测定超敏肌钙蛋白T含量的磁微粒化学发光检测试剂盒

摘要

本发明为一种测定超敏肌钙蛋白T含量的磁微粒化学发光检测试剂盒，包括：R1试剂、R2试剂、磁分离试剂、校准品液系列和化学发光底物液；所述R1试剂为缓冲液，所述磁分离试剂为肌钙蛋白T单克隆抗体包被的磁微粒溶解在磁分离试剂的稀释液中配制成的肌钙蛋白T单克隆抗体包被的磁微粒溶液，R2试剂为碱性磷酸酶标记的肌钙蛋白T单克隆抗体溶解在R2试剂的稀释液中配制成的碱性磷酸酶标记的肌钙蛋白T单克隆抗体溶液，化学发光底物液为碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液。本发明为临床检测人血清中的肌钙蛋白T提供了一种更准确、精确、方便、快捷和简单的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及医用诊断试剂领域，特别是涉及一种采用磁微粒化学发光技术和抗原-抗体结合技术检测超敏肌钙蛋白T含量的磁微粒化学发光检测试剂盒。

背景技术

肌钙蛋白是肌肉收缩的调节蛋白，由三个结构不同的亚基组成，即肌钙蛋白T(TnT)、肌钙蛋白I(TnI)和肌钙蛋白C(TnC)。肌钙蛋白放松了肌动球蛋白，让肌动球蛋白与肌浆球蛋白互起作用，而造成肌肉收缩。心肌中的T和I亚基结构不同于其他肌肉组织，心肌钙蛋白T、I(cTnT、cTnI)由于分子量小，所以发病后血中浓度迅速升高。cTnT是横纹肌分子结构中的多肽链，相对分子质量37×10

5％-8％的cTnT分布于心肌细胞胞浆，为游离的胞浆蛋白，92％～95％结合于细肌丝中，为结合的结构蛋白；3％的cTnI分布于心肌细胞胞浆中，97％与心肌结构蛋白结合。当心肌细胞因缺血缺氧等因素遭破坏时，游离型cTnI和cTnT可首先迅速从细胞中释放入血，随后结合于心肌结构蛋白中的结合型cTnI和cTnT逐渐分解，缓慢释放入循环血中，从而解释了以心肌细胞受损为表现的疾病，如急性心肌梗死(AMI)，cTnI和cTnT在循环血中较早出现并能持续较长时间的原因。高水平的超敏cTnT能很好的多因素分析预测所有心脏病死亡率。cTnT能提高AMI血清学检测有效性。

cTnT检测可用于急性冠状动脉综合症坏死的辅助诊断，如急性心肌梗死。同时也是急性冠状动脉综合症病人的危险分层和慢性肾功能衰竭病人的心肌危险性的指标。另外，还可以选择对心肌肌钙蛋白T增高更有效的治疗和干预方法。

肌钙蛋白T(troponin，TnT)具有高度的心肌特异性和灵敏度，是心肌坏死的标志物，一般在心肌梗死、心肌炎、心包炎等患者血液中有所升高，并且其值越高，患者预后越差。

目前已知的肌钙蛋白T检测方法主要有RIA(radioimmunoassay放射免疫测定法)法、酶联免疫法(ELISA)、胶体金免疫层析法(GICA)和化学发光免疫分析法(CLIA)等。但是，这些方法都存在一定的缺陷，RIA法污染大，已逐渐退出临床检验领域；ELISA法自动化程度低且操作复杂繁琐，灵敏度低、线性范围窄等缺点；GICA具有操作简单，检测速度快等优点，但也存在灵敏度低、试剂不稳定、重复性较差、难以进行定量等缺点；CLIA法是在酶联免疫分析法基础上发展起来的一种免疫检测技术，具有灵敏度高、检测线性范围宽、操作简单，自动化程度高等优势。目前化学发光免疫分析技术因其有上述诸多优点得到了广泛的应用，但现有技术中的化学发光免疫分析试剂盒多为进口的封闭式全自动化学发光检测系统，需要昂贵的全自动化学发光检测仪，从而限制了推广使用。

因此，目前尚需一种污染小、灵敏度高、操作简单、自动化程度高、特异性好、成本低的肌钙蛋白T检测试剂盒和使用方法。

发明内容

本发明旨在开发一种灵敏度高、无污染、操作简单、特异性好并且成本低廉的一种测定超敏肌钙蛋白T含量的磁微粒化学发光检测试剂盒。

基于上述目的，本发明提供的测定超敏肌钙蛋白T含量的磁微粒化学发光检测试剂盒，包括：R1试剂、R2试剂、磁分离试剂、校准品液系列和化学发光底物液；其特征在于：

所述R1试剂为缓冲液，

所述磁分离试剂为肌钙蛋白T单克隆抗体包被的磁微粒溶解在磁分离试剂的稀释液中配制成的肌钙蛋白T单克隆抗体包被的磁微粒溶液，

R2试剂为碱性磷酸酶标记的肌钙蛋白T单克隆抗体溶解在R2试剂的稀释液中配制成的碱性磷酸酶标记的肌钙蛋白T单克隆抗体溶液，

化学发光底物液为碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液。

R1试剂可以为生理盐水，即0.9％(wt)氯化钠水溶液，也可以为接近R2试剂的缓冲液组成或者磁分离试剂的缓冲液组成。

磁分离试剂即肌钙蛋白T单克隆抗体包被的磁微粒溶解在磁分离试剂的稀释液中配制成0.8～1.2mg/mL的肌钙蛋白T单克隆抗体包被的磁微粒溶液；所述磁分离试剂的稀释液pH为7.5～8.5，包括：Tris，浓度为12.0～12.3g/L；叠氮钠，浓度为0.9～1.1g/L；氯化钠，浓度为5.7～5.9g/L；牛血清白蛋白，浓度为3～6g/L；MgCl

优选地，磁分离试剂即肌钙蛋白T单克隆抗体包被的磁微粒溶解在稀释液中配制成1.0mg/mL的肌钙蛋白T单克隆抗体包被的磁微粒溶液；磁分离试剂的缓冲液pH值为8.0，包括：Tris，浓度为12.04g/L；叠氮钠，浓度为1g/L；氯化钠，浓度为5.79g/L；牛血清白蛋白，浓度为5g/L；MgCl

所述肌钙蛋白T单克隆抗体包被的磁微粒的制备方法是：量取磁性微粒，用磁铁吸附，用0.1M Hepes pH7.5的缓冲液清洗2～3次，加入磁分离试剂的稀释液使磁珠终浓度为8～12mg/mL；再加入抗体，使抗体浓度为0.05～0.2mg/mL，37℃混匀14～22小时，加入5～15％BSA封闭，37℃混匀4～8小时，用磁铁吸附，弃上清，用25mM Tris-HCl pH7.2、0.15MNaCl、0.05％Tween20组成的清洗液清洗3次，用磁分离试剂的稀释液清洗一次并定容，使磁珠终浓度为8～12mg/mL，获得浓缩液。

优选地，所述肌钙蛋白T单克隆抗体包被的磁微粒制备方法如下，量取磁性微粒，用磁铁吸附，用0.1M Hepes pH7.5清洗2～3次效果更好，加入磁分离试剂的稀释液使磁珠终浓度为10mg/mL，加入抗体，使抗体浓度为0.1mg/mL，37℃混匀18小时，加入10％BSA封闭，37℃混匀6小时，用磁铁吸附，弃上清，用25mM Tris-HCl pH7.2、0.15M NaCl、0.05％Tween20清洗3次，用磁分离试剂的稀释液清洗一次并定容，使磁珠终浓度为10mg/mL；

所述R2试剂即碱性磷酸酶标记的肌钙蛋白T单克隆抗体溶解在R2试剂的稀释液中配制成0.2～0.5μg/mL的碱性磷酸酶标记的肌钙蛋白T单克隆抗体溶液；

所述R2试剂的稀释液的pH值为6.7～7.6，包括：Tris，浓度为12.0～12.3g/L；叠氮钠，浓度为0.9～1.1g/L；氯化钠，浓度为5.7～5.9g/L；牛血清白蛋白，浓度为8～12g/L；海藻糖浓度为30～50g/L；MgCl

优选地，所述R2试剂即碱性磷酸酶标记的肌钙蛋白T单克隆抗体溶解在R2试剂的稀释液中配制成0.3μg/mL的碱性磷酸酶标记的肌钙蛋白T单克隆抗体溶液；所述R2试剂的稀释液的pH值为6.8，包括：Tris，浓度为12.04g/L；叠氮钠，浓度为1g/L；氯化钠，浓度为5.79g/L；牛血清白蛋白，浓度为10g/L；海藻糖浓度为50g/L；MgCl

另一方案，所述化学发光底物液是摩尔浓度0.1～0.3M的碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液，pH值为8～10的摩尔浓度0.2M的Tris-HCl缓冲液，并含有0.2～0.4mg/mL的二氧杂环乙烷化合物(APCL)。

另一方案，所述化学发光底物液是摩尔浓度为0.2M，pH值为9.3的Tris-HCl缓冲液，并含有0.3mg/mL的二氧杂环乙烷化合物(APCL)。

另一方案，所述试剂盒还包括清洗液，所述清洗液为0.1～0.2M，pH值为8～9的Tris-HCl缓冲液中加入质量百分比为0.01～0.04％的吐温20和15～20％的氯化钠。

另一方案，所述清洗液为0.1M，pH值为8的Tris-HCl缓冲液中加入质量百分比为0.02％的吐温20和15％的氯化钠。

另一方案，所述校准品液系列为含有不同浓度肌钙蛋白T抗原的Tris-HCl缓冲液。

另一方案，所述校准品液系列的缓冲液包括牛血清白蛋白，浓度为20.0g/L；氯化钠，浓度为8.5g/L，酪蛋白钠，浓度为2g/L，叠氮化钠，浓度为1g/L。肌钙蛋白T的校准品的缓冲液能够保证肌钙蛋白稳定存在，提高试剂盒的使用寿命。

另一方案，所述校准品液系列，浓度范围为0～6000pg/mL，缓冲液pH值为7.4。

另一方案，所述校准品液系列的不同浓度为0pg/mL、30pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、2000pg/mL、6000pg/mL。

一种测定超敏肌钙蛋白T含量的磁微粒化学发光检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

配制R1试剂：确定缓冲液组成，这里以配制生理盐水构成的缓冲液，0.9％氯化钠，其余为去离子水。

配制R2试剂：1)按照R2试剂的稀释液组分含量配制稀释液，调节pH；2)制备碱性磷酸酶标记的肌钙蛋白T抗体；3)将碱性磷酸酶标记的肌钙蛋白T抗体用R2试剂的稀释液进行稀释。

配制磁微粒：1)制备肌钙蛋白T单克隆抗体包被的磁微粒，即浓缩液；2)将磁微粒用磁分离试剂的稀释液进行稀释。

配制校准品：1)按照校准品液系列的缓冲液组分含量配制缓冲液；2)将肌钙蛋白T抗原溶解于校准品缓冲液中配制成不同的浓度。

配制化学发光底物液：1)配制0.2M，pH值为9.3的Tris-HCl缓冲液，并添加0.3mg/mL的二氧杂环乙烷；2)将碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物溶解于化学发光底物的缓冲液中。

一种测定超敏肌钙蛋白T的磁微粒化学发光检测试剂盒使用方法包括如下步骤：

(1)将待测样本或校准品、R1试剂、R2试剂、磁微粒37℃混合温育10min；

(2)洗涤，去除未结合的抗体和杂质后加入发光底物；

(3)加入发光底物，ALP催化底物发光后测定相对发光强度(RLU)；

在一定范围内RLU与肌钙蛋白T抗原浓度呈正比，通过内插法就可以从标准曲线上读取待测样本的肌钙蛋白T含量。

采用本发明上述检测试剂盒测定超敏肌钙蛋白T含量时的方法学鉴定数据可达到如下指标：

最低检测限－最小检出量为3pg/mL，实施例中可以达到最小检出量0.045pg/mL；

超敏肌钙蛋白T线性检测范围，3～6000pg/mL；

精密度－分析内精密度平均为2.32％(n＝10)，分析间精密度平均为4.51％(n＝10)，精密度远低于国家要求，说明本发明试剂盒在实验过程中具有很好的可重复性；

准确度－将已知肌钙蛋白T浓度的血清采用校准品缓冲液经不同比例稀释后回收率为85％～115％；

特异性－与心肌肌钙蛋白I、肌钙蛋白C、骨骼肌肌钙蛋白T的交叉率均小于0.1％。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明采用的夹心法的反应模式，利用化学发光检测技术与磁微粒免疫分离技术相结合的原理，定量检测人血清样品中的肌钙蛋白T含量，确保了检测的灵敏度，无污染、特异性强、操作简单、可快速高通量检测大批量样本，便于临床试剂应用。本发明不使用荧光素偶联抗体工艺，而采用通过选择抗体偶联磁珠工艺中特定组成的缓冲液，减少了在进行肌钙蛋白T检测时不必要的干扰，结合磁微粒制备方法能显著提高检测灵敏度，达到超敏的水平，通过特定组成的R2试剂的稀释液能提高肌钙蛋白T的特异性及稳定性。

本发明为临床检测人血清中的肌钙蛋白T提供了一种更准确、精确、方便、快捷和简单的方法。

附图说明

图1为本发明实施例2试剂盒中肌钙蛋白T的浓度－发光值曲线图；

图2为本发明实施例2试剂盒与进口试剂盒样本比对结果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图进一步解释本发明，但并不以此作为对本申请保护范围的限定。

本发明测定超敏肌钙蛋白T含量的磁微粒化学发光检测试剂盒的组成，包括R1试剂、R2试剂、磁分离试剂、校准品液系列和化学发光底物液。

R1试剂为0.9％氯化钠，其余为去离子水。

R2试剂包括：1)R2抗体：碱性磷酸酶标记的肌钙蛋白T抗体，浓度为0.2～0.5μg/mL；2)稀释液：R2试剂的稀释液的pH值为6.8，包括：Tris，浓度为12.04g/L；叠氮钠，浓度为1g/L；氯化钠，浓度为5.79g/L；牛血清白蛋白，浓度为10g/L；海藻糖浓度为50g/L；MgCl

磁分离试剂包括：1)磁微粒：肌钙蛋白T单克隆抗体包被的磁微粒，浓度为1.0mg/mL；

2)所述磁分离试剂的稀释液的pH值为8.0，包括：Tris，浓度为12.04g/L；叠氮钠，浓度为1g/L；氯化钠，浓度为5.79g/L；牛血清白蛋白，浓度为5g/L；MgCl

校准品液系列包括：1)肌钙蛋白T抗原的Tris-HCl缓冲液；2)缓冲液：0.1M Tris-HCl，牛血清白蛋白，浓度为20.0g/L；氯化钠，浓度为8.5g/L；酪蛋白钠，浓度为2g/L；叠氮化钠，浓度为1g/L。校准品液系列的缓冲液pH值为7.4。校准品液系列为含有不同浓度(0pg/mL、30pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、2000pg/mL、6000pg/mL)的试剂系列。

底物液为摩尔浓度0.1～0.3M碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液，其中，发光底物液中二氧杂环乙烷化合物(APCL)的浓度为0.2～0.4mg/mL，缓冲液为摩尔浓度为0.2M的Tris-HCl，pH值为8～10。

本发明测定超敏肌钙蛋白T含量的磁微粒化学发光检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

配制R1试剂：0.9％氯化钠，其余为去离子水。

配制R2试剂：1)按照R2试剂的稀释液组分含量配制稀释液；2)制备碱性磷酸酶标记的肌钙蛋白T抗体；3)将碱性磷酸酶标记的肌钙蛋白T抗体用R2试剂的稀释液进行稀释。

配制磁分离试剂：1)制备肌钙蛋白T单克隆抗体包被的磁微粒，量取磁性微粒，用磁铁吸附，用0.1M Hepes PH7.5清洗2～3次，加入磁分离试剂的稀释液使磁珠终浓度为10mg/ml，加入抗体，使抗体浓度为0.1mg/ml，37度混匀18小时，加入10％BSA封闭，37度混匀6小时，用磁铁吸附，弃上清，用25mM Tris-HCl PH7.2，0.15M NaCl 0.05％Tween20清洗3次，用磁分离试剂的稀释液清洗一次并定容，使磁珠终浓度为10mg/ml，获得浓缩液；2)将浓缩液用磁分离试剂的稀释液进行稀释。

配制校准品液系列：1)按照校准品缓冲液组分含量配制缓冲液；2)将不同浓度的肌钙蛋白T抗原分别溶解于校准品缓冲液中配制成不同浓度的校准品液。

配制化学发光底物液：1)配制Tris-HCl缓冲液，并添加二氧杂环乙烷化合物(APCL)；2)将碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物溶解于缓冲液中。

超敏肌钙蛋白T含量的磁微粒化学发光检测试剂盒的测定方法和绘制标准曲线

(1)首先，将50μl的校准品系列(浓度分别为0，30，100，500，2000，6000pg/mL)分别与50μlR1试剂、50μlR2试剂依次加入反应管中，磁分离试剂50μl 37℃条件下混合温育10min；

(2)用清洗液洗涤3次以去除未结合的抗体和杂质；

(3)加入发光底物液150μl，ALP催化底物发光后采用利德曼化学发光检测仪测定相对发光强度(RLU)，获得肌钙蛋白T浓度-发光值系列数值。

(4)根据肌钙蛋白T浓度-发光值系列数值进行拟合，获得肌钙蛋白T浓度-发光值标准曲线。

(5)根据拟合的肌钙蛋白T浓度-发光值标准曲线计算测定待测样本的浓度值。

在一定范围内RLU与肌钙蛋白T抗原浓度呈正比，通过内插法就可以从标准曲线上读取待测样本的肌钙蛋白T含量。

采用本发明上述检测试剂盒测定超敏肌钙蛋白T含量时的方法学鉴定数据可达到如下指标：

最低检测限为3pg/mL；

肌钙蛋白T含量的线性检测范围为3～6000pg/mL；

精密度，分析内精密度平均为2.32％(n＝10)，分析间精密度平均为4.51％(n＝10)，精密度远低于国家要求，说明本发明试剂盒在实验过程中具有很好的可重复性；

准确度，将已知肌钙蛋白T浓度的血清采用去激素血清经不同比例稀释后回收率为85％～115％；

特异性，与心肌肌钙蛋白I、肌钙蛋白C、骨骼肌肌钙蛋白T的交叉率均小于0.1％。

实施例1一种测定超敏肌钙蛋白T含量的磁微粒化学发光检测试剂盒包括R2试剂、磁分离试剂、校准品液系列和底物液。

本实施例中，R1试剂：0.9％氯化钠，其余为去离子水。

R2试剂包括：1)R2抗体：碱性磷酸酶标记的肌钙蛋白T抗体，浓度为0.3μg/ml；2)稀释液：R2试剂的稀释液为pH值为6.8，包括：Tris，浓度为12.04g/L；叠氮钠，浓度为1g/L；氯化钠，浓度为5.79g/L；牛血清白蛋白，浓度为10g/L；海藻糖浓度为50g/L；MgCl

本实施例中，磁分离试剂包括：1)磁微粒：肌钙蛋白T单克隆抗体包被的磁微粒，浓度为1mg/ml；2)磁分离试剂的稀释液pH值为8.0，包括：Tris，浓度为12.04g/L；叠氮钠，浓度为1g/L；氯化钠，浓度为5.79g/L；牛血清白蛋白，浓度为5g/L；MgCl

本实施例中，校准品液系列包括：1)肌钙蛋白T抗原的Tris-HCl缓冲液；2)缓冲液：包括0.1M Tris-HCl，牛血清白蛋白，浓度为20.0g/L；酪蛋白钠，浓度为2g/L；氯化钠，浓度为8.5g/L，叠氮化钠，浓度为1g/L。校准品液系列的缓冲液pH值为7.4。校准品系列为含有不同浓度(0，30，100，500，2000，6000pg/ml)实际系列。

本实施例中，底物液为碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液，其中，发光底物液中二氧杂环乙烷化合物(APCL)的浓度为0.3mg/mL，缓冲液为摩尔浓度为0.2M的Tris-HCl，pH值为9.3。

实施例2测定超敏肌钙蛋白T含量的磁微粒化学发光检测试剂盒的制备和测定方法

(1)首先，将实施例1的50μl的校准品系列(浓度分别为0，30，100，500，2000，6000pg/ml)分别与实施例1的50μlR1试剂、50μlR2试剂、50μl磁分离试剂依次加入反应管中，37℃条件下混合温育10min；

(2)用清洗液洗涤3次以去除未结合的抗体和杂质；

(3)加入实施例1的发光底物液150μl，ALP催化底物发光后采用利德曼自研化学发光检测仪测定相对发光强度(RLU)，结果如下表所示：

表1

(5)根据表1的数值进行拟合，获得图1所示的肌钙蛋白T浓度-发光值标准曲线。

(6)将50μl的待测样品与实施例1的50μlR1试剂、50μlR2试剂依次加入反应管中，37℃条件下混合温育10min；

(7)用清洗液洗涤3次以去除未结合的抗体和杂质；

(8)加入实施例1的发光底物液150μl，ALP催化底物发光后采用利德曼自研化学发光检测仪测定相对发光强度RLU为5125412；

(10)根据步骤(5)的肌钙蛋白T浓度-发光值标准曲线计算待测样品5125412对应的肌钙蛋白T浓度值为2304.41pg/mL。

本发明提供的超敏肌钙蛋白T含量的磁微粒化学发光检测试剂盒可以与全自动化学发光分析仪联用，操作步骤极大简化，加大了检测速度和检测通量，提高了检测效率，同时避免了人为操作导致的误差。

本发明的试剂盒最低检测限已达到超敏水平，结果如表2所示：

表2

本发明的试剂盒以及进口试剂盒进行临床样本测值比对：

用本发明提供的试剂盒与进口试剂盒分别对102份人血清样品同时进行检测。其检测结果见附图2，采用进口试剂盒测定的血清中的cTnT浓度为横坐标，以本发明提供的试剂盒测定结果为纵坐标作回归分析，相关方程为：y＝1.0249x-18.093，相关系数r为0.997。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

本发明未述及之处适用于现有技术。