一种可注射蛋白质水凝胶支架及其延长药物体内稳定的应用

摘要

本发明提供了一种可注射蛋白质水凝胶支架及其延长药物体内稳定的应用，该水凝胶通过Fmoc‑Phe与Phe2制备而成，并混合荧光假单胞菌脂肪酶(PFL)溶液，制备获得氨基酸水凝胶前体。本发明的有益效果为：该可注射蛋白质水凝胶支架具有良好的体积支架作用，并且可以能够提供支持作用5‑7天，随后被机体完全代谢，同时，该可注射蛋白质水凝胶支架在延长皮下注射后机体对药物的清除，也能够抑制巨噬细胞的浸润，从而减少注射区域的炎症反应。

说明书

技术领域

本发明涉及可注射性蛋白质水凝胶支架技术领域，其可作为药物载体，经皮下注射延长药物作用时间，尤其涉及一种可注射蛋白质水凝胶支架及其延长药物体内稳定的应用。

背景技术

水凝胶是由多种天然和合成聚合物合成砌块形成的亲水性水溶胀聚合物网络。这些合成砌块经过工程学设计可通过化学反应或细胞及蛋白质的物理相互作用实现交联，在此过程迅速进行注射或形成原位水凝胶。但现有可注射型水凝胶凝大部分生物相容性和生物可降解性差，不利于注射后凝胶的定点成型和长期运动带来的耐受性问题。

如何解决上述技术问题为本发明面临的课题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可注射蛋白质水凝胶支架及其延长药物体内稳定的应用。

本发明是通过如下措施实现的：一种红细胞载胰岛素药物，其中，所述药物是以红细胞为载体，包载胰岛素与原卟啉(PPIX)，包被水凝胶。

作为本发明提供的一种红细胞载胰岛素药物进一步优化方案，所述载体中胰岛素包载量为30mg/mL，以DMSO溶液溶解，原卟啉IX(PPIX)含量为0.3％。

作为本发明提供的一种红细胞载胰岛素药物进一步优化方案，采取低渗透析法装载胰岛素，透析时间为12h。

作为本发明提供的一种红细胞载胰岛素药物进一步优化方案，采用超声波刺激原卟啉IX，超声频率28KHz，超声强度为0.5w/cm

为了更好地实现上述发明目的，本发明还提供一种红细胞载胰岛素药物的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)红细胞载体预制：采用心尖采血方式收集2mL新鲜SD大鼠全血，使用肝素抗凝处理于10ml EP管中，2000r/min下离心5min，弃上层血浆，如此反复，重悬于等体积PBS，pH为7.4，获得50％比容的红细胞悬浮液，4℃避光保存；

(2)红细胞载体的构建：采取低渗透析法透析12h，将胰岛素与原卟啉IX包载入红细胞，胰岛素浓度30mg/mL，原卟啉IX0.3％。

作为本发明提供的一种红细胞载胰岛素药物制备方法的进一步优化方案，所述步骤(1)中，红细胞离心时以2000r/min离心5min，弃去上清后，重悬于等体积PBS，pH为7.4，获得50％比容的红细胞悬浮液，4℃避光保存。

作为本发明提供的一种红细胞载胰岛素药物在用于制备治疗糖尿病药物上的应用。

为了更好地实现上述发明目的，本发明又提供一种可注射蛋白质水凝胶支架，该水凝胶通过Fmoc-Phe，Phe2及PFL制备而成。

上述原料中精确称量Fmoc-Phe 16mg和Phe2 12mg缓慢加入1mL PBS(pH 7.4)与420μL 0.5mol/L的NaOH的混合溶液中并缓慢搅拌至完全溶解，此时溶液终浓度为Fmoc-Phe11.3mg/mL和Phe2 8.5mg/mL。用0.1mol/L HCl溶液将pH调节为7.0，此时溶液体积约为3.5mL。最后加入需要包载的药物，并充分搅拌溶解，将PFL溶液缓慢加入氨基酸水凝胶前体溶液中混匀，然后将溶液于37-80℃恒温水浴2-10分钟，在完全固化后室温密封避光保存。

优选的，原料中Fmoc-Phe与Phe2的质量比为4：3，溶剂选用1mL PBS(pH 7.4)与420μL 0.5mol/L的NaOH的混合溶液，反应溶液PH值为7.4。

本发明还提供了上述水凝胶支架的制备方法，具体步骤如下：

(1)水凝胶的制备：精确称量Fmoc-Phe 16mg和Phe2 12mg缓慢加入1mL PBS(pH7.4)与420μL 0.5mol/L的NaOH的混合溶液中并缓慢搅拌至完全溶解，此时溶液终浓度为Fmoc-Phe 11.3mg/mL和Phe2 8.5mg/mL，用0.1mol/L HCl溶液将pH调节为7.0；

(2)将荧光假单胞菌脂肪酶(PFL)完全溶解于PBS中以配制100μL 50mg/mL PFL溶液，将制得PFL溶液缓慢加入氨基酸水凝胶前体溶液中混匀，然后将溶液于37-80℃恒温水浴2-10分钟，即得。

进一步地，步骤(2)中，制备得到的可注射性蛋白质水凝胶支架，需要在完全固化后室温密封避光保存。

进一步地，步骤(2)中，制备得到的可注射性蛋白质水凝胶支架，在皮下注射前添加PFL，添加后6-10分钟内(流动状态)进行注射。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)、本发明通过Fmoc-Phe与Phe2的结合能够有效达到延长药物体内稳定的作用；

(2)、本发明能够有效抑制巨噬细胞的浸润，从而减少水凝胶注射区域的炎症反应；

(3)、本发明具有良好的体积支架作用，并且可以在短时间内完全代谢，且无机体损伤作用；

(4)、本发明的前期动物模拟实验研究结果，为可注射蛋白质水凝胶(本发明水凝胶)延长药物体内稳定的临床应用提供了基础；

(5)、不会对人体产生损伤，具有良好的生物相容性；

(6)、本发明中可注射蛋白质水凝胶支架凝结速度快，具有良好的体积支架作用，并且可被机体完全代谢，代谢产物无毒害。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。

图1为本发明实施例1中溶液相与凝胶相氨基酸水凝胶的FTIR光谱图；

图2为本发明实施例2中厚度为1cm的水凝胶不同波长处透射率和ICG不同波长处吸光度曲线图；

图3为本发明实施例3中水凝胶中INS@ER-ICG的SEM图像；

图4为本发明实施例4中水凝胶具有可注射性，(A)2分钟图像；(B)10分钟图像；(C)其具有可塑性，能够塑造成需要的形状；

图5为本发明实施例4中水凝胶溶胀曲线图；

图6为本发明实施例中分别在第3、5、7、10天氨基酸水凝胶抑制巨噬细胞浸润测试图；

图7为本发明实施例中皮下凝胶支架0、1、2和10天照片图；

图8为本发明实施例中皮下凝胶支架注射后皮肤病理结果图；

图9为本发明实施例中皮下凝胶支架体积随时间变化曲线图；

图10为本发明实施例中第3、5、7、10天动物模型的主要脏器和注射部位皮肤的病理切片图；

图11为本发明实施例中第0、1、3、5、7天动物模型血液生化指标图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。当然，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

水凝胶的分解对机体产生的影响：

可注射蛋白质水凝胶的制备过程：

精确称量Fmoc-Phe 16mg和Phe2 12mg缓慢加入1mL PBS(pH 7.4)与420μL0.5mol/L的NaOH的混合溶液中并缓慢搅拌至完全溶解，此时溶液终浓度为Fmoc-Phe11.3mg/mL和Phe2 8.5mg/mL。用0.1mol/L HCl溶液将pH调节为7.0，此时溶液体积约为3.5mL。将荧光假单胞菌脂肪酶(PFL)完全溶解于PBS(pH 7.4)中以配制100μL 50mg/mL PFL溶液。将制得PFL溶液缓慢加入氨基酸水凝胶前体溶液中混匀。

将制备好的水凝胶样本转移至石英玻片上，使用真空干燥机对样本充分脱水干燥后进行研磨，测定水凝胶干粉的傅里叶变换红外(FTIR)光谱并记录。

如图1所示为傅里叶变换红外(FT-IR)光谱图。从图中可以看出，与溶液相的FTIR光谱相比，Fmoc-Phe&Phe2溶液相和Fmoc-Phe&Phe2凝胶相的特征C＝O拉伸带峰从1714cm-1移动至1665cm-1，这表明相较于溶液相，凝胶相存在分子间氢键基序。因此Fmoc-Phe&Phe2构成凝胶依赖分子间氢键的形成。没有生成新的化学键，在凝胶分解后不会产生新的代谢产物物，避免皮下水凝胶分解后的毒副反应。

实施例2

厚度为1cm的水凝胶不同波长处透光率：

可注射蛋白质水凝胶的制备过程：

将氨基酸水凝胶样本置于检测池中，用紫外可见光分光光度计记录UV光谱，记录光谱波长范围从200nm至1000nm。通过对应波长的吸光度数值可计算出当前波长的光透射率。

如图2所示为厚度为1cm的水凝胶不同波长处透射率，从图中可以看出，在ICG吸收波长峰值处808nm处，1cm(比色皿光径)厚度氨基酸水凝胶透射率约为84.5％，有较高的透光能力。

实施例3

可注射水凝胶支架包载红细胞-胰岛素：

红细胞-胰岛素水凝胶的制备过程：

精确称量Fmoc-Phe 16mg和Phe2 12mg缓慢加入1mL PBS(pH 7.4)与420μL0.5mol/L的NaOH的混合溶液中并缓慢搅拌至完全溶解，此时溶液终浓度为Fmoc-Phe11.3mg/mL和Phe2 8.5mg/mL。用0.1mol/L HCl溶液将pH调节为7.0，此时溶液体积约为3.5mL。

将荧光假单胞菌脂肪酶(PFL)完全溶解于PBS(pH 7.4)中以配制100μL 50mg/mLPFL溶液。将制得PFL溶液缓慢加入氨基酸水凝胶前体溶液中混匀。

取1mL包载了胰岛素的红细胞以适当体积比加入氨基酸水凝胶前体溶液，接着加入100μl 50mg/mL PFL溶液，缓慢混匀后于37℃恒温水浴10分钟，红细胞-胰岛素水凝胶即可固化，建议在10分钟内采用20号注射器完成皮下注射。

SEM样本制备：

为了研究在红细胞-胰岛素水凝胶的制备过程中红细胞的形态变化，用戊二醛固定红细胞后，按照浓度梯度为35％至100％进行乙醇脱水，最后使用真空干燥机干燥。红细胞-胰岛素水凝胶的SEM样本制备步骤如下：在4℃下，将样品用含2.5％(v/v)戊二醛的PBS(0.1mol/L，pH 7.4)溶液处理24小时。用PBS溶液反复离心洗涤后，将样品在室温下分别用不同浓度的乙醇溶液处理15分钟，使用真空干燥机干燥后使用溅射涂布机将所有样品涂上10nm厚的金膜。使用扫描电子显微镜，以10keV的电子加速电压检查涂层样品。

从图3可以看出，与可注射蛋白质水凝胶混合的红细胞仍然显示出典型的双凹面圆盘状结构，从形态上接近正常的红细胞。因此，在可注射蛋白质水凝胶内的红细胞可能能够保持其基本的生物学特性，能够承受一定的机械牵张或挤压力。

从图4中可以看出，构建的红细胞-胰岛素水凝胶能够在PFL加入后2分钟依然保持流动性(A)，凝固成胶体(B)，并且具有可塑形性(C)。

实施例4

水凝胶的溶胀率：

使用重量分析法测定水凝胶的溶胀率(％)。将样本缓慢浸入PBS(pH 7.4)中并于37℃恒温水浴，每小时取出样本静置5分钟控干表面水分后，记录样本剩余重量。

如图5所示，制备所得的水凝胶、红细胞-胰岛素水凝胶(ER@hydrogel)有着近乎相似的溶胀曲线，因此在溶胀动力学上，两者有着相似的表现。经过6小时的吸收，重量从4.7mg增长到6.0mg并且曲线逐渐平稳不再增长。较低的溶胀能力能够防止皮下水凝胶大量吸收周围组织组织液，抑制水凝胶膨胀，压迫表皮且对水凝胶多孔结构产生破坏。

实施例5

水凝胶生物兼容性及安全性：

INS@ER-ICG水凝胶的制备过程：

精确称量Fmoc-Phe 16mg和Phe2 12mg缓慢加入1mL PBS(pH 7.4)与420μL0.5mol/L的NaOH的混合溶液中并缓慢搅拌至完全溶解，此时溶液终浓度为Fmoc-Phe11.3mg/mL和Phe2 8.5mg/mL。用0.1mol/L HCl溶液将pH调节为7.0，此时溶液体积约为3.5mL。

将荧光假单胞菌脂肪酶(PFL)完全溶解于PBS(pH 7.4)中以配制100μL 50mg/mLPFL溶液。将制得PFL溶液缓慢加入氨基酸水凝胶前体溶液中混匀。

1、动物实验

在小鼠模型背部皮下注射蛋白质水凝胶作为支架。

如图6所示的为分别从3、5、7、10天取小鼠注射水凝胶部位的皮肤组织。绿色荧光为通过F4/80抗体特异性标记的巨噬细胞。从对照组看，第三天巨噬细胞略微聚集，第5天明显增多，第7天弥漫满视野，第10天逐渐聚集。同时，在水凝胶处理的组内，发现荧光较少且强度较弱，第10天荧光强度和数目依然处于较低水平——这与对照组形成鲜明对比，由此说明，该试验中的氨基酸水凝胶能够有效抑制巨噬细胞的浸润，从而减少水凝胶注射区域的炎症反应。

如图7所示，皮下凝胶形状类似于半个椭球体，经过计算，可以发现水凝胶支架可以长时间保持较低的塌陷率，注射后第六天仍保持体积的50％，10天后完全消失(图8)。这证明了水凝胶具有良好的体积支架作用，并且可以在短时间内完全代谢。

如图9所示，皮下注射后病理分析显示，3-7天，在皮下能够发现水凝胶(M)，而到10天，水凝胶消失。说明该水凝胶皮下注射后，能够自然分解，被机体吸收。

2、安全性评价

为了研究可注射蛋白质水凝胶对健康组织的潜在风险，在注射可注射蛋白质水凝胶后第3、5、7和10天处死糖尿病小鼠，并对各主要器官和注射部位的皮肤组织进行组织学分析。通过苏木精和曙红(H&E)方法对包括心脏，肝脏，肾脏，肺和脾脏在内的器官进行检查。

如图10所示，H&E染色在组织切片中未显示出可检测到的损伤，这表明可注射蛋白质水凝胶不会导致这些器官的损伤。

如图11所示，血液生化学分析中，肝功能指标，包括碱性磷酸酶(ALP)，丙氨酸转氨酶(ALT)，天冬氨酸转氨酶(AST)，肾功能指标尿素氮(BUN)，肌酐(Cr)和球蛋白(GLB)也正常。因此，在测试过程中，表明在可注射蛋白质水凝胶治疗1、3、5和7天后，大鼠没有明显的肝肾毒性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。