一种基于核酸适体与酶促靶标循环的荧光三磷酸腺苷传感器

摘要

本发明公开了一种基于核酸适体与酶促靶标循环的荧光三磷酸腺苷传感器的制备方法，以羧基荧光素(FAM)为能量供体，金纳米粒子(AuNPs)为能量受体。分别使用ATP适体以及与ATP适体碱基互补的单链DNA分别标记AuNPs与FAM。将上述两段标记好的单链DNA相互杂交后，得到荧光ATP适配体传感器。检测时，ATP会打开传感器杂交结构，迫使ATP适体3’和5’端互相杂交，形成茎环结构，FAM的荧光恢复。加入Exo III酶会促使ATP适体水解，ATP释放出来重新进入检测循环，体系的荧光继续增强直至检测体系内所有的荧光传感器被消耗完毕。由于ATP靶标的循环使用，导致本传感器具有较低的检测限和较高的灵敏度。

说明书

技术领域

本发明涉及生物传感器技术领域的制备方法，具体涉及一种基于核酸适体与酶促靶标循环的荧光三磷酸腺苷(ATP)传感器及其制备方法，并将其用于对ATP的检测。

背景技术

核酸适体是一类拥有特定碱基序列的寡核苷酸分子，近年来研究发现，寡核苷酸不仅具有遗传信息的储存和传递功能，还可以通过空间折叠形成三维结构并与不同类型的靶标(例如：小分子、病毒和细菌等)形成特异性杂交，这意味着非寡核苷酸(例如蛋白)也可以寻找到具有特定碱基序列的寡核苷酸并与之进行特异性结合，并能达到很高结合力，甚至会高于抗体与抗原的结合力。此时，这种特定碱基序列的寡核苷酸被称之为“适体”，而靶标称之为“配体”。目前发现，金属离子、小分子、氨基酸、辅酶、多肽、蛋白质、病毒和细菌等各种靶标都可以寻找到高结合力的适体。因此，可以将核酸适体作为敏感单元开发各种生物传感器。参与生命过程的小分子三磷酸腺苷(ATP)在细胞中的浓度与癌症等疾病密切相关，ATP是活细胞中的通用能源，在细胞生理中调节细胞代谢和生化途径中起着至关重要的作用。ATP水平可用于评估各种小分子药物和生物制剂诱导的细胞损伤，抑制和增殖，异常的ATP水平已与特定疾病(如心血管疾病)相关，因此，它已被广泛用作活生物体中细胞活力和细胞损伤的指示剂。因此，ATP的检测在疾病诊断及分子生物学的功能分析方面都具有十分重要的意义。

虽然基于核酸适体的电化学、表面拉曼增强等信号增强手段的生物活性小分子适配体传感器已经达到极低的检测限(pM～nM)，但若要进行细胞成像等原位观察，还需使用基于荧光信号的生物传感器。以荧光ATP适配体传感器为例，目前已报到的传感器检测限一般处于nM～μM，远高于荧光DNA生物传感器的检测限，这是由于一条ATP适体能够与两分子ATP结合，且ATP与其适体的解离常数在μM级别，从而在总体上限制了传感器的灵敏度。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明所要解决的技术问题是克服现有ATP荧光生物传感器检测限较低，一般＞10nM左右的问题。

(二)技术方案

本发明的技术方案是：将ATP适体的碱基序列设计为可3’和5’端互相杂交的单链DNA(ssDNA

(三)具体反应过程

本发明所述的一种基于核酸适体与酶促靶标循环的荧光三磷酸腺苷传感器及其制备方法包括以下步骤：

1.制备金纳米粒子：

将500mL烧杯消毒洗净后待用，将二次水加入到500mL烧杯中，再加入氯金酸，加热至沸腾，加入柠檬酸三钠，待溶液由黄绿色变为灰变蓝色再变为紫色，最后变成酒红色时停止加热，自然冷却至室温后离心，倒掉上清液，然后加二次水超声洗涤后离心，取下层油状沉淀加二次水至100mL，即配成一定浓度的金纳米粒子溶液。

2.苯基磷化二钾盐(BSPP)稳定的金纳米粒子：

将步骤1中制备的金纳米粒子的溶液，加入30mg的BSPP，静置8h后离心，弃去上清液，用0.5×TBE缓冲液定容，得到BSPP稳定的金纳米粒子。

3.制备单链ssDNA修饰的金纳米粒子(Au-ssDNA

使用如下碱基序列的巯基修饰单链ssDNA对不同粒径的金纳米粒子进行修饰，得到Au-DNA

所用ssDNA的序列如下：

编号序列(3’-5’)碱基长度

ssDNA

将AuNPs和ssDNA

4.传感器的制备：

使用如下碱基序列的羧基荧光素(FAM)修饰的单链ssDNA与Au-DNA

所用ssDNA的序列如下：

编号序列(3’-5’)碱基长度

ssDNA

将适量ssDNA

5.酶辅助循环放大检测ATP：

在混合溶液里加入不同浓度的靶标分子ATP，然后在37℃下孵育后加入Exo III酶进行靶标循环反应，调节缓冲溶液的pH，在37℃下孵育一定时间，测试荧光强度。

一种荧光生物传感器，采用上述制备方法制得的基于核酸外切酶III--荧光探针构建的荧光传感平台。

上述荧光ATP传感器的用途，用于对不同浓度的ATP检测。

与目前现有技术相比，本传感器的制备方法简单，检测灵敏度高，检测限低。上述的荧光检测体系对ATP检测，具有较好的特异性度，检出限为3.35nM，具有较低的检出限和较高的灵敏度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明的检测方法的原理示意图。

图2是16nm金纳米粒子的透射电子显微镜表征图。

图3是32nm金纳米粒子的透射电子显微镜表征图。

图4是本发明实验原理可行性证明图。

图5是本发明荧光检测体系不同浓度ATP对应的荧光光谱图。

图6是本发明荧光检测体系对不同浓度ATP检测的线性检测结果图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

下面结合具体实施例，对本发明的内容作更细致地阐述：

一种基于核酸适体与酶促靶标循环的荧光三磷酸腺苷传感器，具体通过如下技术方案实现：本发明所述的荧光传感器基于荧光共振能量转移原理，以羧基荧光素(FAM)为能量供体，金纳米粒子(AuNPs)为能量受体。分别使用ATP适体以及与ATP适体碱基互补的单链DNA分别标记AuNPs与FAM。将上述两段标记好的单链DNA相互杂交后，得到荧光ATP适配体传感器。检测时，ATP会打开传感器杂交结构，迫使ATP适体3’和5’端互相杂交，形成茎环结构，FAM的荧光恢复。加入Exo III酶会促使ATP适体水解，ATP释放出来重新进入检测循环，体系的荧光继续增强直至检测体系内所有的荧光传感器被消耗完毕。由于ATP靶标的循环使用，导致本传感器具有较低的检测限和较高的灵敏度。

实施例1：

(1)合成粒径为16nm(Au

将氯金酸配置成质量分数为1％的溶液，柠檬酸三钠配置成质量分数为1％的溶液，500mL烧杯消毒洗净后待用，将100mL二次水加入到500mL烧杯中，再加入1mL氯金酸，加热至沸腾，分别加入3mL和2mL柠檬酸三钠，待溶液由黄绿色变为灰变蓝色再变为紫色，最后变成酒红色时停止加热，自然冷却至室温后分别用9000r/min和8000r/min离心20min，倒掉上清液，然后加二次水超声洗涤后离心，取下层油状沉淀加二次水至100mL，可以分别得到粒径为16nm的Au

(2)制备单链ssDNA修饰的金纳米粒子

将AuNPs和ssDNA

实施例2：

ATP荧光适体传感器的检出限

用制备好的ATP荧光适体传感器进行检测，荧光强度变化ΔF与目标ATP浓度的关系曲线如图5所示。线性方程分别为ΔF＝0.063916*C-0.29853(nM，R

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。