CD47表达抑制剂及其与免疫治疗药物联合使用

摘要

本发明公开了CD47表达抑制剂及其与免疫治疗药物联合使用，所述的CD47表达抑制剂是以式IOX1或ROX所示的化合物或其药学上可接受的盐为有效成分，IOX1或ROX通过降低肿瘤细胞中CD47的表达，提高免疫治疗效果。本发明还公开了该CD47表达抑制剂与治疗性抗体的联用方法，进一步提高疗效。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及CD47表达抑制剂及其与免疫治疗药物联合使用。

背景技术

CD47又称整合素相关蛋白，蛋白分子量约为52KDa，是分布于各种细胞表面的一种糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员(Integrin-associated protein(CD47)and itsligands.Trends in Cell Biology，2001，11(3)：130-135)。巨噬细胞上的SIRPα受体通过与人体细胞表面的CD47相结合，能够防止巨噬细胞对机体正常细胞的误伤(Identification of major binding proteins and substrates for the SH2-containing protein tyrosine phosphatase SHP-1 in macrophages.Molecular&CellBiology，1998，18(7)：3838-3850)。不幸的是，CD47也在许多肿瘤细胞上都高表达，使得肿瘤细胞能够利用CD47与巨噬细胞的作用机制，逃脱巨噬细胞对其的吞噬，让机体在抵御癌细胞的第一道防线中就失去了阵地(Negative regulation of phagocytosis inmacrophages by the CD47-SHPS-1 system.Journal of Immunology，2002，174(4)：2004-2011)。

CD47对于肿瘤细胞生长和进展具有促进作用，且与它们的预后不良相关(CD47 isupregulated on circulating hematopoietic stem cells and leukemia cells toavoid phagocytosis.Cell，2009，138(2)：271-285)。其原因之一正是肿瘤细胞表面高度表达的CD47和巨噬细胞表面的SIRP-α结合，传递出“别吃我”信号，抵消肿瘤细胞上的“吃我”信号，从而屏蔽巨噬细胞的吞噬功能。肿瘤表面的CD47与SIRP-α的相互作用也会促进肿瘤的转移。例如，CD47与SIRP-α的结合会促进破骨细胞的形成，后者的激活有助于促进肿瘤细胞的骨转移。同时，CD47和血小板反应蛋白-1(thrombospondin-1，TSP-1)的结合会抑制一氧化氮(NO)的产生，将NO限制在较低的水平，这也会加快破骨细胞的形成和激活，促进肿瘤的骨转移(CD47 regulates bone mass and tumor metastasis to bone.CancerResearch，2009，69(7)：3196-3204)。在非小细胞肺癌中，CD47能通过激活下游的肿瘤转移关键蛋白Cdc42分子来促进癌细胞的转移(CD47 promotes tumor invasion andmetastasis in non-small cell lung cancer.Scientific Reports，2016，6：29719)。CD47还会促进肿瘤的复发，其通过与SIRP-α的相互作用，能够抑制巨噬细胞和细胞毒性T淋巴细胞的功能，从而保护循环肿瘤干细胞免受免疫系统的清除，最终导致肿瘤的复发(CD47is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on humanacute myeloid leukemia stem cells.Cell，2009，138(2)：289-299)。

多数肿瘤患者中，巨噬细胞通常处于免疫抑制的“失能”状态，这与肿瘤细胞表面CD47分子介导的巨噬细胞吞噬效应失活有关。针对CD47所引起的巨噬细胞变异，以及最终导致免疫逃离的问题，目前已研发出不少靶向CD47的单抗/融合蛋白药物，其基本作用机制均是通过阻断CD47/SIRα信号通路，恢复巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用(The CD47-SIRPalpha pathway in cancer immune evasion and potential therapeuticimplications.2012，24(2)：225-232)。目前用于临床的CD47药物均为抗体药物，相对于小分子药物，制备、运输、储存及技术成本高出许多。此外，这些抗体类药物对于大部分癌症的有效率不高，且治疗后仍存在复发的风险，这就导致患者在用药时需要严格考虑“性价比”的问题，无形中增加了患者的压力。因此，发明可用于CD47/SIRPα治疗的小分子药物是一个亟需解决的，具有重要实际应用价值的研究课题和方向。

5-羧基-8-羟基喹啉(IOX1)和ROX是HIF水解酶辅氨酰羟化酶(HIF-PHD)的抑制剂，能够提高心脏、肾缺血部位的HIF水平，从而保护缺血部位，应用于例如肾性缺血治疗(Inhibition of Hypoxia Inducible Factor Hydroxylases Protects Against RenalIschemia-Reperfusion Injury.Journal of the American Society ofNephrology.2008，19(1)：39-46；Roxadustat for Anemia in Patients with KidneyDisease Not Receiving Dialysis.2019，381(11)：1001-1010)。尤其，ROX已经是一种市售的治疗肾性贫血的药物，并有多项三期临床实验正在进行。

发明内容

本发明发现式IOX1或ROX所示的化合物或其药学上可接受的盐可以有效降低多种肿瘤细胞表面CD47的表达水平，区别于现有的CD47直接或间接抑制剂。IOX1或ROX通过降低肿瘤细胞中CD47的表达，提高免疫治疗效果。本发明还公开了该CD47表达抑制剂与免疫治疗药物的联用方法，进一步提高疗效。

本发明解决上述技术问题所提供的技术方案为：

式IOX1或ROX所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备CD47表达抑制剂中的应用；

本发明所述的CD47表达抑制剂用于解除CD47/SIRPα介导的免疫抑制。

本发明所述的式IOX1或ROX所示的化合物或其药学上可接受的盐可以下调肿瘤细胞CD47的表达，抑制肿瘤细胞与巨噬细胞或其它单核细胞之间的CD47/SIRPα的应答，增强机体对肿瘤的免疫应答，提高肿瘤免疫治疗效果。

式IOX1或ROX所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。

所述的肿瘤为肾上腺癌、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳腺癌、脑癌、心脏肿瘤、宫颈癌、儿童癌症、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、结直肠癌、胚胎肿瘤，上皮癌、食管癌、胃肠道癌、生殖细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胶质瘤、头颈部癌、血液系统恶性肿瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肠癌、眼内黑色素瘤、肾癌、喉癌、白血病、肺癌、肝癌、恶性周围神经鞘瘤、黑色素瘤、间皮瘤、鼻咽癌、神经母细胞瘤、神经纤维瘤、口腔癌、非小细胞肺癌、骨肉瘤、卵巢癌、垂体瘤、前列腺癌、胰腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、小细胞肺癌，睾丸癌、喉癌、甲状腺癌、移行细胞癌、泌尿生殖道癌、尿路上皮癌、子宫癌、阴道癌或肾母细胞瘤。

所述的CD47表达抑制剂是以式IOX1或ROX所示的化合物或其药学上可接受的盐为有效成分，加入药学上可接受的辅料制备成药学上常用的药物制剂，所述的药物制剂为口服药剂、由脂质体、白蛋白、高分子聚合物或无机纳米颗粒辅助制备的纳米药物注射制剂、敷剂、喷雾制剂，或与其它免疫治疗药物联合的组合物。

所述的CD47表达抑制剂与免疫治疗药物联合使用。

所述的免疫治疗药物为免疫治疗的抗体、多肽或小分子或它们的制剂的一种或多种。

所述的免疫治疗药物为靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4或SIRPα的免疫检查点抑制剂。

所述的靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4或SIRPα的免疫检查点抑制剂为多肽或小分子。

所述的CD47表达抑制剂的剂量范围为5-50mg/kg；所述的免疫治疗药物的剂量范围为0.1-10mg/kg。

本发明还提供了一种药物组合物，包括式IOX1或ROX所示的化合物或其药学上可接受的盐以及免疫治疗药物。

所述的式IOX1或ROX所示的化合物或其药学上可接受的盐与免疫治疗药物的质量比为1～10∶1；优选为4.8～5.2∶1，进一步优选为5∶1。

本发明的有益效果主要体现在：

(1)本发明发现式IOX1或ROX所示的化合物或其药学上可接受的盐可以用于制备CD47表达抑制剂，式IOX1或ROX所示的化合物或其药学上可接受的盐可以有效降低多种肿瘤细胞表面CD47的表达水平，解除CD47/SIRPα介导的免疫抑制，发挥免疫治疗的作用，从而提高肿瘤的免疫治疗效果，区别于现有的蛋白类CD47抑制剂。

(2)本发明的CD47表达抑制剂可与一种或多种免疫治疗药物联合使用，进一步提高肿瘤免疫治疗效果。

定义和说明

除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在具有下列含义。一个特定的术语或短语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。这里所采用的术语″药学上可接受的″，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言。它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。

术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的盐，由本发明发现的具有特定取代基的化合物与相对无毒的酸或碱制备。当本发明的化合物中含有相对酸性的功能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的碱与这类化合物的中性形式接触的方式获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐包括钠、钾、钙、铵、有机胺或镁盐或类似的盐。当本发明的化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的酸与这类化合物的中性形式接触的方式获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的实例包括无机酸盐，所述无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸，碳酸氢根，磷酸、磷酸一氢根、磷酸二氢根、硫酸、硫酸氢根、氢碘酸、亚磷酸等；以及有机酸盐，所述有机酸包括如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯横酸、柠檬酸、酒石酸和甲磺酸等类似的酸；还包括氨基酸(如精氨酸等)的盐，以及如葡糖醛酸等有机酸的盐。本发明的某些特定的化合物含有碱性和酸性的官能团，从而可以被转换成任一碱或酸加成盐。

本发明的药学上可接受的盐可由含有酸根或碱基的母体化合物通过常规化学方法合成。一般情况下，这样的盐的制备方法是：在水或有机溶剂或两者的混合物中，经由游离酸或碱形式的这些化合物与化学计量的适当的碱或酸反应来制备。

除了盐的形式，本发明所提供的化合物还存在前药形式。本文所描述的化合物的前药容易地在生理条件下发生化学变化从而转化成本发明的化合物。此外，前体药物可以在体内环境中通过化学或生化方法被转换到本发明的化合物。

本发明的某些化合物可以以非溶剂化形式或者溶剂化形式存在，包括水合物形式。一般而言，溶剂化形式与非溶剂化的形式相当，都包含在本发明的范围之内。

本发明的化合物可以存在特定的几何或立体异构体形式。本发明设想所有的这类化合物，包括顺式和反式异构体、(-)-和(+)-对映体、(R)-和(S)-对映体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体，及其外消旋混合物和其他混合物，例如对映异构体或非对映体富集的混合物，所有这些混合物都属于本发明的范围之内。

本发明术语“药物组合物”是指一种或多种本中请的化合物或其盐与药学上可接受的载体组成的混合物。药物组合物的目的是有利于对有机体给予本申请的化合物。

本发明术语“药学上可接受的载体”是指对有机体无明显刺激作用，而且不会损害该活性化合物的生物活性及性能的那些辅料。合适的辅料是本领域技术人员熟知的，例如碳水化合物、蜡、水溶性和/或水可膨胀的聚合物、亲水性或疏水性材料、明胶、油、溶剂、水、脂质体、聚合物胶束或无机纳米载体等。

本发明所使用的溶剂可经市售获得。

本发明采用下列缩略词：IOX1代表5-羧基-8-羟基喹啉；ROX代表N-[(4-羟基-1-甲基-7-苯氧基-3-异喹啉)羰基]甘氨酸；CD47代表分化簇47；SIRPα代表信号调节蛋白α，DMSO代表二甲亚砜；PBS代表磷酸盐缓冲液。本发明化合物依据本领域常规命名原则或者使用

附图说明

图1为实例1A中不同浓度IOX1降低CT26细胞CD47表达的Western blot结果。

图2为实例1A中不同浓度IOX1降低HCT116细胞CD47表达的Western blot结果。

图3为实例1A中不同浓度ROX降低CT26细胞CD47表达的Westem blot结果。

图4为实例1A中不同浓度ROX降低HCT116细胞CD47表达的Western blot结果。

图5为实例1A中IOX1降低4T1细胞CD47表达的Western blot结果。

图6为实例1A中IOX1降低MCF7细胞CD47表达的Western blot结果。

图7为实例1A中ROX降低4T1细胞CD47表达的Western blot结果。

图8为实例1A中ROX降低MCF7细胞CD47表达的Western blot结果。

图9为实施例1B中不同浓度IOX1降低CT26细胞CD47表达的PCR结果。

图10为实施例1B中不同浓度IOX1降低HCT116细胞CD47表达的PCR结果。

图11为实施例1B中不同浓度ROX降低CT26细胞CD47表达的PCR结果。

图12为实施例1B中不同浓度ROX降低HCT116细胞CD47表达的PCR结果。

图13为实施例1C中不同浓度IOX1降低CT26细胞CD47表达的流式细胞计数结果。

图14为实施例1C中不同浓度IOX1降低HCT116细胞CD47表达的流式细胞计数结果。

图15为实施例1C中不同浓度ROX降低CT26细胞CD47表达的流式细胞计数结果。

图16为实施例1C中不同浓度ROX降低HCT116细胞CD47表达的流式细胞计数结果。

图17为实施例2A-1中IOX1或ROX对CT26荷瘤小鼠肿瘤模型的抑瘤曲线，PBS为空白对照组。

图18为实施例2A-1中使用IOX1或ROX后小鼠的体重变化曲线，PBS为空白对照组。

图19为实施例2A-2中使用IOX1或ROX后小鼠肿瘤CD47表达的免疫荧光分析，PBS为空白对照组。

图20为实施例2B中PD-1抗体与IOX1或ROX联用后，对CT26荷瘤小鼠肿瘤模型的抑瘤曲线，PBS为空白对照组。

图21为实施例2B中PD-1抗体与IOX1或ROX联用后小鼠的体重变化曲线，PBS为空白对照组。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行详细阐述，下述说明仅为解释本发明，并不对其内容进行限定。本发明化合物可以通过本领域技术人员熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其它化合物合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术人员所熟知的等同替换方式，也可以可经市售获得。优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。对本领域技术人员而言，在不脱离本发明精神和范围的情况下针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进是显而易见的。

本发明所述的IOX1和ROX可经市售(本发明使用的小化合物来源于MedChemExpress China)获得。

实施例1：IOX1或ROX降低肿瘤细胞CD47表达

实施例1A：Western blot技术检测IOX1或ROX降低肿瘤细胞CD47表达

将肿瘤细胞(鼠源结肠癌细胞CT26、人源结肠癌细胞HCT116细胞、鼠源乳腺癌细胞4T1、人源乳腺癌细胞MCF7)以每孔2×10

弃去培养基，用预冷的PBS润洗细胞三遍并弃去洗液，每孔加入0.2mL含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，置于冰上裂解30min。裂解完成后，用细胞刮刀将裂解液及细胞碎片刮至培养皿一侧，并用移液枪将裂解液转移至1.5mL Ep管中，于4℃离心(12000rpm/5min)后收集上清，并测定其蛋白浓度。

用RIPA裂解液将蛋白样品稀释至一定浓度，加入5×SDS上样缓冲液至蛋白量1μg/μL，置于95℃金属浴上孵育5min，冷却至室温后上样至制备好的SDS-PAGE电泳胶中，浓缩胶为5％，分离胶为12％。用90V电压将蛋白跑至浓缩胶底部成一条直线后调整电压为125V，至溴酚蓝跑出后终止电泳。

随后将蛋白转移至硝酸纤维膜上，电压为80V，转膜时间90min。结束后将膜置于5％的脱脂牛奶中于室温封闭一小时。TBST缓冲液洗膜三次后分别加对应种属的一抗(anti-CD47，1∶5000；anti-GAPDH，1∶10000)，4℃孵育过夜。用TBST缓冲液洗膜三次后加入辣根过氧化酶标记的二抗，室温下孵育1h。充分洗膜后进行化学发光显色，并用化学发光成像仪拍照，测试结果如图1-8所示。

由图1-4可知，IOX1或ROX可以显著降低鼠源结肠癌细胞CT26或人源结肠癌细胞HCT116的CD47蛋白水平，且呈浓度依赖。

由图5-8可知，50μM的IOX1或ROX还可以显著降低鼠源乳腺癌细胞4T1或人源乳腺癌细胞MCF7的CD47蛋白水平。

实施例1B：qRT-PCR技术检测不同浓度IOX1或ROX降低CT26细胞或HCT116细胞CD47的mRNA水平

以每孔2×10

测试结果如图9-12所示，加入不同浓度的IOX1或ROX溶液后，CT26细胞或HCT116细胞上CD47的mRNA表达水平显著降低，且呈浓度依赖，证明IOX1或ROX能够在基因水平上降低CD47的表达。

实施例1C：流式细胞仪检测本发明化合物降低肿瘤细胞CD47的表达

将CT26细胞或HCT116细胞以每孔2×10

结果如图13-16所示，IOX1或ROX可以显著降低CT26细胞或HCT116细胞CD47的表达，其能力随加药浓度的升高而增强。

实施例2：IOX1或ROX的体内抑瘤活性

配置方法：取45mg IOX1或ROX溶于1mL DMSO，加入1mL聚乙二醇500、吐温80或聚氧乙烯蓖麻油(本试验用的是聚乙二醇500)，涡旋至混合均匀，取1mL上述溶液加入到9mL PBS中，混匀即得IOX1或ROX注射液。该注射液可在4℃保存6个月以上，不会有固体粉末析出。

试验目的：考察IOX1或ROX对CT26鼠结肠癌的肿瘤抑制作用。

实施例2A-1：单独使用IOX1或ROX治疗结肠癌荷瘤小鼠

Balb/c白鼠皮下注射1×10

结果如图17～18所示，IOX1或ROX能够显著延缓CT26肿瘤的生长，表现出更显著的抗癌活性，且小鼠的体重在治疗过程中保持稳定。

实施例2A-2：肿瘤组织CD47的免疫荧光分析

Balb/c白鼠皮下注射1×10

IOX1或ROX治疗后的小鼠肿瘤CD47标志物的表达与对照组相比明显减少，证明IOX1或ROX可以在体内抑制肿瘤CD47的表达，阻断了CD47/SIPRα介导的免疫抑制，激活了免疫效应。

实施例2B：IOX1或ROX联合PD-1抗体的体内抑瘤活性。

小鼠PD-1抗体从Biolegend公司购入(货号：124329，clone 10F.9G2)。

Balb/c白鼠皮下注射1×10

结果如图20～21所示，与单独使用PD-1抗体相比，加入IOX1或ROX后可以显著延缓CT26肿瘤的生长，表现出更显著的抗癌活性，尤其，六次联合给药就能够完全消除80mm