含有环孢素胶束的原位凝胶作为缓释眼科药物递送系统

摘要

本发明提供了一种含有环孢素胶束的原位凝胶作为缓释眼科药物递送系统，其含有0.01重量％‑5重量％的环孢素的水性眼用制剂，其以胶束的形式存在，其粒径不大于20nm。

说明书

技术领域

本发明属于药品技术领域。

背景技术

干眼症，也称为干燥性角膜结膜炎，是由多因素和复杂原因引起的泪液质或量或流体动力学异常，导致泪膜稳定性下降，并伴有眼部不适和/或眼表组织病变特征的多种疾病的总称。干眼症最常见的症状是眼睛灼热，疼痛和发红。其他常见症状包括眼睛流泪或有丝状物粘附。干眼症与多种因素有关，其发生率为7.4％～33.7％，其中50岁以上女性的患病率约为男性的两倍。参见，JL Gayton，J.Clinical Ophthalmology(Auckland，NZ)，2009，3：405.Schaumberg DA，Sullivan DA，Buring JE，et al.Prevalence of dry eye syn-drome among US women.American journal of ophthalmology，2003,136(2):318–326。

眼泪具有三层：油性外层，水性中间层和内粘液层。如果产生泪液各种成分的腺体发炎或没有产生足够的水，油或粘液，则可能导致干眼症。当眼泪中缺少油脂时，眼泪会迅速蒸发，无法保持稳定的水分供应。其他常见症状包括干眼，眼睛疲劳，眼睛发痒，异物感，灼热感，粘稠的分泌物，对风，光和其他外部刺激敏感。有时眼睛过于干燥，无法拥有足够的基础眼泪，但仍然能够刺激反射性眼泪的分泌，从而导致流泪过多。对于更严重的患者，眼睛会发红肿胀，充血，角化，角膜上皮剥落以及随后的细丝粘连。这些损害会导致角膜和结膜病变并影响视力。眼睛干涩的最初症状是缺乏眼泪以润滑眼睛。没有及时有效的治疗，它很容易发展成难治性干眼症，导致角膜炎和角膜溃疡，甚至失明。

随着视频终端和空调设施在住宅和商业环境中的广泛使用，干眼症已成为全球流行病。目前，对眼表疾病的认识不足会影响患者的生活质量。干眼症的发病率可能更高，并且随着对技术的依赖和使用的增加，年轻一代中的干眼症也会逐渐增加。

近年来，干眼症的患病率(患者在有干眼症的人数中所占的百分比)约为5-34％。在美国，患病率相对较低(7％)。由于地理和其他因素，中国约有7500万人患有干眼病。中国的患病率约为21-30％，年增长率约为10％。随着人口的老龄化，这个数字在未来有望大大增加。

干眼症的传统治疗方法是人工泪液和泪管栓塞植入物。对于干燥综合征，使用与炎症有关的类固醇或非类固醇抗炎药，例如皮质类固醇，四环素，环孢素等。参见，Mohammad-Ali J，Sepehr F.Dry Eye Syndrome.J Ophthalmic Vis Res，2011，6(3):192–198。

尽管干眼的病理机制尚不清楚，但通常认为炎症是由影响泪腺和眼球表面的有害细胞因子和受体介导的。通过检查干眼综合征患者的泪腺，结膜活检标本，泪液和眼表印象细胞学检查，还发现炎症反应标志物(如炎症细胞浸润)的表达与干燥严重程度相关。

因此，抗炎药和免疫抑制剂可以有效治疗干眼症并伴有眼表炎症。

环孢素A(CsA)，也称为环孢素或环孢素(结构如上所示)，是由11个氨基酸组成的环状多肽化合物，其是从多孢木霉和Trichosporum的代谢产物中纯化的。通常认为它是一种强大的免疫抑制剂。环孢素治疗干眼症的主要机制是抑制泪腺腺泡细胞和结膜杯状细胞的凋亡，促进淋巴细胞的凋亡，抑制眼表炎症，从而有效治疗干眼症。全身性环孢霉素的给药受血眼屏障因素影响。它的眼生物利用度低，并且可能引起并发症，例如肾脏损害，中枢神经系统损害，肝脏损害和高血压。因此，全身性环孢霉素的应用受到很大限制。诸如眼药水等局部给药方法可以避免这些毒性和副作用。

环孢素具有免疫抑制作用，并且可以抑制T淋巴细胞的活化和分化。它主要影响钙调神经磷酸酶(CaN)/NF-AT途径。其主要机制是环孢素与T细胞(CyPA)中的亲环素A选择性相互作用，并且形成的CsA-CyP复合物作用于CaN，使CaN的去磷酸化活性失活，抑制细胞质NF-AT的核内转移，从而抑制多种细胞因子基因，如白介素2(IL-2)并最终抑制T细胞的分化和激活。干眼症患者用0.05％CsA滴眼液治疗6个月后，结膜上皮细胞，CD3+，CD4+，CD8+细胞，CD11a和HLA-DR细胞的数量显着减少(P<0.05)。参见，KS Kunert et al.,Archives ofOphthalm.,2000,118(11):1489-1496.在动物研究中发现，当用Sjogren型KCA处理时，环孢素可抑制泪腺腺细胞和结膜上皮细胞的凋亡，并促进淋巴细胞凋亡。环孢霉素处理后，p53蛋白免疫活性降低，bcl-2水平升高。参见Gao et al.,Cornea,1998,17(6):654.Moore etal.通过去除泪腺建立了犬角膜结膜干燥症模型。连续施用2％环孢素4周，粘膜内粘蛋白浓度显着增加(P<0.05)。参见CP Moore et al.,Investigative Ophthalm.&Visual Sci.,2001,42(3):653-659.结膜炎的症状得到缓解，表明在不影响泪腺的情况下，环孢素对结膜杯状细胞黏蛋白分泌功能的恢复有影响，这可能是环孢素治疗干眼症的重要因素。增加泪液流动的机制是环孢素刺激感觉神经末梢释放神经递质P物质，并通过P物质激活毒蕈碱受体，从而增加泪液分泌。A.Yoshida et al.,Exp.Eye Res.,1999,68(5):541-546.

美国专利8,629,111、8,648,048、8,685,930和9,248,191公开了乳剂形式的环孢素眼科药物。由于环孢素不溶于水，因此开发了0.05％环孢素

在过去的15年中，人们付出了巨大的努力来进一步提高环孢素的生物利用度，以提高安全性和疗效，但并未取得太大的成功。美国专利号8,980,839描述了一种新的环孢素溶液制剂，其在混合的纳米胶束中包含多羟基脂质或脂肪酸和多烷氧基化醇。这个商业化产品的

基于亲脂性和亲水性，药物主要通过跨细胞和旁细胞途径穿透角膜上皮(参见,E.Toropainen et al.,European J.of Pharmaceutical Sciences,2003,20(1):99-106)。亲水性化合物通过细胞间隙途径渗透，这受细胞间隙的孔隙度和孔径大小的影响，而偏中性化合物和疏水性化合物的渗透分别通过表皮跨细胞途径和基质途径(参见A.Edwards etal.,Pharm.Res.,2001,18(11):1497-1508)。环孢素A(CsA)是一种中性，亲脂性的环状十一肽。在没有任何处理的情况下，CsA通过跨细胞途径吸收(参见K.Kawazu et al.,Investigative Ophthalm.&Visual Sci.,1999,40(8):1738-1744).但是，一旦将其包裹在胶束中，胶束的亲水表面将使其主要通过细胞间隙途径渗透。

大量有关使用纳米技术增加难溶性药物的角膜通透性的相关研究材料(参见F.Bongiovìet al.,Macromol Biosci.2017；17(12):10.1002)。这些文献都表明，制备难溶性药物纳米颗粒可以显着提高药物在角膜中的渗透效率并提高生物利用度，包括制备胶束溶液，微乳液，纳米悬浮液和乳液等。纳米粒径越小，角膜通透性越高，生物利用度越高。诸如胶束溶液的制备，微乳液，纳米悬浮液和包含小纳米颗粒的乳液等因素将具有较高的角膜通透性和较高的生物利用度。

胶束是两亲性胶体结构，粒径范围为5至100nm(参见M.Milovanovic et al.,Nanoparticles in Antiviral Therapy:Antimicrobial Nanoarchitectonics,Chapter14,2017,p.383-410.)纳米胶束粒径小于20nm的配方难以制备也没有具体的报道。因此，我们的目标是通过发现新型强大的增溶剂或组合剂来进一步减小胶束的粒径，并改善环孢素在眼中的渗透性。

艾尔建开发的

发明内容

为解决这些问题，我们用新发现的增溶剂或表面活性剂开发了可以携带环孢素形成极小的纳米胶束的新型纳米载体。由于它们的尺寸小，这些纳米载体可以将较高浓度的环孢素携带到角膜和结膜细胞中，从而提高药物功效。令人惊讶的是，当将滴眼剂滴入眼中时，一些新发现的增溶剂或表面活性剂可以与使用多糖聚合物的原位凝胶技术结合形成原位凝胶，从而增加了药物在眼表上的滞留时间，并进一步增加了药物在眼部的生物利用度。此外，原位凝胶缓释技术可进一步减少药物的不良反应，例如眼部局部刺激，疼痛和异物感。

原位凝胶递送系统可以延长药物在角膜表面的滞留时间，这有助于改善药物在眼中的生物利用度。理想情况下，原位凝胶系统是一种低粘度，在储存过程中自由流动的液体，可让滴眼液在眼部重复使用，而且操作简便。在结膜囊上给药后，滴眼液形成粘附在眼睛表面的原位凝胶。原位凝胶的粘度应足以承受眼中的剪切力并延长药物在眼前的滞留时间。缓释药物可以帮助提高生物利用度，减少全身吸收，减少用药频率，从而改善患者依从性。使用原位凝胶系统可增加药物在眼中的保留时间并延长药物的吸收。对于水不溶性药物，要使水溶性差的分子获得充分的生物利用度是一项挑战。因此，本专利的目标是开发一种含有环孢素作为活性成分的原位凝胶形成配方，并添加新型增溶剂或表面活性剂，以显着增加渗透性，从而提高人体功效并减少副作用。

胶束表面活性剂在水中以低浓度溶解并吸附到药物分子上。当表面活性剂的浓度增加到分子表面饱和并且不能再次被吸附的程度时，表面活性剂分子开始在溶液中累积。由于表面活性分子的疏水部分与水的亲和力较小，并且疏水部分之间的吸引力较大，因此许多表面活性剂分子的疏水部分相互吸引并缔合，从而形成了多分子或离子复合物，被称为胶束。这种纳米胶束配方使环孢素分子克服了溶解度的挑战，可以穿透眼睛的水层，并防止活性亲脂性分子在穿透前快速释放。胶束的粒径比普通乳液的粒径小得多。它们可以更有效地渗透到角膜中，从而增强药物功效并大大提高其生物利用度。

本发明开发了具有纳米胶束递送系统的原位凝胶的环孢素制剂，以便新的组合物可以改善药物通过纳米载体的膜运输，增加药物对生物膜的渗透性，同时改善药物的稳定性。提高药物溶解度并提供针对性的-药物传递。另外，本发明还可以通过原位凝胶药物递送系统增加滴眼剂的粘附性，并进一步改善药物在角膜表面上的滞留时间。原位凝胶和纳米胶束输送系统的成功结合克服了使用单一配方输送技术的缺点。与当前用于环孢素的纳米胶束或乳液药物递送系统相比，纳米胶束原位凝胶药物递送系统具有明显的优势。

因此，本发明一方面提供了一个包含水，环孢素和增溶剂的胶束溶液，其中所述胶束的粒度不大于20nm。合适的增溶剂的实例包括聚氧乙烯-20-十六十八醚，聚氧乙烯-15羟基硬脂酸酯，Soluplus，聚氧乙烯氢化蓖麻油，聚氧乙烯蓖麻油，维生素E聚乙二醇琥珀酸酯及其任意组合。环孢素可以以适合于预期用途的浓度例如重量的0.01％至5％的浓度包含在胶束制剂中。

另一方面，本发明提供了水性眼用制剂，其包含环孢霉素，增溶剂，渗透压调节剂，pH调节剂，粘度调节剂和水，其中包含在制剂中的环孢素和增溶剂制备的胶束粒径不大于20nm。

在一些实施方案中，水性眼用制剂还包括形成凝胶的多糖聚合物，并且在将制剂滴入眼中时，在生理温度下立刻形成凝胶，并且粘度立即增加。多糖可以以0.1％重量至0.6％重量的浓度包含在制剂中。适用于本发明制剂的多糖的实例包括脱乙酰基结冷胶(DGG)，黄原胶，藻酸钠，角叉菜胶或其任何混合物。在一些其他实施方案中，多糖包括脱乙酰基结冷胶。

在另一些实施方案中，适合于本发明的增溶剂例如为聚氧乙烯20十六十八醚，聚氧乙烯15羟基硬脂酸酯，Soluplus，聚氧乙烯氢化蓖麻油，聚氧乙烯蓖麻油，维生素E聚乙二醇琥珀酸酯或任何组合。增溶剂可以按重量计0.01％至10％的浓度包含在制剂中。

在一些实施方案中，本发明制剂中所包含的渗透压调节剂包括氯化钠，甘露醇，葡萄糖，山梨糖醇，甘油，聚乙二醇，丙二醇或其任何组合。这样的渗透压调节剂可以以重量浓度0.01％至10％包含在制剂中。

本发明的制剂可进一步包含防腐剂，其可包括例如对羟基苯甲酸丁酯，苯扎氯铵，苯扎溴铵，洗必泰，山梨酸酯，三氯叔丁醇或其任何组合。例如，制剂中的防腐剂的浓度可以为重量浓度0.01％至5％。

在一些实施方案中，本发明制剂中包含的pH调节剂包括硼酸，硼酸钠，磷酸盐缓冲剂，三甲胺，三甲胺盐酸缓冲剂，氢氧化钠，盐酸，柠檬酸，柠檬酸钠或任何组合。其制剂中包含的pH调节剂可以具有重量浓度0.01％至5％的浓度。

在一些实施方案中，制剂中的粘度调节剂的重量浓度为0.01％至5％。合适的粘度调节剂的实例包括羧甲基纤维素，羟丙基纤维素，羟乙基纤维素及其任意组合。

在一些实施方案中，本发明的制剂中所包含的胶束的平均粒径为10nm至20nm。

本发明的另一方面提供了一种在有需要的受试者中治疗或减轻干眼病或病症的症状的方法，其中该方法包括向该受试者的眼睛给药治疗有效量的眼科水制剂，或如上所述的胶束。

附图说明

图1显示了实施例1中制备的样品1的粒度和分布。

图2显示了实施例1中制备的样品2的粒度和分布。

图3显示了实施例1中制备的样品3的粒度和分布。

图4显示了实施例1中制备的样品4的粒度和分布。

图5显示了实施例1中制备的样品5的粒度和分布。

图6显示了实施例1中制备的样品6的粒度和分布。

图7显示了实施例1中制备的样品7的粒度和分布。

图8显示了实施例1中制备的样品8的粒度和分布。

图9显示了具有在实施例2中制备的凝胶基质DGG的制剂样品1至样品6的粘度变化的条形图。

图10显示了具有在实施例2中制备的凝胶基质黄原胶的制剂样品7至样品10的粘度变化的条形图。

图11显示了具有在实施例2中制备的凝胶基质卡拉胶的制剂样品11至样品14的粘度变化的条形图。

图12显示了具有在实施例2中制备的凝胶基质藻酸钠的制剂样品15至样品18的粘度变化的条形图。

图13显示了实施例3中制备的样品的粒度和分布。

图14显示了

图15显示了

图16显示了实施例3中制备的样品的体外释放曲线。

图17显示了实施例4中制备的样品的粒度和分布。

图18显示了实施例4中制备的样品、

图19显示了实施例5中制备的样品的粒度和分布。

图20显示了实施例5中制备的样品、

图21显示了实施例6中制备的样品的粒度和分布。

图22显示了在实施例6中制备的样品、

图23显示了实施例7中制备的样品的粒度和分布。

图24显示了实施例7中制备的样品、

图25显示了实施例8(样品1-3)中制备的样品、

图26显示了实施例8中制备的样品(样品4-6)、

具体实施方式

文献中有描述用于将环孢素制成胶束溶液的增溶剂，但这些配方中形成的胶束粒径均大于20nm。US 2019/0060397A1描述了将HCO(即聚氧乙烯氢化蓖麻油)与辛基酚聚醚40结合使用以形成胶束溶液的方法，我们已经证实

表1.现有技术中报道的通过增溶剂制备的胶束的粒径

为了进一步提高眼中环孢素的生物利用度，我们进行了大量实验。我们惊奇地发现几种增溶剂或某些增溶剂的组合出乎意料地导致形成了粒径小于20nm的含环孢素的胶束。

一方面，合适的增溶剂的一种类型是聚西托醇1000系列，其分子式为CH3[CH2]m[OCH2CH3]nOH，n为20～24，m为15～17。根据环氧乙烷(n)的数量的不同，它具有2个CAS编号：CAS 9004-95-9(聚乙二醇鲸蜡醚)；CAS 68439-49-6(聚乙二醇十六硬脂基醚)。聚西托醇1000系列的一种代表性成分是聚乙二醇(20)十六十八醚，它是聚西托醇1000系列中的聚氧乙烯(20)十六烷基十八烷基醚(n＝20)。聚乙二醇(20)十六十八醚被用作乳膏中的乳化剂

在另一方面，聚氧乙烯15羟基硬脂酸酯被用作微乳眼用制剂中的乳化剂。例如，商品

在另一方面，Soluplus(聚乙烯己内酰胺-乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物)是新型的增溶剂，其主要用于口服固体制剂中。Soluplus尚未用于任何已上市的滴眼液中。我们惊奇地发现浓度为0.9％以上的Soluplus可以形成具有0.05％CsA的胶束溶液，并且在不同浓度的Soluplus下形成的胶束具有约65nm的粒径。在这种胶束溶液的基础上，我们还令人惊讶地发现，该胶束溶液可以与原位凝胶结合形成胶束原位凝胶滴眼液，从而增加了胶束颗粒在眼表面的滞留时间，并提高了生物利用度，且溶液稳定。

根据我们的实验结果，发现合适的增溶体系为聚乙二醇20十六十八醚，聚氧乙烯15羟基硬脂酸酯，聚氧乙烯氢化蓖麻油，聚氧乙烯蓖麻油和维生素E聚乙二醇琥珀酸酯的任何组合。已发现这些组合对环孢素也具有良好的增溶能力，可以形成粒径小于20nm的胶束。

上述增溶剂或其混合物与0.09％环孢霉素一起使用以研究其增溶能力。还发现这些增溶剂或其混合物对环孢霉素具有良好的增溶作用，所得胶束的粒径比用

原位凝胶的环孢素纳米胶束载体与一种或多种离子敏感的原位凝胶材料如多糖一起配制，以增加药物在眼睛中的滞留时间。通过使用离子敏感性多糖(例如，结冷胶)作为凝胶基质，开发了原位凝胶局部药物递送平台。用不同浓度的结冷胶测定25℃(无人工泪液)和34℃(有人工泪液)的粘度变化，以产生体外释放曲线。只有这种优化的凝胶基质才可能形成原位凝胶。

脱乙酰基结冷胶(DGG，一种微生物来源的胞外多糖，商品名为

本发明涉及在原位凝胶基质中掺入环孢素纳米胶束，并通过以下迭代方法进一步优化制剂。

通过具体实施例进一步阐明本发明。应当理解，这些实施例包括在本文中是为了说明而不是限制本发明的范围。以下实施例中没有特定条件的实验方法通常是按照文献报道的常规条件或辅料制造商建议的条件制备的。除非特别说明，否则本发明中的所有百分比，比率，比例或分数均以重量计。除非在本发明中特别定义，否则本文所用的所有专业和科学术语具有与训练有素的人员可能熟悉的含义相同的含义。另外，与本发明中记录的方法或材料相似或等同的任何方法和材料都可以应用于本发明。本文描述的优选实施例和材料仅用于示例性目的。

实施例1：本发明所述增溶剂浓度的测定

表2列出了含有0.05％环孢素A的胶束溶液的样品：

表2.环孢素A纳米胶束溶液的样品配方

粒度和分布检测

使用粒度分析仪测试用上述配方制备的样品1至8的胶束粒度和分布或多分散指数(PDI)(表3)。结果示于图1-8，并确认按所述制备和测试的样品1-8中的胶束粒径小于

表3.样品与

实施例2：凝胶基质浓度的测定

含有0.05％环孢素A的不同原位凝胶基质溶液的样品列于下表4-7：

表4.凝胶基质结冷胶的浓度

表5.凝胶基质黄原胶的浓度

表6.凝胶基质卡拉胶的浓度

表7.凝胶基质海藻酸钠的浓度

凝胶溶液的制备方法

准确称量一定量的氯化钠，缓慢均匀地加入85克超纯水。搅拌溶液直至氯化钠完全溶解，然后在连续搅拌下缓慢均匀地加入上述胶凝基质。将此溶液放入90℃水浴中，搅拌1小时。然后将混合物冷却至室温。称量0.05g的环孢素A，并将其缓慢加入到正在搅拌的冷却溶液中。加水至最终量100g。

人工泪液的制备方法

称量碳酸氢钠：2.18g；氯化钠：6.78g；二水合氯化钙：0.084g；氯化钾：1.38g。分别溶于1,000mL去离子水中。

粘度测试方法

20mL样品溶液加入到样品瓶中，静置5分钟。然后使用旋转转子粘度计以测量25℃时的初始粘度值。在34℃下(添加40：7的人工泪液)：将20mL样品溶液加载到样品瓶中，并保持5分钟。然后旋转转子以测量初始粘度值。

分别使用粘度计在添加人工泪液之前和之后测量样品1至18的粘度。结果示于表8-11。

表8：样品1-6的黏度

表9：样品7-10的黏度

表10：样品11-14的黏度

表11：样品15-18的黏度

基于表8-11中所示的数据，我们生成了关于使用不同凝胶基质的样品与人工泪液混合之前和之后粘度变化的对比分析的条形图(参见图9至图12)。比较添加人工泪液前后在25℃和34℃时的粘度值，表明DGG具有最佳的原位凝胶特性，粘度变化最大。加入人工泪液后，制剂的粘度大大提高，而少量DGG可以达到较大的粘度值；黄原胶，卡拉胶和海藻酸钠也表现出某些原位凝胶性质。添加人造眼泪后，粘度值也已增加到一定程度，但是与结冷胶相比，粘度变化不是最佳的。因此，结冷胶是作为原位胶凝基质的优选。

实施例3：本发明的环孢素胶束的原位凝胶。

含0.05％环孢素A的胶束眼用凝胶的配方如下：

环孢素A 0.05重量％，去乙酰基结冷胶0.25重量％，聚乙二醇20十六十八醚1.0重量％，氯化钠0.15重量％，甘露醇3.3重量％，对羟基苯甲酸酯0.02重量％，适量的氨丁三醇盐酸缓冲剂和加入注射用水以制成100g含有0.05％环孢素胶束的眼用凝胶(表12)。

表12.实施例3纳米胶束原位凝胶的组成

样品制备

将规定量的水注入烧杯中，并用旋转搅拌器以均匀速度搅拌。在搅拌下将规定量的脱乙酰基结冷胶撒在上述水中，然后在搅拌下放入90℃水浴中1h。取出溶液，趁热灭菌后通过0.45μm微孔滤膜过滤。溶液1：精确称量规定量的环孢素A，加入规定量的聚乙二醇20十六十八醚以溶解环孢素A，然后分别加入适量的氯化钠，甘露醇，羟基丁酸酯和氨丁三醇盐酸缓冲液。然后将溶液通过0.45μm微孔膜，获得溶液2。在搅拌下混合溶液1和溶液2，并装入滴眼剂瓶中，获得环孢素胶束原位凝胶溶液。

粒径尺寸和分布检测

使用粒度分析仪测量上述制备的0.05％环孢素胶束原位凝胶的粒度和分布。结果如图9和表13所示。

使用粒度分析仪测量

使用粒度分析仪测量

表13.实施例3的纳米胶束的粒度比较和

从表13中的结果可以看出，作为实施例3制备的样品的纳米胶束的粒径小于

0.05％环孢素胶束眼用原位凝胶的体外释放曲线

使用100mL人工泪液作为介质，通过溶蚀方法进行了体外释放试验。温度设定在34±0.5℃。振荡频率为100r/min。将1mL样品添加至安瓿瓶，然后添加4mL人工泪液，并将安瓿瓶置于恒温恒湿振荡器中。在0.5、1、2、4、8、12、24、48小时时各取液2mL，同时补充相同温度的新鲜介质2ml。通过0.45μm微孔膜滤器过滤样品，并将20μL滤液注入液相色谱系统中，测定环孢素A的含量。使用相同的方法测量

表14.实施例3以及

图12中列出的数据表明，实施例3形成的0.05％环孢素胶束的眼用凝胶制剂与市售品(

稳定性研究：0.05％环孢素制备了胶束眼用凝胶，并分成多剂量滴眼剂瓶。将样品储存在25℃的稳定箱中。在0、10、20天，30天取样。

性质：性状，pH，渗透压，粘度，含量，粒径。

表15.制备的纳米胶束原位凝胶的性质和稳定性

实施例4：本发明中环孢素胶束的原位凝胶。

含0.05％环孢素A的胶束眼用制剂配方如下：

环孢素A 0.05重量％，去乙酰基结冷胶0.3％，聚氧乙烯15羟基硬脂酸酯1.0％，氯化钾0.2％，甘油0.8％，羟苯甲脂0.05％，羟苯乙酯0.01％，适量的磷酸盐缓冲溶液，并加入水制成100g的含0.05％环孢素胶束的眼用凝胶(表16)。

表16.实施例4纳米胶束原位凝胶的组成

样品制备

将一定量的水注入烧杯中，并用旋转搅拌器以均匀速度搅拌。在搅拌下将规定量的去乙酰基结冷胶分散在上述水中，然后在搅拌下将其放入90℃水浴中1h。取出溶液，趁热通过0.45μm微孔滤膜过滤，以得到溶液1。精确称量规定量的环孢素A，加入规定量的聚氧乙烯15羟基硬脂酸酯以溶解环孢素A，加入规定量的氯化钾，甘油，对羟基苯甲酸酯，对羟基苯甲酸丙酯和磷酸盐缓冲液。然后使溶液通过0.45μm的微孔过滤器以获得溶液2。在搅拌下混合溶液1和溶液2，并包装到滴眼剂瓶中以获得环孢素胶束眼用凝胶。

粒度和分布检测

使用粒度分析仪测量上述制备的0.05％环孢素胶束原位凝胶的粒度和分布。结果如图13和表17所示。

表17.实施例4纳米胶束与

从表19的结果可以看出，其粒度远小于

体外释放测定：测试了0.05％环孢素胶束眼用凝胶的体外释放。

通过溶蚀方法进行体外释放试验，使用100ml人工泪液作为介质。温度设定在34±0.5℃。振荡频率为100r/min。将1mL样品添加到安瓿瓶中，然后添加4mL人工泪液，并将安瓿瓶放入恒温恒湿振荡器中。在0.5、1、2、4、8、12、24、48小时，分别取2ml溶液，然后加入2mL新鲜介质。将样品通过0.45μm的膜滤器过滤，然后将20μL注入液相色谱系统中以确定环孢素A的含量。将释放曲线绘制为累积药物释放百分比与时间的关系。我们比较了

表18.实施例4以及

从图14所示的结果可以看出，与

稳定性研究：0.05％环孢素制备了胶束眼用凝胶，并分成多剂量滴眼剂瓶。将瓶子储存在25℃的稳定箱内。在0、10、20天，30天取样。

性质：性状，pH，渗透压，粘度，含量，粒径。实验结果示于下表19中。

表19.制备的胶束原位凝胶的表征和稳定性

实施例5：具有环孢素胶束的原位凝胶。

含0.05％环孢素A的胶束眼用制剂的具体处方如下：

环孢素A 0.05重量％，脱乙酰基结冷胶0.4％，Soluplus 0.9％，氯化钙0.2％，丙二醇0.8％，山梨酸钾0.01％，加入适量的硼酸盐缓冲剂和注射用水以制备100g含有0.05％环孢素胶束的眼用凝胶(参见表20)。

表20.实施例5中的含纳米胶束的原位凝胶的组成

样品制备

将规定量的Soluplus称重到250mL烧杯中。加入10mL的无水乙醇以溶解规定量的环孢素A。将溶液在80℃下加热以蒸发掉乙醇，得到无色透明的薄膜。加入20ml去离子水使薄膜水合15小时，制成溶液1。按规定的量称重丙二醇，氯化钙，山梨酸钾，去乙酰化结冷胶，并加入70ml去离子水中，加热至90℃。在搅拌下搅拌1小时，直到结冷胶完全溶解。冷却后获得溶液2。在搅拌下将溶液2缓慢加入溶液1中，最后用硼酸盐缓冲液调节pH。加入去离子水使最终重量为100g。样品通过0.22μm微孔膜过滤器过滤以灭菌。

粒度和分布检测

使用粒度仪测量以上制备的0.05％环孢素胶束原位凝胶的粒度和分布。结果示于图15和表21。

表21.实施例5纳米胶束与

表21和图15的结果表明，实施例5的胶束粒径远小于

体外释放评价：产生了0.05％环孢素胶束眼用凝胶的体外释放曲线。

通过溶蚀方法进行体外释放试验，使用100ml人工泪液作为介质。温度设定在34±0.5℃。振荡频率为100r/min。将1ml样品加入安瓿瓶，然后加入4ml人工泪液，并将安瓿瓶放入恒温恒湿振荡器中。在0.5、1、2、4、8、12、24、48小时，分别取2mL溶液，并加入2ml新鲜介质。通过0.45μm微孔膜过滤器过滤样品，并将20μL注入液相色谱系统中，以测定环孢素A的含量。将释放曲线绘制为累积药物释放与时间的百分比。我们比较了

表22.实施例5样品、

从图16的结果可以看出，与

稳定性研究：0.05％环孢素制备了胶束眼用凝胶并将其分成多剂量滴眼剂瓶。将样品储存在25℃的稳定箱中。在0、10、20天，30天取样。

性质：性状，pH，渗透压，粘度，含量，粒度。

实验结果(表23):

表23.制备的纳米胶束原位凝胶的表征和稳定性

实施例6：本发明中环孢素胶束的原位凝胶。

含0.05％环孢素A的胶束眼用凝胶的配方如下：

环孢素A 0.05重量％，去乙酰结冷胶0.3％，聚氧乙烯15羟基硬脂酸酯0.25％，聚氧乙烯40氢化蓖麻油1.0％，氯化钠0.25％，甘露醇3.3％，羟苯甲酯0.05％，羟苯丙酯0.01％，适当的加入适量的氨丁三醇盐酸缓冲溶液和注射用水以制成100g含有0.05％环孢素胶束的眼用凝胶(表24)。

表24.实施例6纳米胶束原位凝胶的组成

样品制备

将规定量的水注入烧杯中，并用旋转搅拌器以均匀速度搅拌。在搅拌下将规定量的脱乙酰基结冷胶分散在上述水中，然后在搅拌下将其放入90℃水浴中1小时。取出溶液，趁热通过0.45μm微孔滤膜过滤，得到灭菌溶液1。精确称量规定量的环孢素A，加入规定量的HS-15和RH-40以溶解环孢素A，然后加入适量的氯化钠，甘露醇，羟苯甲酯，羟苯丙酯和盐酸氨丁三醇缓冲液。然后，使溶液通过0.45μm的微孔膜过滤器，得到溶液2。边搅拌边混合溶液1和溶液2，得到环孢素胶束眼用凝胶，并装入滴眼剂瓶中。

粒度和分布测量

使用粒度分析仪测量以上制备的含0.05％环孢素胶束的原位凝胶的粒度和分布指数，结果列在下面的图17和表25中。

表25.实施例6和

从表25中的结果可以看出，粒径远小于

体外释放测定：制备的0.05％环孢素胶束眼用凝胶的体外释放曲线。

通过溶蚀方法进行体外释放试验，使用100ml人工泪液作为介质。温度设定在34±0.5℃。振荡频率为100r/min。将1ml样品加入安瓿瓶，然后加入4ml人工泪液，并将安瓿瓶放入恒温恒湿振荡器中。在0.5、1、2、4、8、12、24、48小时，分别取2ml溶液，并加入2ml新鲜介质。样品通过0.45μm微孔膜滤器过滤，并将20μL注入液相色谱系统中以测定环孢素A的含量。将释放曲线绘制为累积药物释放百分比与时间的关系。我们比较了

表26.实施例6和

从图18的结果可以看出，与

稳定性研究：0.05％环孢素制备胶束眼药水并将其分成多剂量滴眼剂瓶。将样品储存在25℃的稳定室中。在0、10、20天，30天取样。

性质：外观，pH，渗透压，粘度，含量，粒度。

实验结果在下表27中列出。

表27.制备的纳米胶束原位凝胶的表征和稳定性

实施例7：本发明中的环孢素胶束的原位凝胶。

含0.09％环孢素A的胶束眼药水配方如下：

环孢素A 0.09重量％，DGG 0.3％，HS-15 0.25％，RH-40 1.0％，氯化钠0.25％，甘露醇3.3％，羟苯甲脂0.05％，羟苯丙酯0.01％，加入适量的氨丁三醇盐酸缓冲溶液和注射用水，制成100g含有0.05％环孢素胶束的眼用凝胶(表28)。

表28.实施例7纳米胶束原位凝胶的组成

样品制备

将规定量的水注入烧杯中，并用旋转搅拌器以均匀速度搅拌。在搅拌下将规定量的脱乙酰基结冷胶分散在上述水中，然后在搅拌下将其放入90℃水浴中1小时。取出溶液，趁热通过0.45μm微孔膜滤器过滤，得到灭菌溶液1。精确称量规定量的环孢素A，加入规定量的HS-15和RH-40以溶解环孢素A，然后加入适量的氯化钠，甘露醇，羟苯甲脂/羟苯丙酯和盐酸氨丁三醇缓冲液。然后使溶液通过0.45μm的微孔膜过滤器以获得溶液2。在搅拌下混合溶液1和溶液2以获得环孢素胶束眼用凝胶，并包装到滴眼剂瓶中。

粒度和分布测量

使用粒度分析仪测量以上制备的0.09％环孢素胶束原位凝胶的粒度和分布。结果示于图19和表29。

表29.实施例7和

表29中的结果表明，实施例7中的纳米胶束的粒径小于

体外释放评价：测试了0.09％环孢素胶束眼用凝胶的体外释放曲线。

通过溶释方法进行体外释放试验，使用100ml人工泪液作为介质。温度设定在34±0.5℃。振荡频率为100r/min。将1ml样品添加到安瓿瓶中，然后添加4ml人工泪液，并将安瓿瓶放入恒温恒湿振荡器中；在0.5、1、2、4、8、12、24、48小时，分别取2ml溶液，并加入2ml新鲜介质。通过0.45μm微孔膜过滤器过滤样品，并将20μL注入液相色谱系统中，以确定环孢素A的含量。将释放曲线绘制为累积药物释放与时间的百分比。我们比较了

表30.实施例7以及

从图20的结果可以看出，与

稳定性研究：0.09％环孢素制备了胶束眼用凝胶并将其分成多剂量滴眼剂瓶。将样品储存在25℃的稳定室中。在0、10、20天，30天取样。

性质：外观，pH，渗透压，粘度，含量，粒度。

结果列于下表31。

表31.含纳米胶束的原位凝胶的表征和稳定性

实施例8：体外透析释放试验。

对样品1-6，

表32.用于透析释放测试的纳米胶束样品的成分

分别取2mL样品1-6，

表33.从样品1-6和

聚乙二醇20十六十八醚用作增溶剂以制备环孢素样品1(0.03％CsA)，样品2(0.05％CsA)和样品3(0.09％CsA)。如图22所示，使用半透膜将这些样品的药物渗透与

HS-15和RH40用作增溶剂以制备样品4(0.03％CsA)，样品5(0.05％CsA)和样品6(0.09％CsA)。如图22所示，使用半透膜将这些样品的药物渗透与