一种常温下保存粪便样本中细菌DNA的保存液

摘要

本发明提供了一种常温下保存粪便样本中细菌DNA的保存液，包括氯化钠、无水乙醇、生物抑菌剂、EDTA二钠和去离子水；保存液中各组分的占比如下：氯化钠0.5‑2mol/L；无水乙醇20‑60％(v/v)；生物抑菌剂0.01‑0.2％(v/v)；EDTA二钠为10‑100mmol/L；余量为去离子水；其中，保存液的PH为7‑8，生物抑菌剂为Proclin 300。本发明能够在常温环境下保证粪便样品中微生物的DNA不被降解，并通过良好的保存性能使粪便样本中微生物的数量、组成和丰度保持稳定，保证肠道菌群测序后数据分析的准确性；本发明实现了粪便样本的常温保存与运输，适用于长距离运输，相较于市场上现有的保存液，具有保存效果好、操作简单、适用性好、无毒害的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及DNA保存液技术领域，尤其涉及一种常温下保存粪便样本中细菌DNA的保存液。

背景技术

低温冷冻保存是保存粪便样本中微生物最常见的方法，但是低温保存通常需要大型制冷设备，普适性较差，操作复杂，因此通过开发适合微生物保存的DNA保存液显得十分必要。

目前，市场上的DNA保存液中，通常含有异硫氰酸胍等有毒成分，或是成分单一导致样本中的微生物容易污染，微生物的组成和数量发生改变，无法真实反映样本的生物学信息。。

发明内容

为解决上述问题，本发明公开了一种常温下保存粪便样本中细菌DNA的保存液，解决了常温环境下保存粪便样品中微生物DNA的难题，并适用于长距离运输，相较于之前的同类产品保存效果更好、操作方法更简单且无毒性分子，对于保证肠道菌群测序后数据分析的准确性具有益处。

具体方案如下：

采样时将采集到的粪便样本置于粪便保存液中，混匀后常温环境保存，可保证微生物的组成和数量无显著改变。

一种常温下保存粪便样本中细菌DNA的保存液，其特征在于，包括氯化钠、乙醇、生物抑菌剂、EDTA二钠和去离子水。

作为本发明的进一步改进，保存液中各组分的占比如下：

氯化钠的质量比为1mol/L；无水乙醇的体积比为30％(v/v)；生物抑菌剂的体积比为0.1％(v/v)；EDTA二钠的质量比为20mmol/L；余量为去离子水；其中，保存液的PH范围在7-8之间，生物抑菌剂为Proclin 300。

作为本发明的进一步改进，保存液的制备方法为：先将氯化钠和EDTA二钠用去离子水溶解，并用去离子水定容，然后调节pH，在灭菌后加入无水乙醇和生物抑菌剂即得粪便保存液。

本发明的有益效果在于：能够在常温环境下保证粪便样品中微生物DNA不被降解，并通过良好的保存性能稳定粪便样本中微生物的组成和数量无显著改变，保证肠道菌群测序后数据分析的准确性；本发明实现了粪便样本的常温保存与运输，适用于长距离运输，相较于市场上现有的保存液，具有保存效果好、操作简单、适用性好、无毒害的优点。

附图说明

图1为实施例中粪便样本1在不同保存方式下细菌门水平构成比例示意图。

图2为实施例中粪便样本2在不同保存方式下细菌门水平构成比例示意图。

图3为实施例中粪便样本3在不同保存方式下细菌门水平构成比例示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

本发明一种常温下保存粪便样本中细菌DNA的保存液，包括氯化钠、无水乙醇、生物抑菌剂、EDTA二钠和去离子水。

在本实施例中，保存液中各组分的占比如下：

氯化钠1mol/L；无水乙醇30％(v/v)；生物抑菌剂0.1％(v/v)；EDTA二钠20mmol/L；余量为去离子水。

其中，保存液的PH范围在7-8之间，生物抑菌剂为Proclin 300。

本实施例中，保存液的制备方法为：

(1)取上述所述配比的原料；

(2)将步骤(1)中称取的EDTA二钠配制成预备溶液后保存；其中pH为6-8.5的Tris-HCl缓冲液。

(3)根据预配制的粪便保存用的总体积，结合体系中各组分的含量要求，选用相应体积的EDTA溶液，加入相应量的氯化钠，补加无菌水至预配制的不包含无水乙醇的粪便保存总体积，采用微孔滤膜过滤的方式进行除菌，得到所述粪便保存液预备液。灭菌的条件为，采用微孔滤膜过滤的方式进行除菌。

(4)灭菌后的粪便保存液预备液加入相应量的无水乙醇和生物抑菌剂，然后调节PH，得到所述粪便保存液

按上述方案，步骤(4)中的体系pH值在需要时可通过加入HCl或者NaOH调节PH至范围在7-8之间，其中HCl或者NaOH的加入量很少，对体系中各组分浓度的影响可忽略不计。保存的温度为15-25℃，保存的条件为避光保存。

本发明的粪便保存液的使用方法是：将0.2-0.5g粪便与2-4ml粪便保存液混合，常温保存。

本发明的粪便保存液保护微生物基因组DNA的完整性，防止了微生物的污染，从保存液中提得的DNA适用于下游多种基因检测，如PCR、芯片分析及二代测序等。

由于采用了以上技术，本发明较现有技术相比，具有的有益效果如下：

本发明的粪便保存液保存粪便样本，成本较低，配制方便，可以有效抑制核酸酶的活性，防止微生物的污染、保证DNA的片段不被降解，适用于常温环境下使用能够保证样本在各地之间的运输的稳定性。本发明的粪便保存液无毒性，更有利于使用人员健康安全。

实施例

采集了3位志愿者的粪便样本。每个志愿者的样品分装为4份，分别做4种不同处理，每种处理3份样本：

(1)保存0天：称取0.2g粪便样品，用粪便基因组提取试剂盒进行DNA提取，备用；

(2)实施例生产的本发明的唾液样本保存液保存7天：称取0.2g粪便样品，并于常温(15℃～25℃)保存在盛有本发明保存液的采集管中，在37℃条件下保存7天。7天到期后，用粪便基因组提取试剂盒对样本进行提取，备用。

(3)95％乙醇保存7天：称取0.2g粪便样品，并于常温(15℃～25℃)保存在盛有95％乙醇的采集管中，在37℃条件下保存7天。7天到期后，用粪便基因组提取试剂盒对样本进行提取，备用。

(4)对照保存液保存7天：称取0.2g粪便样品，并于常温(15℃～25℃)保存在盛有锐翌保存液的采集管中，在37℃条件下保存7天。7天到期后，用粪便基因组提取试剂盒对样本进行提取，备用。

对照保存液的各组分如下：氯化锂2.0mol/L，无水乙醇30％(v/v)，EDTA二钠50mmol/L；余量为去离子水。

粪便样本DNA提取按照QIAamp粪便基因组提取试剂盒的操作说明书进行抽提，抽提之前样本需要高速离心，丢弃上清，收集粪便样本：

取2ul粪便DNA用Qubit4.0检测其浓度(单位是ng/ul)，具体见表1。本发明保存一周的DNA浓度和保存0天的浓度结果较为接近，而95％乙醇保存一周的浓度结果则差于保存0天，这可能是微生物DNA造成降解，对照保存液保存一周的浓度结果则明显高于保存0天，这可能由于其菌群构成并未固定在取样初始状态，发生了增殖所致。

表1用Qubit 3种处理下粪便样本1-3的DNA浓度(单位ng/ul)

样品提取后的DNA样本进行16s rRNA基因V4区建库测序，获得测序数据后进行生物信息学分析，计算香农指数，从多样性角度进行比较。如表2所示，本发明保存一周的香农多样性和保存0天的结果较为接近，而95％乙醇保存一周的香农多样性则差于保存0天，对照保存液保存一周的香农指数则明显高于保存0天，香农指数结果和浓度的结果相一致。

表2香农多样性指数检测结果

门水平菌群构成的异同分析

提取后的DNA样本进行16s rRNA基因V4区建库测序，获得测序数据后进行生物信息学分析，计算每个样本中的细菌分属哪些菌门，进行比较。基于门水平的细菌相对丰度构成如图1所示，图1、2、3是三份粪便样本在4种保存方式下细菌门水平构成比例示意图，每一个柱子代表一种处理方式，保存方式可见图注。某种细菌占比多，则其在柱子中所占的比例就更大。结果表明，自制配方保存7天的细菌门水平构成比例和保存0天的结果较为接近，而95％乙醇保存7天、对照保存液保存7天的细菌门水平构成比例则明显异于保存0天。

基于DNA提取浓度、细菌丰富度分析和门水平菌群构成异同结果，得知本发明的保存液配方，其对粪便微生物保存效果较为接近保存0天处理，且明显优于对照配方的保存方案。

本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述实施方式所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。