI/AnnexinV流式细胞术评估IEC-6的凋亡(第3天)。左上象限包含坏死细胞(％)；右上方象限包含晚期凋亡细胞(％)；左下象限包含活细胞(％)；右下象限包含早期凋亡细胞(％)。图4D具体显示了总凋亡细胞，存活细胞和死细胞。图4E具体显示了图表示为通过PI/Annexin V染色，确定IEC-6细胞凋亡的比例，测定在放射后1、3、5、7天进行。数据代表三个独立样本的平均值±SD实验。##，相对于IR+DMEM-F12，P＜0.05。图4F具体显示了图表示通过免疫组化测定PCNA的方法评估小肠肠上皮细胞的增殖情况。肠组织在实验的第3天收集样品并进行分析。比例尺100μm。图4G具体显示了增殖阳性细胞的量化每组第1、3、5、7天PCNA阳性细胞。n＝3～5。5个隐窝中阳性细胞的数量为每100个隐窝平均值，并记录为平均值±SD。＊，相对于IR+DMEM-F12，P＜0.05。#，P＜0.05相对于IR+MSC-CM。

4)、RG1-MSC-CM在体内和体外下调辐射诱导的炎症反应。

为了研究RG1-MSC-CM对RIII的炎症反应的影响，我们在体内和体外评估了IL-1β、TNF-α、IL-10。尽管辐射上调了促炎因子(IL-1β和TNF-α) 的水平，但RG1-MSC-CM而非MSC-CM显着逆转了体内和体外的增加(图 5A、5B)。尽管RG1-MSC-CM显着增加了粘膜中的IL-10水平，但在体外效果并不明显(图5B)。为了进一步研究RG1-MSC-CM的免疫调节作用，我们在第3天从肠系膜淋巴结(MLN)收集了组织样本。如图5所示，随着时间的推移，MLN中CD4+Foxp3+Treg细胞的百分比显着增加。 RG1-MSC-CM的治疗，表明RG1-MSC-CM辐射后诱导了局部促炎反应的下调(图5C)。

其中图5A具体显示了在第3天从经辐照的大鼠的空肠组织中提取促炎和抗炎因子细胞因子。细胞因子的水平通过酶联免疫吸附测定(ELISA)确定。(3～4只大鼠/组)。＊＊，相对于IR+DMEM-F12，P＜0.05。##，相对于 IR+MSC-CM，P＜0.05。图5B具体显示了在辐射后第3天通过ELISA测量辐射的IEC-6的促炎和抗炎因子。数据代表平均值±SD(n＝3)。##，与IR+MSC-CM相比，P＜0.05。＊＊，相对于IR+DMEM-F12，P＜0.05。图5C 具体显示了通过流式细胞仪检测肠系膜淋巴结(MLN)CD4+群体中 CD4+Foxp3+Treg细胞百分比(4～5大鼠/组)。在实验的第3天收集组织样品。数据代表平均值±SD。##，P＜0.05vs IR+DMEM-F12。

5)、RG1-MSC-CM促进辐照大鼠肠道的血管生成。

为了研究RG1-MSC-CM对受辐照大鼠肠道血管生成的影响，在辐射后第3天进行了CD31的免疫荧光染色(一种代表血管生成程度的泛内皮标记物)(DeLisser等，1993)。如图6所示，与对照组相比，IR+DMEM-F12组的CD31阳性面积分数显着降低，表明辐射诱导的血管新生受损。与 IR+DMEM-F12组相比，RG1-MSC-CM给药后，CD31的面积分数大大增加 (P＜0.05)。IR+MSC-CM组与IR+DMEM-F12组之间无统计学差异。(图 6A、6B)。综上所述，这些发现表明RG1-MSC-CM促进了辐照大鼠肠道的血管生成。

其中图6A具体显示了CD31免疫荧光染色。在辐射后第三天收集肠道样本染色。箭头指示CD31阳性区域。比例尺100μm。图6B具体显示了量化CD31+区域分数。数据表示“热点”区域的平均值±SD。每组至少包含 3只大鼠(3-4个切片/鼠)。##，相对于IR+DMEM-F12，P＜0.05。＊＊，相对于对照，P＜0.05。

6)、RG1-MSC-CM改善了辐照大鼠的肠道干细胞(ISC)的再生。

具有富亮氨酸的重复序列的G蛋白偶联受体5(Lgr5)标记的肠细胞是一种ISC，负责调节损伤后上皮的稳态，更新和再生。免疫荧光染色显示，与对照组相比，第3天的辐射显着减少了隐窝中Lgr5阳性细胞的数量，其中0～2个Lgr5阳性细胞位于隐窝中。尽管MSC-CM导致Lgr5表达的改善有限，但RG1-MSC-CM显着改善了Lgr5阳性细胞的数量。综上所述，这些结果表明，RG1-MSC-CM可以增加放射后肠道中ISC的增殖(图7)。

其中图7A具体显示了用Lgr5进行的免疫荧光染色。收集肠样品并在放射后第3天染色。箭头指示Lgr5阳性细胞。比例尺50μm。图7B具体显示了Lgr5阳性细胞的定量。每组n＝3～5。在每节100个隐窝中对5个隐窝中的阳性细胞数进行评分，并报告为平均值±SD。＊＊，相对于 IR+DMEM-F12，P＜0.05。##，相对于IR+MSC-CM，P＜0.05除另有说明外，所有数据均通过t检验或单因素方差分析进行分析。

7)、RG1-MSC-CM通过增加血管内皮生长因子和白细胞介素-6的释放来促进RIII的恢复。

为了探索RG1介导的旁分泌活性的机制，我们进一步分析了来自 BM-MSC或RG1-MSC的CM中分泌因子的变化。基于我们先前从BM-MSC 获得的条件培养基的细胞因子阵列(Chen等，2015)，我们分析了在MSC-CM 中高表达的8种分泌因子(bFGF，IL-6，IGF-1，IL-10，VCAM ELISA法检测-1，TGF-β1，HGF，VEGF)，据报道可改善RIII中的组织再生(Ko等， 2010；Moussa等，2016)。与IEC-6对细胞生存力的影响一致，低于1μM (0.1μM，1μM)的RG1剂量可以最佳地增强BM-MSC(VEGF，IL-6，IL-10) 的3种选择的细胞因子分泌剂量为1μM(图8A)。在RG1-MSC-CM(1μM) 组中，VEGF，IL-6，IL-10的浓度分别为2484.2±200.6pg/ml， 1525.6±212.5pg/ml和130.0±10.7pg/ml，约为6，分别比MSC-CM高5倍， 1.5倍(图8A)。

尽管ELISA分析证实了RG1-MSC-CM中存在5种选定的细胞因子 (bFGF，VCAM-1，HGF，TGF-β1，IGF-1)，但它们的浓度并不明显高于 MSC-CM中的浓度(图8A)。值得注意的是，100μMRG-1组中的2种细胞因子(IGF-1，TGF-β1)显着低于MSC-CM组(图8A)。这些发现表明，RG1可能以剂量依赖的方式预激活BM-MSC的旁分泌潜能，而高于100μM 的剂量可能会阻碍BM-MSC的旁分泌活性(图8A)。

与MSC-CM相比，鉴于RG1-MSC-CM中3种细胞因子(VEGF，IL-6， IL-10)升高，我们进一步检查了RG1-MSC-CM是否通过这3种细胞因子发挥了治疗作用。如图8所示，RG1-MSC-CM对被辐照大鼠的细胞凋亡，增殖，炎症反应和存活的治疗作用被单独的针对VEGF或IL-6的抗体部分抑制，并进一步被VEGF和IL-如图6所示，尽管针对IL-10的中和作用不影响RG1-MSC-CM的保护作用(图8B-E)。此外，IL-6和VEGF的联合注射可显示出与RG1-MSC-CM相似的治疗效果(图8B-8E)。这些表明IL-6和 VEGF在RG1-MSC-CM介导的RIII恢复中的关键作用。

其中，图8A具体显示了在不同浓度RG1的浓度(0.1μM，1μM，10μM， 100μM)预激活的BM-MSC的非浓缩条件培养基中选择8种细胞因子进行 ELISA检测。数据代表平均值±标准差，至少三个独立的实验。##，相对于MSC-CM，P＜0.05。图8B具体显示了中和选择的细胞因子或添加外源性细胞因子对细胞凋亡(左图)和增殖的影响(右图)。凋亡及增殖是通过定量评估每5个隐窝的TUNEL阳性细胞和PCNA阳性细胞的百分比。数值报告为平均值±SD(n＝4～5)。##，相对于IR+DMEM-F12，P＜0.05。 **，相对于IR+RG1-MSC-CM，P<0.05。RMC：RG1-MSC-CM，2NAs：抗VEGF抗体+抗IL-6抗体。图8C具体显示了促/抗炎在第3天从经辐照的大鼠的空肠蛋白中提取细胞因子。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测定。(3 ～4只/组)。**，P<0.05vsIR+DMEM-F12。##，相对于IR+RG1-MSC-CM， P＜0.05。图8D具体显示了中和选定细胞因子(上图)或添加的外源(下图)细胞因子对受辐照大鼠的存活的影响。使用Kaplan-Meier方法分析累积生存率。通过对数秩检验确定P值。每组中的大鼠数量显示在括号中。图 8E具体显示了平均生存时间。数据代表平均值±SD。**，相对于IR+ DMEM-F12，P＜0.05。##，相对于IR+RG1-MSC-CM，P＜0.05。

8)、IL-6和VEGF的治疗作用部分由HO-1的上调介导。

由于HO-1的诱导可以改善RIII，IL-6/VEGF可以调节HO-1的表达 (Abbasoglu等人，2006；Giris等人，2006；Siner等人，2007；Yamaji等人等人， 2008)，我们接下来研究了IL-6和VEGF在体外对HO-1表达的影响。如蛋白质印迹所示，与对照组相比，辐射显着下调了IEC-6中HO-1的表达(P ＜0.05)(图9A)。与IR+DMEM-F12组相比，RG1-MSC-CM和IL-6+VEGF组中HO-1的表达明显上调(P＜0.05)(图9A)，而ZnPP则相反。为了进一步研究HO-1是否负责RIII中IL-6+VEGF的治疗作用，我们评估了细胞凋亡，NF-kB结合活性，急性肠粘膜炎症的产生者(Hang等，2005)和细胞 IEC-6的可行性。如图8B-8E所示，ZNPP部分抑制了IL-6+VEGF对细胞凋亡，NF-kB结合活性和IEC-6细胞活力的治疗作用。这些发现表明IL-6 和VEGF对RIII的治疗作用至少部分地以HO-1依赖性机制介导(图9B-E)。

其中，图9A具体显示了在辐射后第3天，以β-肌动蛋白作为内部对照，通过蛋白质印迹法检测IEC-6中HO-1的蛋白水平。数据代表平均值±SD(n＝3)。＊，相对于IR+DMEM-F12，P＜0.05。#，相对于对照，P ＜0.05。##，相对于IR+IL-6+VEGF，P＜0.05。图9B具体显示了HO-1的抑制部分抑制IL-6+VEGF对IEC-6凋亡的治疗作用。辐射后后第3天用 PI/AnnexinV染色测定IEC-6细胞的凋亡率。数据代表三个独立实验的平均值±SD。＊＊，相对于IR+IL-6+VEGF，P＜0.05。##，相对于IR+ DMEM-F12，P＜0.05。图9C具体显示了通过PI/Annexin V染色在第1、3、 5、7天时测定细胞凋亡IEC-6细胞的比例。实验数据代表三个独立实验的平均值±SD。##，相对于IR+IL-6+VEGF，P＜0.05。图9D具体显示了通过针对NF-κB的p65亚基的基于ELISA的测定法测量IEC-6中的 NF-κBp65的活性。数据代表平均值±SD(n＝3)。##，相对于IR+ DMEM-F12，P＜0.05。＊＊，相对于IR+IL-6+VEGF，P＜0.05。图9E具体显示了在放射后第0天至第7天通过CCK-8检测细胞活力。##，相对于 IR+IL-6+VEGF+ZNPP，P＜0.05。数据代表三个独立实验的平均值±SD。

9)、RG1-MSC的优异旁分泌作用部分由HO-1介导。

研究表明，HO-1的过表达增强了BM-MSC的旁分泌作用，抗凋亡和抗炎能力，我们进一步探讨了HO-1是否在RG1介导的RIII上级旁分泌作用中起重要作用。如图10A所示，RG1显着增加HO-1的表达，而 600nmol/LHO-1siRNA显着下调HO-1的表达，而NS-KD-RG1-MSC-CM组则没有下降(图10A)。为了进一步探讨HO-1在RG1-MSC的超旁分泌作用中的作用，我们检测了BM-MSC中3种上调的旁分泌因子的分泌和mRNA。敲除BM-MSC中的HO-1可部分消除VEGF和IL-6在分泌和mRNA表达中的表达(图10B、10C)。体外的发现促使我们进一步探索这种改变是否可以在体内实施。尽管RG1-MSC-CM改善了肠道增殖，细胞凋亡和NF-kB结合活性以及受辐照大鼠的存活率，但在BM-MSC中敲低HO-1却部分消除了这些作用(图10D，10E，10F，10G)。这些结果表明RG1-MSC在RIII中的优异的旁分泌作用部分地由HO-1介导。

其中在RG1刺激之前，用不同剂量的HO-1siRNA和非特异性siRNA 转染MSC。评估BM-MSCs的HO-1(如图10A)蛋白水平，VEGF，IL-6 和IL-10的分泌(如图10B)和mRNA表达(如图10C)。相对于对照，P＜0.05，相对于RG1-MSC-CM，＊＊，P＜0.05。NS-KD-RG1-MSC-CM：来自被RG1激活的非特异性siRNA转染的MSC的条件培养基。HO-1-KD-RG1-MSC-CM： RG1激活的HO-1siRNA转染的MSC的条件培养基。 HO1-KD-RG1-MSC-CM的施用部分废除了RG1-MSC-CM对体内照射的肠上皮细胞凋亡(如图10D)和增殖(如图10E)的治疗作用，这通过定量TUNEL 阳性来评估肠中的PCNA和PCNA阳性细胞。##，相对于IR+DMEM-F12， P＜0.05。＊＊，相对于IR+RG1-MSC-CM，P＜0.05。如图10F，在实验的第3天，通过针对NF-κB的p65亚基的基于ELISA的测定法来测量肠中 NF-κBp65的活性。数据代表平均值±SD(n＝3)。##，相对于IR+ DMEM-F12，P＜0.05。＊＊，相对于IR+RG1-MSC-CM，P＜0.05。如图10G，通过施用HO1-KD-RG1-MSC-CM部分地提高了提高14天存活率的能力。 ##，相对于IR+DMEM-F12，P＜0.05。＊＊，相对于IR+RG1-MSC-CM，P ＜0.05。除另有说明外，所有数据均通过t检验或单因素方差分析进行分析。

上述结论证实了RG1可以增强BM-MSC对RIII的旁分泌作用，并至少表明：

一、RG1-MSC-CM而非MSC-CM通过调节肠道再生改善了存活率并促进了RIII的结构和功能恢复，炎症和血管生成；

二、RG1增强了BM-MSCs分泌的VEGF和IL-6，因此对RIII具有优越的治疗作用；

三、IL-6和VEGF对RIII的保护作用是通过HO-1依赖性机制部分介导的；

四、RG1-MSC的优异旁分泌作用部分由HO-1的上调介导。

本发明证明了RG1增强了BM-MSC的旁分泌潜能，人参皂苷RG1已被证明可以优化MSC的生物学特性。先前的研究表明，RG-1在保护干细胞免受辐射损伤等损害以及促进MSC的增殖和分化中起着重要作用。最近，一项研究报道了RG-1可以在体外增强ASC的旁分泌活性。在本发明的研究中，我们发现RG-1以剂量依赖性方式增强了BM-MSC的旁分泌活性。 1μM是RG-1增强BM-MSC旁分泌活性的最佳剂量，与较低的RG-1浓度相反，过量使用RG-1(≥100μM)可能会抑制BM-MSC的旁分泌作用，这与以前的发现一致，即100μMRG-1会抑制ASC的生物学功能并诱导小鼠胚泡细胞的凋亡。也就是说，增强BM-MSC旁分泌活性的RG1最佳剂量为 1μM，安全阈值应低于100μM。

本发明发现RG1-MSC-CM对RIII具有有益的作用。正如研究过程表明的那样，RG1-MSC-CM而非MSC-CM通过调节肠增殖/凋亡，炎症，血管生成和干细胞再生对RIII提供保护作用。这些发现与其他研究中的MSC移植相似，表明RG1-MSC-CM是无细胞替代品，与MSC移植一样有效。

为了探究RG1-MSCs旁分泌潜力增强的潜在机制，我们检测了有和没有RG1的MSC-CM中旁分泌因子是否存在差异。我们发现RG1-MSC-CM 中VEGF和IL-6的水平显着升高。进一步的中和实验证实，VEGF和IL-6 是RG1-MSC-CM介导的RIII恢复的关键因素。VEGF和IL-6的联合输注具有与RG1-MSC-CM相当的治疗效果，这表明IL-6和VEGF的联合使用可能是RIII的另一种有希望的治疗策略，VEGF和IL-6可能在RIII中起重要作用。例如，IL-6改善鼠结肠炎肠道中的细胞增殖并调节隐窝稳态，而IL-6 的阻断会加剧局部放疗后肠道的急性和晚期损伤。VEGF是血管生成的主要介质，在全身照射后可恢复肠道，而与照射小鼠相比，抗VEGF抗体的给药会加重肠道损伤。

本发明还发现RG1-MSC对RIII的优异旁分泌作用部分由HO-1介导。 HO-1是一种在MSC中以非常低的水平表达的细胞保护蛋白，可以通过诸如炎症，药物之类的刺激来诱导。其中HO-1的过表达能够增强MSC的抗凋亡，抗氧化，免疫调节，旁分泌能力，而MSC的HO-1沉默则逆转了这些作用。本发明表明，RG1刺激显着上调了BM-MSC中HO-1的表达，并且使用HO-1siRNA可以部分消除治疗效果。因此RG1-MSC对RIII的优异的旁分泌作用部分由HO-1介导。然而，即使在使BM-MSC中的HO-1沉默后，仍可以观察到改善的治疗效果以及旁分泌活性，这表明需要探索其他机制。

最后，本发明给出了IL-6和VEGF对RIII的治疗作用所涉及的具体机制。多项研究表明，HO-1的诱导在细胞保护肠道损伤中起着重要的作用。此外，IL-6或VEGF可以刺激HO-1的表达。在本发明的研究中观察到在 RG1-MSC-CM和VEGF+IL-6组中HO-1均被上调。ZNPP对HO-1的进一步阻断部分抑制了IL-6和VEGF的治疗作用，这表明IL-6和VEGF介导的恢复部分是通过HO-1依赖性机制实现的。

综上所述，RG1通过HO-1依赖性机制增加BM-MSC中关键因子 VEGF/IL-6的分泌，从而促进RIII的恢复，本发明的研究揭示了RG-1在增强BM-MSC生物学功能方面的新作用，为RIII的干细胞治疗提供了一种选择。

虽然本发明以较佳实施例揭露如上，但并非用以限定本发明实施的范围。任何本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的发明范围内，当可作些许的改进，即凡依照本发明所做的同等改进，应为本发明的范围所涵盖。