一种检测miRNA的方法及一种用于检测miRNA的生物探针

摘要

本发明提供了一种检测miRNA的方法，其包括如下步骤：(1)制备PEG修饰的AuNPs，得AuNPs‑PEG；(2)根据待测miRNA的序列合成与之序列完全配对的DNA片段，此DNA片段5’端连接有亲和素，3’端依次连接含有3‑10个碱基序列及linker、‑SH，形成目标miRNA的DNA探针，linker含有至少一个亚甲基；(3)将上述步骤中的DNA探针与AuNPs‑PEG反应，得PEG‑AuNPs‑DNA probe；(4)将含有或不含有目标miRNA的样本、DSN buffer、DSN、RNase抑制剂、PEG‑AuNPs‑DNA probe进行反应；(5)终止反应，向反应系统中加入链霉亲和素包被的磁性颗粒，进行磁分离，收集磁分离后的溶液，定量检测AuNPs的含量。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测miRNA的方法及一种用于检测目标miRNA的生物探针，属于生物技术领域。

背景技术

miRNA的序列片段短、在家族成员之间的序列高度相似，这些特点使miRNA的定量超灵敏检测颇具挑战性，常规的核酸检测方法为qRT-PCR，但该方法操作复杂，对于低浓度miRNA检测，会有较强的背景干扰。

双链特异性核酸酶(DSN)是一种能高效识别并酶切完全互补配对的DNA双链或者DNA/RNA杂交双链中的DNA链，而对单链DNA和单/双链RNA几乎没有作用的核酸酶，且具有容易修饰，催化效率高，化学稳定性好等优点，在miRNA的检测中应用广泛。

已报道的基于DSN的miRNA检测方法包括荧光检测、量子点检测等。荧光检测背噪较多，量子点检测通常需要用到有毒的镉。总之，简单方便且效果好的检测方法仍待开发。

发明内容

本发明提供了一种检测miRNA的方法，其包括如下步骤：

(1)制备PEG修饰的AuNPs，得AuNPs-PEG；

(2)根据待测miRNA的序列合成与之序列完全配对的DNA片段，所述DNA片段5’端连接有亲和素，3’端依次连接含有3-10个碱基序列及linker、-SH，形成目标miRNA的DNA探针，linker含有至少一个亚甲基；

(3)将上述步骤中的DNA探针与AuNPs-PEG反应，得PEG-AuNPs-DNA probe；

(4)将含有或不含有目标miRNA的样本、DSNbuffer、DSN、RNase抑制剂、PEG-AuNPs-DNAprobe进行反应；

(5)终止反应，向反应系统中加入链霉亲和素包被的磁性颗粒，进行磁分离，收集磁分离后的溶液，定量检测AuNPs的含量。

优选地，步骤(1)中，AuNPs采用柠檬酸钠还原法制备；AuNPs-PEG的制备方法为：硅基材料经羟基活化、氨基化之后，与AuNPs溶液反应，去除未结合的AuNPs，与HS-PEG-COOH溶液反应，去除多余的HS-PEG-COOH，超声洗涤，即得AuNPs-PEG。

优选地，步骤(2)中，3’端连接5个相同的碱基序列，linker为3～6个亚甲基。

优选地，步骤(4)中，针对以下反应体系：总反应体积100μL:10nM PEG-AuNPs-DNA，1xDSN buffer，4U RNAase抑制剂，10pM目标miRNA，0.3U DSN，反应体系的温度为45～55℃，DSN浓度为0.4～0.5U，反应时间为80～100min，链霉亲和素磁珠体积为10～20μL。

优选地，步骤(5)中，采用ICP-MS方法检测。

本发明还提供了一种用于检测目标miRNA的生物探针，其包括如下结构：

(1)一段DNA片段，其能与目标miRNA的序列完全配对；

(2)与上述DNA片段一端相连的亲和素，

(3)与上述DNA片段另一端依次相连的3-10个碱基序列及与其相连的linker、-SH片段，linker含有至少一个亚甲基；

(4)与-SH相连的AuNPs。

优选地，亲和素连接在DNA片段的5’端，3-10个碱基序列、linker、-SH片段依次连接在DNA片段的3’端，linker为3-6个亚甲基。

优选地，AuNPs上有PEG修饰。

本发明还提供了上述的生物探针在检测生物样本中目标miRNA的应用。

本发明进一步提供了一种用于检测MiR-155的生物探针，其包括如下结构：

(1)5’-SEQ NO.1-3’-linker-SH，所述linker为3-6个亚甲基；

(2)与-SH相连的AuNPs。

优选地，上述SEQ NO.1的序列为:ACCCCTATCACAATTAGCATTAATTTTT.

附图说明

图1DNA和PEG非对称修饰金探针的制备流程图

图2DSN酶介导的miRNA检测方法原理图

图3检测体系反应温度的优化结果

图4检测体系DSN浓度的优化结果

图5检测体系反应时间的优化结果

图6链霉亲和素磁珠体积优化结果

图7反应体系特异性的验证结果

图8反应体系的标准曲线

图9尿液样本中miR-155的检测结果

具体实施方式

下面以具体实施例的方式对本发明进一步进行说明，但不应理解为对本发明的限制。

实施例一、生物探针的制备

Table 1核酸序列

1柠檬酸钠还原法制备AuNPs

所有的玻璃仪器用王水(V

2非对称AuNPs-PEG探针的制备

(1)将2.4cm×2.4cm的盖玻片浸泡于“食人鱼”溶液(30％H

3DNA和PEG非对称修饰的AuNPs探针的制备

首先将100μL 100μM的DNAprobe与10μL 10mM的三(2-羧基乙基)磷盐酸盐(TCEP)混合，室温避光放置1h。随后将DNA溶液加入到上述的2mL AuNPs-PEG溶液中，混匀后室温避光放置16h-24h。然后，向其中依次加入20μL 0.5M Tris-acetate(pH 8.2)使溶液终浓度为5mM，并在搅拌下继续向其中逐滴加入500μL 1M NaCl，室温避光静置老化24h。最后，将其于16000g离心20min，使PEG-AuNPs-DNAprobe完全沉积于EP管底部，并用Tris-acetate(含0.1M NaCl,pH 8.2)洗涤两次，并最终分散于Tris-acetate(含0.1M NaCl,pH 8.2)溶液中，置于4℃保存备用。

制备方法简图如附图1所示。

实施例二、DSN酶介导的miRNA检测方法建立

检测原理介绍：本发明方法的建立依赖DSN酶独特的性质：即能高效识别并酶切完全互补配对的DNA双链或者DNA/RNA杂交双链中的DNA链，而对单链DNA和单/双链RNA几乎没有作用，使其在miRNA检测中表现出独特的优势。而且其对完全互补配对和不完全配对的短的双链杂交物的区分，可以实现单碱基的区分，因此它对miRNA的检测具有很强的特异性。无需进行核酸的扩增，在等温下，30min内就可将检测信号放大5个数量级。

检测方法：配制总体积为100μL的反应液，其中包含1xDSN buffer(50mM Tris-HCl，pH 8.0,5mM MgCl

检测原理如附图2所示。

实施例三、检测方法的优化

1检测体系反应温度的优化

对于DSN酶在较高温度下，其活性会降低甚至失活。同时温度对miRNA于DNAprobe的杂交及解离也会有一定的影响。因此我们对反应的体系的最佳反应温度进行了优化。

反应体系：总反应体积100uL:10nM PEG-AuNPs-DNAprobe，1xDSN buffer，4URNAase inhibitor，10pM miR-155，0.3U DSN，不同温度下反应时间100min。

当反应温度在25℃和55℃之间时，检测信号随着反应温度升高而逐渐增加；当温度从55℃继续升高时，检测信号逐渐降低。一般来说，当体系温度低于Tm时5-10℃时更有利于核酸链的杂交，同时考虑到较高温度不利于PEG-AuNPs-DNAprobe的稳定，因此优选反应温度为45℃。

2检测体系DSN浓度的优化

该体系中，PEG-AuNPs-DNAprobe与miRNA的杂交/切割循环可以一直进行，直到所有的PEG-AuNPs-DNAprobe上的DNAprobe被切割完。因此，DSN酶的浓度可以影响体系的反应速率。当DSN酶浓度高时，反应速率会很快，反之，会比较慢。首先，我们利用该反应体系优化了DSN浓度，反应体系：总反应体积100μL:10nM PEG-AuNPs-DNA probe，1xDSN buffer，4URNAase inhibitor，10pM miR-155，于不同DSN浓度在45℃反应100min。

当DSN浓度由0.1U逐渐升高至0.5U时，检测信号逐渐增大，但当浓度增至0.4U和0.5U时，反应速率逐渐降低，因此优选DSN浓度最终选择为0.4U。

3检测体系反应时间的优化

随着反应时间的增加，PEG-AuNPs-DNAprobe的浓度会逐渐减少，当其浓度降低到一定值时，体系的反应速率会降低，此时增加的检测信号与miRNA的浓度就不具有线性关系，因此我们对反应体系的反应时间进行了优化。反应体系：总反应体积100μL:10nM PEG-AuNPs-DNA，1xDSN buffer，4U RNAase inhibitor，10pM miR-155，0.4U DSN，于45℃下反应不同时间。

反应时间20-100min内，其反应速率基本上相同；当反应时间超过100min时，其反应速率开始逐渐下降。因此，因此优选反应时间选择为100min。

4链霉亲和素磁珠体积优化

在该反应体系中，最终需要用足够量的链霉亲和素磁珠将未参与反应的PEG-AuNPs-DNAprobe吸附除去。因此，需要对链霉亲和素磁珠的体积进行优化。

当反应体系中不含有miRNA时，PEG-AuNPs-DNAprobe全部未有参与反应，因此PEG-AuNPs-DNA probe含量是最高的。于是，用100μL 10nM PEG-AuNPs-DNAprobe对链霉亲和素磁珠的体积进行优化。

当链霉亲和素磁珠体积由5μL逐渐增加至20μL时，检测信号降到最低；当逐渐将体积增加至25μL时，检测信号未有变化。因此，将链霉亲和素的体积选定为20μL。

5反应体系特异性的验证

同时，对该反应体系在miR-155的特异性检测上进行了验证。利用已优化的条件，对五种miRNA分别检测(miR-155、miR-223、miR-181a、单碱基错配mismatch 1和双碱基错配mismatch 2)。

由附图7可知，该体系对miR-155有很好的特异性，其归功于DSN对杂交错配很好的识别能力，其可以很好的区分互补和错配的DNA-miRNA杂交链。

6反应体系标准曲线的建立

将miR-155干粉溶于DECP水中配制100uM储备液，并依次稀释以配制不同的miR-155标准溶液：0、1fM、5fM、10fM、50fM、100fM、500fM、1pM、5pM、10pM。然后按照已优化的方法，对不同浓度miR-155进行检测，每种浓度重复3次。

检测结果如附图8，其线性方程为Y＝188.2x+91183.1(R2＝0.997)，线性范围为1fM-10pM，检测限为0.47fM。

实施例四、样品检测

我们对20位非肌肉浸润性膀胱癌(NMIBC)和20位健康志愿者的去除细胞的尿液样品直接进行检测，结果发现相对于健康者，患者尿液中miR-155含量有显著升高(如附图9)，预示这其可能作为非肌肉浸润性膀胱癌的潜在诊断标记物。

上述表明，本发明可有效地检测目标miRNA，检测方法简单，特异性强，敏感度高，为生物样品的检测及疾病的诊断提供了一种较好的新方法。

SEQUENCE LISTING

<110> 澳门科技大学

<120> 一种检测miRNA的方法及一种用于检测miRNA的生物探针

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> DNA probe

<400> 1

acccctatca caattagcat taattttt 28

<210> 2

<211> 23

<212> RNA

<213> MiR-155

<400> 2

uuaaugcuaa uugugauagg ggu 23

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> MiR-223

<400> 3

ugucaguuug ucaaauaccc ca 22

<210> 4

<211> 23

<212> RNA

<213> MiR-181a

<400> 4

aacauucaac gcugucggug agu 23

<210> 5

<211> 23

<212> RNA

<213> Mismatch 1

<400> 5

uuaauccuaa uugugauagg ggu 23

<210> 6

<211> 23

<212> RNA

<213> Mismatch 2

<400> 6

uuaaagcuaa uuaugauagg ggu 23