水稻双向单碱基编辑的共转录单元基因ABE-CBE系统及其应用

摘要

本发明提供了一种水稻双向单碱基编辑的共转录单元基因ABE‑CBE系统、载体及其应用，所述共转录单元基因ABE‑CBE包括腺嘌呤脱氨酶的编码基因TadA和胞嘧啶脱氨酶编码基因CDA，所述共转录单元基因mutant TadA与LjCDAL1的编码序列构建于同一表达载体中。本发明融合了包含胞嘧啶碱基编辑器和腺嘌呤碱基编辑器的表达载体，造成基因组特异位点的核苷酸替换，实验证明，利用本发明设计的融合编辑工具构建植物表达载体，进而构建水稻靶向编辑载体，导入水稻细胞后造成水稻特异基因位点的DNA上的A:T至G:C相互替换的效率提升，可以在基因的特异位点实现C到T和A到G的同时替换，扩展了应用范围的同时减少了脱靶的产生。使得融合的A‑C base editing系统具有更广泛地应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及两种碱基编辑器的融合及应用。

背景技术

基因编辑技术是近年来取得突破性进展的颠覆性技术之一。CRISPR/Cas9基因编辑系统简便、高效，被广泛应用于基因功能研究和利用。尽管CRISPR/Cas9可以高效靶向目的基因，但其定点修饰依赖于效率低下的同源重组机制，因此精准编辑基因的能力有待提高。单碱基编辑技术(base editor，BE)通过将Cas9切口酶(Cas9 nikase,Cas9n)或无核酸酶活性的Cas9(nuclease dead Cas9,dCas9)与胞嘧啶脱氨酶形成融合蛋白，并通过sgRNA(单链向导RNA)将融合蛋白靶向靶位点，在不切割双链DNA的情况下对靶基因位点的单个碱基进行胞嘧啶C到胸腺嘧啶T或鸟嘌呤G到腺嘌呤A的精准编辑。现有编辑器可分为介导C:G突变成T:A定点替换的胞嘧啶碱基编辑器(cytidine base editor,CBE)，以及A:T突变成G:C定点替换的腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor,ABE)。

大量的植物全基因组关联性(GWAS)分析研究已经表明，许多重要的农艺性状与单碱基变异密切相关。因此，单碱基编辑技术已在植物、动物以及人细胞中进行了高效的基因定点突变，在农业、生物医学研究甚至基因治疗中有广泛的应用前景。

发明内容

传统的植物基因碱基编辑系统是通过瞬时或稳定遗传转化方式，将编辑体系导入植物细胞中。但是，传统的碱基编辑系统编辑效率并不高，高编辑效率的碱基编辑系统非常有限，能够提供更多的高效水稻编辑系统具有很大的应用价值。为了获得高效的水稻双向编辑系统，本发明中设计了mutant TadA介导的高效腺嘌呤碱基编辑系统和Os-LjCDAL1介导的高效、宽窗口的胞嘧啶碱基编辑系统，并将二者融合在一起。目前尚未见到报道有人将ABE系统和CBE系统融合。而本发明不仅可以在相同位点介导两种编辑器同时发挥作用，而且能够进一步的减少非预期碱基替换的产生，具有广泛的应用价值。

具体而言，本发明提供一种水稻双向单碱基编辑的共转录单元基因ABE-CBE系统，其特征在于，所述共转录单元基因ABE-CBE包括腺嘌呤脱氨酶的编码基因TadA和胞嘧啶脱氨酶编码基因CDA，所述共转录单元基因mutant TadA与Os-LjCDAL1的编码序列构建于同一表达载体中。

实际上，本发明采用了一种新的编辑器融合策略，本发明将腺嘌呤脱氨酶的编码基因mutant TadA和胞嘧啶脱氨酶基因Os-LjCDAL1均导入受体中，使sgRNA、mutant TadA、nCas9和Os-LjCDAL1在受体中表达，从而对受体基因组中的靶基因进行碱基编辑。本发明采用了优化后的高编辑效率、宽窗口的胞嘧啶脱氨酶基因Os-LjCDAL1保证了这种融合的有效实施。

优选地，本发明提供了一种具有水稻双向单碱基编辑的共转录单元基因ABE-CBE系统的表达载体，所述共转录单元基因ABE-CBE的各个基因片段连接到同一表达框内，并且连接sgRNA编码基因后的序列至少包含：

(a)序列表中SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列；或者

(b)在序列表中SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸且能够进行水稻基因组剪切的核苷酸序列；或者

(c)在序列表中SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸且能够进行水稻基因组剪切的核苷酸序列；或者

(d)在序列表中SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸且能够进行水稻基因组剪切的核苷酸序列。

优选地，所述系统包含共融合编辑工具，所述共融合编辑工具中腺嘌呤脱氨酶的编码基因mutant TadA位于SpCas9蛋白的编码基因SpCas9n的5’端；胞嘧啶脱氨酶的编码基因LjCDAL1位于SpCas9蛋白的编码基因SpCas9n的3’端，且3个基因中间用分别用31个氨基酸的linker和106个氨基酸的linker串联，在整个表达单元的5’端放置促进基因表达的GCCACC的kozrk序列，在3’端放置3×NLS核定位信号。

另一方面，本发明提供一种构建水稻双向单碱基编辑的融合编辑工具的方法，其特征在于，所述方法包括合成含有所述胞嘧啶脱氨酶CDA和腺嘌呤脱氨酶的编码基因mutant TadA，并在两端加有NotI/SacI酶切位点，利用NotI/SacI酶切植物表达载体pHUC411载体并回收，将基因序列mutant TadA-nCas9-LjCDAL1连接到表达载体，利用酶切位点将载体上的启动子连同基因序列连入植物表达载体，再将所述植物表达载体导入受体。

另一方面，本发明提供获得水稻双向单碱基编辑的方法，该方法包括将所述胞嘧啶脱氨酶LjCDAL1和腺嘌呤脱氨酶mutant TadA导入受体中，使sgRNA、胞嘧啶脱氨酶LjCDAL1、腺嘌呤脱氨酶mutant TadA在受体中表达，从而对受体基因组中的靶基因进行碱基编辑。

另一方面，在表达载体的基础上，根据实验的实际需要，本发明还构建了相应的基因打靶载体。

在另一个方面，本发明提供一种利用pHUC411-TadA-LjCDAL1表达载体(其含有所述高编辑效率SpCas9-LjCDAL1基因及其应用)构建打靶载体并导入细胞的方法。在表达载体的基础上只需进行简单的退火、酶切连接作用即可获得特异基因的打靶载体(pHUC411-TadA-LjCDAL1-NRT1.1)。将打靶载体导入水稻细胞的方法包括下述步骤：

(1)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；

(2)将次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基预培养；

(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与携带mutant TadA-nSpCas9-LjCDAL1的打靶载体(pHUC411-TadA-LjCDAL1-NRT1.1)的农杆菌接触15分钟；

(4)将步骤(3)的愈伤组织转移到上垫上三张无菌滤纸(加入2.5-3.5mL农杆菌悬浮培养基)的培养皿中，21-23℃培养48小时；

(5)将步骤(4)的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；

(6)将步骤(5)的愈伤组织转移筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；

(7)将抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；和

(8)将步骤(7)的苗转移到生根培养基中生根。

其中所述步骤(1)中的种子是成熟种子；所述步骤(1)、(2)中的诱导培养基是说明书表1所列出的诱导培养基；所述步骤(3)中的与农杆菌接触是将愈伤组织浸泡在所述农杆菌悬浮液中；所述步骤(4)中的农杆菌悬浮培养基是说明书表1所列出的悬浮培养基；所述步骤(5)中的前筛选培养基是说明书表1所列出的前筛选培养基；所述步骤(6)中的筛选培养基是说明书表1所列出的筛选培养基；所述步骤(7)中的分化再生培养基是说明书表1所列出的分化再生培养基；所述步骤(8)中的生根培养基是说明书表1所列出的生根培养基。

在优选的实施方案中，其中所述水稻是粳稻，更优选地，所述水稻是粳稻日本晴。

表1培养基的示例性配方

表格中所提到的“优化的N6大量元素”指的是，该N6大量元素中[NO

在优选的实施方案中，所述mutant TadA-nSpCas9-LjCDAL1标记基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，具体如：

SEQ ID NO:1

GCGGCCGCGCCACCATGTCCGAGGTGGAATTTAGCCACGAGTATTGGATGAGGCA

CGCGCTCACACTCGCCAAGAGGGCGAGGGACGAGAGGGAAGTGCCAGTCGGCGC

GGTGCTGGTGCTGAACAACCGCGTGATCGGCGAGGGTTGGAATAGGGCCATTGGC

CTCCACGACCCGACAGCCCATGCCGAGATTATGGCCCTCAGGCAGGGTGGTCTGG

TGATGCAGAACTATCGCCTCATCGACGCCACCCTCTACGTCACCTTTGAGCCATGC

GTGATGTGCGCCGGCGCCATGATCCACTCCAGGATCGGCCGCGTCGTCTTCGGCGT

GAGGAACGCCAAAACAGGCGCCGCGGGCAGCCTCATGGATGTGCTCCACTACCCG

GGGATGAATCACAGGGTGGAAATCACCGAAGGCATTCTCGCCGATGAGTGCGCTG

CTCTGCTGTGCTACTTCTTTAGGATGCCGAGGCAGGTGTTTAACGCCCAGAAGAAG

GCGCAATCCTCCACCGATAGCGGTGGTTCCTCCGGGGGCTCCTCCGGCTCCGAAA

CTCCGGGCACAAGCGAAAGCGCCACACCGGAATCCTCCGGCGGGTCCTCCGGTGG

TTCCgacaagaagtactccatcggcctcGCTatcggcaccaattctgttggctgggccgtgatcaccgacgagtacaaggtgcc

gtccaagaagttcaaggtcctcggcaacaccgaccgccactccatcaagaagaatctcatcggcgccctgctgttcgactctggcgag

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ctccaacgagatggccaaggtggacgacagcttcttccacaggctcgaggagagcttcctcgtcgaggaggacaagaagcacgagc

gccatccgatcttcggcaacatcgtggatgaggtggcctaccacgagaagtacccgaccatctaccacctccgcaagaagctcgtcga

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ctcaacccggacaactccgatgtggacaagctgttcatccagctcgtgcagacctacaaccagctgttcgaggagaacccgatcaacg

cctctggcgttgacgccaaggctattctctctgccaggctctctaagtcccgcaggctcgagaatctgatcgcccaacttccgggcgag

aagaagaatggcctcttcggcaacctgatcgccctctctcttggcctcaccccgaacttcaagtccaacttcgacctcgccgaggacgc

caagctccagctttccaaggacacctacgacgacgacctcgacaatctcctcgcccagattggcgatcagtacgccgatctgttcctcg

ccgccaagaatctctccgacgccatcctcctcagcgacatcctcagggtgaacaccgagatcaccaaggccccactctccgcctccat

gatcaagaggtacgacgagcaccaccaggacctcacactcctcaaggccctcgtgagacagcagctcccagagaagtacaaggag

atcttcttcgaccagtccaagaacggctacgccggctacatcgatggcggcgcttctcaagaggagttctacaagttcatcaagccgat

cctcgagaagatggacggcaccgaggagctgctcgtgaagctcaatagagaggacctcctccgcaagcagcgcaccttcgataatg

gctccatcccgcaccagatccacctcggcgagcttcatgctatcctccgcaggcaagaggacttctacccgttcctcaaggacaaccg

cgagaagattgagaagatcctcaccttccgcatcccgtactacgtgggcccgctcgccaggggcaactccaggttcgcctggatgacc

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GCGGCGGCACCGGCGGCGGCGGCTCCGCCGAGTATGTGAGGGCCCTCTTCGATTT

CAACGGCAATGACGAGGAGGATCTCCCTTTCAAGAAGGGCGACATCCTGCGCATT

CGGGATAAGCCGGAGGAGCAGTGGTGGAACGCGGAGGACTCTGAGGGCAAGCGC

GGCATGATCCTCGTGCCATACGTCGAGAAGTACTCCGGCGATTACAAGGACCACGA

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GACGAGAATGTGAGGGTGTCCGAGAAGCTGGATTTCAACACATTCGAGTTCGAGT

TCGAGAATCTCCATTACGCCGAGGGAAGGGGCCGCACCTACGTGATCTTCGACGTC

AAGCCACAGTCAGAGGGCGGCCGGGGCAAGAGGCTGTGGGGCTACGTGAGGAAC

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附图说明

图1为pHUC411-TadA-LjCDAL1载体质粒示意图。

图2为pHUC411-TadA-LjCDAL1编辑NRT1.1基因突变示例。

图3为pHUC411-TadA和pHUC411-LjCDAL1编辑NRT1.1基因突变示例。

具体实施方式

以下结合附图叙述本发明的实施例。应该说明，下述实施例仅用于对本发明的示例性实现方式进行说明，而并非对本发明进行任何限制。本领域技术人员可以对本发明作出某些等同的改动和显而易见的改进。

在没有其他具体说明的情况下，下述具体实施方式中的操作均采用本领域通用的常规操作来进行。本领域技术人员可以很容易地从现有技术中获得关于这样的常规操作的教导，例如可以参照教科书Sambrook and David Russell，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3rd ed.,Vols1,2；Charles Neal Stewart,Alisher Touraev,VitalyCitovsky and Tzvi Tzfira,Plant Transformation Technologies等。下述实施例中所用的药材原料、试剂、材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1——mutant TadA-nSpCas9-LjCDAL1基因的拼接

本申请的基因被命名为mutant TadA-nSpCas9-LjCDAL1，序列如SEQ ID NO:1所示。

首先，申请人通过大量实验设计并筛选到了一种宽窗口、高编辑效率的七鳃鳗的类胞嘧啶脱氨酶(cytidine deaminase，LjCDAL1)基因，命名为Os-LjCDAL1(序列如SEQ IDNO:2)，其编辑效率可达80％以上。将Os-LjCDAL1基因送苏州金唯智生物科技有限公司合成后，连接于PUC57-AMP载体上，形成PUC57-AMP-LjCDAL1载体，并装载入大肠杆菌XL-blue菌株中。

其次，人工合成适用于水稻的突变型腺嘌呤脱氨酶TadA，命名为mutant TadA，连接于PUC57-AMP载体上，形成PUC57-AMP-mutant TadA载体，并装载入大肠杆菌XL-blue菌株中。

根据Gibson拼接原理，mutant TadA基因，nSpCas9基因，基因Os-LjCDAL1，并连接于PUC57-AMP载体上。具体操作如下：

根据mutant TadA基因，nSpCas9基因，基因Os-LjCDAL1的拼接顺序及PUC57-AMP载体序列，分别合成引物：

TadA HR FP：

5’-TTACGCCAAGCTGCCCTTGGCGGCCGCGCCACCATGTCCGAGGTGGAATTTAGCCAg-3’

TadA HR RP:5’-ccgatggagtacttcttgtcGGAACCACCGGAGGACCCG-3’

SpCas9 HR FP:5’-GGTCCTCCGGTGGTTCCgacaagaagtactccatcggccG-3’

SpCas9 HR RP:5’-TCTTCGGGTCGGCCCGGCTGGAGCCGCCGGAatcgccgc-3’

LjCDAL1 HR FP:5’-ggcgatTCCGGCGGCTCCAGCCGGGCCGACCCGAAGAAG-3’

LjCDAL1 HR RP:5’-GCGAATTGAAGCTGCCCTTGGAGCTCTCAGACCTTTCTCTTCTTCTT-3’

以mutant TadA基因为模板，用引物TadA HR FP及TadA HR RP进行PCR扩增，回收PCR产物。以nSpCas9基因为模板，用引物SpCas9 HR FP及SpCas9 HR RP进行PCR扩增，回收PCR产物。以OsLjCDAL1基因为模板，用引物LjCDAL1 HR FP及LjCDAL1 HR RP进行PCR扩增，回收PCR产物。将上述的三个回收片段以及经EcoRI酶切之后的PUC57-AMP载体片段，根据Gibson拼接原理，按照NEB Golden Gate Assembly Kit说明书，构成mutant TadA基因，nCas9基因，OsLjCDAL1融合在一起的基因，命名为mutant TadA-nSpCas9-LjCDAL1基因。

实施例2——含有mutant TadA-nSpCas9-LjCDAL1基因植物打靶载体的构建

从上面含有mutant TadA-nSpCas9-LjCDAL1载体的大肠杆菌XL-blue，用Axygen质粒提取试剂盒中提取质粒，用NotI/SacI酶切，回收OsSpCas9-LjCDAL1片段。同时利用NotI/SacI酶对pHUC411进行线性化处理，回收pHUC411，将上述的mutant TadA-nSpCas9-LjCDAL1片段和pHUC411片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到植物表达载体pHUC411mutant TadA-nSpCas9-LjCDAL1(图1)，命名为pHUC411-TadA-LjCDAL1。

选择水稻NRT1.1基因(Os10g0554200)中第3105-3124位的核苷酸序列CGGCGACGGCGAGCAAGTGG

实施例3——以pHUC411-TadA-LjCDAL1-NRT1.1为打靶载体的水稻遗传转化及突变体的获得。

1、成熟胚愈伤组织的诱导和预培养

将日本晴的成熟种子去壳，选取外观正常、洁净无霉斑的种子，用70％酒精，摇晃90sec，倒掉酒精；再用含Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％，每100毫升加入1滴Tween20)溶液清洗种子，在摇床上晃动45min(180r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5-10遍至无次氯酸钠气味，最后加入无菌水，30℃浸泡过夜。用手术刀片沿糊粉层分离胚，盾片朝上放置在诱导培养基(成分见表1)上，12粒/皿，30℃暗培养以诱导愈伤组织。

两周后出现球形、粗糙、浅黄色的次级愈伤组织，可以进行预培养操作，即将次级愈伤转至新的愈伤组织诱导培养基上，30℃暗培养预培养5天。预培养结束后，将状态良好、分裂旺盛的小颗粒用勺收集至50mL的无菌离心管中，用于农杆菌侵染。

2、农杆菌菌株的培养和悬浮液准备

将含有pHUC411-TadA-LjCDAL1-NRT1.1载体的农杆菌菌株EHA105在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上划线(成分见表1)，28℃黑暗培养，24h后用无菌接种环将活化的农杆菌接种至新鲜的50mg/L卡那霉素的LB平板上，进行第二次活化，28℃黑暗培养过夜。在50mL的无菌离心管中加入20-30mL农杆菌悬浮培养基(成分见表1)，用接种环将活化2次的农杆菌刮下，调整OD660至约0.10-0.25，室温静置30min以上。

3、侵染和共培养

向准备好的愈伤组织中(见步骤1)，加农杆菌悬浮液，浸泡15min,其间不时轻轻晃动。浸泡结束后倒掉液体(尽量将液体滴净)，用无菌滤纸吸去愈伤组织表面的多余的农杆菌菌液，并在超净台中用无菌风吹干。在100×25mm的一次性无菌培养皿垫上三张无菌滤纸，加入2.5mL农杆菌悬浮培养基，将吸干后的愈伤组织均匀分散在滤纸上，23℃黑暗培养48h。

4、前筛选和筛选培养

共培养结束后，将经共培养的愈伤组织均匀散布于前筛选培养基(成分见表1)中，30℃黑暗培养5天。前筛选培养结束后，将愈伤组织转至筛选培养基上(成分见表1)，每个培养皿接25粒愈伤组织，30℃黑暗培养，2-3周后，抗性愈伤组织生长明显，可进行分化再生操作。

5、分化再生

每个独立转化体挑选2-3颗生长状态良好、新鲜的小颗粒，转至分化再生培养基上(成分见表1)。每培养皿接5个独立转化体。28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。

6、生根与移栽

当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时，每个独立转化体只取一株生长良好的苗，移至生根培养基上(成分见表1)，28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。两周后，选择根系发达的小苗，用水洗去培养基，移栽入土。

7、分子鉴定

在移栽之前，采取水稻叶片样品，用CTAB法进行DNA小提。将所得到的基因组DNA样品用于PCR分析。设计PCR引物5’-TGGTTTGTAATATGGGTGCAGG-3’及5’-CACCACCTGCTTCACCTCCTC-3’，用于扩增NRT1.1靶标附近的133bp序列。将PCR组分首先在95℃保持5分钟，然后进行35个循环：94℃30秒、58℃30秒、72℃20秒，最后72℃延伸10分钟。将PCR产物测序。所测结果与野生型序列进行比对(图2和图3)。pHUC411-TadA-LjCDAL1-NRT1.1获得的植株中，检测的48株植株中有36株发生碱基替换，效率为75％。其中C-T和A-G同时发生的突变的植株有27株，效率为56.3％，只发生C-T替换的植株有4株，只发生A-G替换的植株有5株。(图2)。使用实验室已有的表达载体pHUC411-LjCDAL1和pHUC411-TadA(其序列参见SEQ ID No.2和3)，分别连接NRT1.1靶标，得到单向碱基突变的靶向载体作为对照组，结果表明pHUC411-LjCDAL1-NRT1.1和pHUC411-TadA-NRT1.1所得的植株中突变均为单一类型或非预期突变。由此可见，pHUC411-TadA-LjCDAL1不仅能高效的介导双向的碱基替换，而且能够避免非预期突变的产生。

序列表

<110> 安徽省农业科学院水稻研究所

合肥丰乐种业股份有限公司

<120> 水稻双向单碱基编辑的共转录单元基因ABE-CBE系统及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6044

<212> DNA

<213> mutant TadA-nSpCas9-LjCDAL1

<400> 1

gcggccgcgc caccatgtcc gaggtggaat ttagccacga gtattggatg aggcacgcgc 60

tcacactcgc caagagggcg agggacgaga gggaagtgcc agtcggcgcg gtgctggtgc 120

tgaacaaccg cgtgatcggc gagggttgga atagggccat tggcctccac gacccgacag 180

cccatgccga gattatggcc ctcaggcagg gtggtctggt gatgcagaac tatcgcctca 240

tcgacgccac cctctacgtc acctttgagc catgcgtgat gtgcgccggc gccatgatcc 300

actccaggat cggccgcgtc gtcttcggcg tgaggaacgc caaaacaggc gccgcgggca 360

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gtggtggacg agctggtgaa ggtgatgggc aggcacaagc cagagaacat cgtgatcgag 2880

atggcccgcg agaaccagac cacacagaag ggccaaaaga actcccgcga gcgcatgaag 2940

aggatcgagg agggcattaa ggagctgggc tcccagatcc tcaaggagca cccagtcgag 3000

aacacccagc tccagaacga gaagctctac ctctactacc tccagaacgg ccgcgacatg 3060

tacgtggacc aagagctgga catcaaccgc ctctccgact acgacgtgga ccatattgtg 3120

ccgcagtcct tcctgaagga cgactccatc gacaacaagg tgctcacccg ctccgacaag 3180

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