一种鸡传染性贫血病病毒绝对荧光定量PCR检测方法

摘要

本发明涉及一种鸡传染性贫血病病毒绝对荧光定量PCR检测方法，科学地设计特异扩增鸡传染性贫血病病毒病毒VP1基因片段的引物，然后通过使用TaKaRa公司的TB Green™Premix Ex Taq™II试剂来进行绝对荧光定量PCR方法的建立。根据鸡传染性贫血病病毒VP1基因的高度保守区，科学设计并合成了扩增片段大小为140bp的上下游引物，引物序列如下：上游引物为VP1‑F：5′‑GCCCCGGTACGTATAGTGTG‑3′；下游引物为VP1‑R：5′‑CCCGTACATGTGGTCTGCAT‑3′；本发明可用于企业对鸡传染性贫血病病毒疫苗污染残留及临床样品中低含量鸡传染性贫血病病毒的快速且特异的检测；可通过定量检测鸡传染性贫血病病毒含量情况，从而了解鸡传染性贫血病病毒在体内的变化规律等，为进一步探究鸡传染性贫血病病毒的分子生物学特征及制定有效防控策略提供了有效手段。

说明书

技术领域

本发明涉及一种鸡传染性贫血病病毒绝对荧光定量PCR检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

鸡传染性贫血病病毒（Chicken Infectious Anemia Virus，CIAV）感染主要引起雏鸡障碍性贫血及全身性淋巴组织萎缩；成年鸡感染鸡传染性贫血病病毒后常呈亚临床带毒，导致生产性能以及免疫功能下降。鸡传染性贫血病病毒既能水平传播，又能垂直传播。自1979年首次报道以来，鸡传染性贫血病病毒已蔓延至世界各地。我国于1992年首次在黑龙江省分离到鸡传染性贫血病病毒，随后在河南、山东、江苏、辽宁、吉林等地的鸡群中也陆续分离到鸡传染性贫血病病毒。近年来，由于我国养鸡业的规模化、集约化发展，且缺乏有效的防控策略，该病在我国流行范围不断扩大，给养鸡业带来了严重的经济损失。现阶段，在临床上常用血清学检测方法（病毒中和试验、间接荧光抗体试验、ELISA 试验等）对疑似感染鸡传染性贫血病病毒的病例进行确诊。随着检测技术的不断进步，核酸探针技术、PCR技术、实时荧光定量PCR技术等逐步应用于鸡传染性贫血病病毒的特异性检测。现阶段，生产实践中鸡传染性贫血病病毒疫苗污染残留及临床样品中低含量鸡传染性贫血病病毒检测准确度较低，也缺少较为敏感且特异对鸡传染性贫血病病毒定量检测的方法。因此，本发明有利于完善鸡传染性贫血病病毒的检测方法，为进一步探究鸡传染性贫血病病毒的分子生物学特征及制定有效防控策略提供了一种技术支持。

发明内容

本发明的目的在于针对现有问题的不足，提供了一种鸡传染性贫血病病毒绝对荧光定量PCR检测方法。

本发明的技术方案是：一种鸡传染性贫血病病毒绝对荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）鸡传染性贫血病病毒基因组DNA的提取：鸡传染性贫血病病毒基因组DNA的提取通过使用Axygen公司的DNA小提试剂盒AxyPrep

（2）引物的设计与合成：根据鸡传染性贫血病病毒VP1基因的高度保守区，设计并合成了扩增片段大小为140bp的上下游引物，引物序列如下：上游引物为VP1-F：5′-GCCCCGGTACGTATAGTGTG-3′；下游引物为VP1-R：5′-CCCGTACATGTGGTCTGCAT-3′；引物使用前，用超纯水溶解，使用浓度为10pmol，-20℃保存备用；

（3）绝对荧光定量PCR方法的建立：通过使用TaKaRa公司的TB Green™ Premix ExTaq™ II试剂来进行绝对荧光定量PCR方法的建立，反应体系为20μL：A液：模板2μL，双蒸水6μL；B液：TB Green Premix Ex Taq II（2×）10μL，上下游引物各0.8μL，ROX ReferenceDyeⅡ（50×）0.4μL；加样时先在八联管反应管里加入B液，后加A液，上机前离心处理；反应程序如下：先95℃预变性30s，然后95℃变性5s，最后60℃退火34s；反应程序共40个循环；

（4）标准曲线的绘制：将实验室已经成功制备的pcDNA3.1-VP1质粒作为阳性标准品备用；将阳性标准品质粒换算拷贝数后，进行连续的10倍倍比稀释，从1∶10到1∶10

（5）绝对荧光定量PCR方法的灵敏度和特异性试验：通过标准曲线的绘制显示可检测到仅含10个病毒DNA拷贝数的鸡传染性贫血病病毒，体现出绝对荧光定量PCR方法的灵敏度；将实验室已有的禽腺病毒FAdV、禽白血病病毒ALV和网状内皮组织增生症病毒REV提取相应核酸，按照扩增体系运行程序；同时设鸡传染性贫血病病毒阳性对照及去离子水的阴性对照，检测结果体现出绝对荧光定量PCR方法的特异性。

本发明方法先进科学，通过本发明，提供的一种鸡传染性贫血病病毒绝对荧光定量PCR检测方法，本发明的原理和最核心的关键技术是科学地设计特异扩增鸡传染性贫血病病毒病毒VP1基因片段的引物，然后通过使用TaKaRa公司的TB Green™ Premix Ex Taq™ II试剂来进行绝对荧光定量PCR方法的建立。根据鸡传染性贫血病病毒VP1基因的高度保守区，科学设计并合成了扩增片段大小为140bp的上下游引物，引物序列如下：上游引物为VP1-F：5′-GCCCCGGTACGTATAGTGTG-3′；下游引物为VP1-R：5′-CCCGTACATGTGGTCTGCAT-3′；本发明公开了PCR扩增鸡传染性贫血病病毒VP1基因引物序列。

本发明的方案为：

（1）鸡传染性贫血病病毒基因组DNA的提取：鸡传染性贫血病病毒基因组DNA的提取通过使用Axygen公司的DNA小提试剂盒AxyPrep

（2）引物的设计与合成：根据鸡传染性贫血病病毒VP1基因的高度保守区，设计并合成了扩增片段大小为140bp的上下游引物，引物序列如下：上游引物为VP1-F：5′-GCCCCGGTACGTATAGTGTG-3′；下游引物为VP1-R：5′-CCCGTACATGTGGTCTGCAT-3′；引物使用前，用超纯水溶解，使用浓度为10pmol，-20℃保存备用。

（3）绝对荧光定量PCR方法的建立：本发明通过使用TaKaRa公司的TB Green™Premix Ex Taq™ II试剂来进行绝对荧光定量PCR方法的建立，反应体系为20μL：A液：模板2μL，双蒸水6μL；B液：TB Green Premix Ex Taq II（2×）10μL，上下游引物各0.8μL，ROXReference DyeⅡ（50×）0.4μL。加样时先在八联管反应管里加入B液，后加A液，上机前离心处理。反应程序如下：先95℃预变性30s，然后95℃变性5s，最后60℃退火34s，反应程序共40个循环。

（4）标准曲线的绘制：将实验室已经成功制备的pcDNA3.1-VP1质粒作为阳性质粒标准品备用。将阳性标准品质粒换算拷贝数后，进行连续10倍的倍比稀释，从1∶10到1∶10

（5）绝对荧光定量PCR方法的灵敏度和特异性试验：本发明在扩增结束后，对其扩增曲线图（见图1）、标准曲线图（见图2）、熔解曲线曲线图（见图3）进行综合分析。标准曲线中拷贝数与CT值两者呈线性反比关系，由标准曲线可知本发明检测灵敏度最低拷贝数为10，显示出建立的方法灵敏度高。基因片段回归方程为：Y=-3.061X+33.796，标准曲线相关系数R

有益效果

本发明将建立一种鸡传染性贫血病病毒绝对荧光定量PCR检测方法，可用于企业对鸡传染性贫血病病毒疫苗污染残留及临床样品中低含量鸡传染性贫血病病毒的快速且特异的检测；此外，可通过定量检测鸡传染性贫血病病毒含量情况，从而了解鸡传染性贫血病病毒在体内的变化规律等，为进一步探究鸡传染性贫血病病毒的分子生物学特征及制定有效防控策略提供了有效手段。因此，本发明具有一定生产实践应用价值。

附图说明

图1为 pcDNA3.1-VP1重组质粒的扩增曲线图。

图2为 pcDNA3.1-VP1重组质粒的标准曲线。

图3为 pcDNA3.1-VP1重组质粒的熔解曲线。

图4为 PCR检测感染鸡传染性贫血病病毒的组织样品；

泳道M，Super DNA Marker；

泳道1，CIAV阳性对照；

泳道2，空白对照；

泳道3-5，CIAV单感染第63天的3只鸡的肝组织；

泳道6-8，CIAV单感染第63天的3只鸡的脾组织；

泳道9-11，CIAV单感染第63天的3只鸡的肾组织；

泳道12-14，CIAV和ALV-J共感染第63天的3只鸡的肝组织；

泳道15-17，CIAV和ALV-J共感染第63天的3只鸡的脾组织；

泳道18-20，CIAV和ALV-J共感染第63天的3只鸡的肾组织。

图5为绝对荧光定量PCR检测感染鸡传染性贫血病病毒的组织样品中的拷贝数图。（绝对荧光定量PCR检测鸡传染性贫血病病毒单感染、鸡传染性贫血病病毒和J亚群禽白血病病毒共感染后第63天脏器组织中（肝、脾、肾）鸡传染性贫血病病毒DNA拷贝数。CIAV为鸡传染性贫血病病毒单感染，CIAV+ALV-J为鸡传染性贫血病病毒和J亚群禽白血病病毒共感染）。

具体实施方法

为更好的理解本发明的内容，结合以下实施方式，体现出本发明中一种鸡传染性贫血病病毒绝对荧光定量PCR检测方法的效果。

实施例

（1）鸡传染性贫血病病毒基因组DNA的提取：鸡传染性贫血病病毒基因组DNA的提取通过使用Axygen公司的DNA小提试剂盒AxyPrep

（2）PCR检测感染鸡传染性贫血病病毒的组织样品：引物为实验室已合成的针对鸡传染性贫血病病毒VP3基因的一对引物，扩增片段大小为366bp，引物序列如下：上游引物为VP3F：5′-ATGAACGCTCTCCAAGAAGATAC-3′；下游引物为VP3R：5′-TTACAGTCTTATACGCCTTTTTGCG-3′；本实验通过使用南京诺唯赞生物科技有限公司的2 xTaq Master Mix PCR酶进行PCR扩增，反应体系为25μL：2 x Taq Master Mix 12.5μL，模板2μL，上游引物和下游引物各1μL，灭菌ddH

（3）绝对荧光定量PCR检测感染鸡传染性贫血病病毒的组织样品：本实验通过使用TaKaRa公司的TB Green™ Premix Ex Taq™ II试剂来进行绝对荧光定量PCR方法的建立，反应体系为20μL：A液：模板2μL，双蒸水6μL；B液：TB Green Premix Ex Taq II（2×）10μL，上下游引物各0.8μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4μL。加样时先在八联管反应管里加入B液，后加A液，上机前离心处理。反应程序如下：先95 ℃预变性30s，然后95 ℃变性5s，最后60 ℃退火34s，反应程序共40个循环。根据标准曲线和CT值计算出组织样品中鸡传染性贫血病病毒的拷贝数，比较鸡传染性贫血病病毒在不同脏器组织中的含量（见图5），结果显示鸡传染性贫血病病毒在脾脏中含量最高，且远高于肝脏和肾脏中的含量。

（4）PCR检测和绝对荧光定量PCR检测鸡传染性贫血病病毒方法比较：通过对比PCR检测感染鸡传染性贫血病病毒的组织样品（见图4）与绝对荧光定量PCR检测感染鸡传染性贫血病病毒的组织样品（见图5），可以看出常规PCR可以检测出一定含量的鸡传染性贫血病病毒及仅能通过条带强弱大致反应含量多少，而绝对荧光定量PCR不仅可以检测到更少含量的鸡传染性贫血病病毒（10个拷贝数），还可以精确检测出鸡传染性贫血病病毒在不同脏器组织中（肝、脾、肾）的含量。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种鸡传染性贫血病病毒绝对荧光定量PCR检测方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gccccggtac gtatagtgtg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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