髓系细胞触发受体2作为新型冠状病毒肺炎诊断或治疗靶点的应用

摘要

本发明属于生物技术领域，公开了髓系细胞触发受体2作为新型冠状病毒肺炎诊断或治疗靶点的应用，研究发现TREM‑2在新型冠状病毒肺炎病人外周血CD4+和CD8+T细胞中高表达，并且与疾病严重程度呈正相关。表明TREM‑2可以作为新型冠状病毒肺炎诊断和预后的标志物，本发明还发现TREM‑2‑Fc融合蛋白(作用效果是阻断TREM‑2信号)明显降低细胞因子IFN‑g、TNF、IL‑2和GranzymeB的水平，TREM‑2表达与《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》提出的老龄、淋巴细胞计数减少、C反应蛋白和D‑二聚体升高的重症指标有显著相关性。提示干预TREM‑2的表达可以缓解甚至有望治疗新型冠状病毒肺炎。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的，涉及髓系细胞触发受体2作为新型冠状病毒肺炎 诊断或治疗靶点的应用。

背景技术

新型冠状病毒肺炎是一种急性感染性肺炎，其病原体是一种先前未在人类中发现的新型 冠状病毒，即严重急性呼吸道综合征2型冠状病毒(SARS-CoV-2)。

根据现有病例资料，新型冠状病毒肺炎以发热、干咳、乏力等为主要表现，少数患者伴 有鼻塞、流涕、腹泻等上呼吸道和消化道症状。部分患者起病症状轻微，可无发热，多在1 周后恢复。多数患者预后良好，少数患者病情危重，甚至死亡。重症病例多在1周后出现呼 吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和 出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等。因此，早期诊断、及早干预以及开发新型治疗策略是 防控新型冠状病毒肺炎的关键手段。

目前临床确诊检测方法是实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性；或病毒基因测 序，与已知的新型冠状病毒高度同源。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》罗列 了重型、危重型临床预警指标，包括：1、外周血淋巴细胞进行性下降；2、外周血炎症因子如IL-6、C-反应蛋白进行性上升；3、乳酸进行性升高；4、肺内病变在短期内迅速进展。然而，以上指标没有特异性，且预测准确率不高，迫切需要新的诊断指标。目前临床新型冠状病毒肺炎没有特效药，一般采用广谱的抗病毒治疗，包括利巴韦林、干扰素、洛匹那韦、利托那韦、阿比多尔和磷酸氯喹。尽管以上药物对大部分病人有一定效果，但对重症病人的治疗依然效果差，疾病死亡率居高不下。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中缺乏新型冠状病毒肺炎的有效诊断和治疗 手段，提供用于检测髓系细胞触发受体2的表达水平的试剂在制备新型冠状病毒肺炎诊断或 治疗试剂中的应用。

本发明的首要目的是提供用于检测髓系细胞触发受体2的表达水平的试剂在制备新型冠 状病毒肺炎的诊断和/或预后试剂中的应用。

本发明的第二个目的提供一种用于减轻新型冠状病毒肺炎引起的炎症反应的药物。

本发明的第三个目的是提供特异性抑制髓系细胞触发受体2表达的物质在制备减轻新型 冠状病毒肺炎引起的炎症反应的药物的中的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

用于检测髓系细胞触发受体2的表达水平的试剂在制备新型冠状病毒肺炎的诊断和/或预 后试剂中的应用。

优选的，所述试剂为能够与髓系细胞触发受体2特异性结合的抗体。

髓系细胞触发受体(Triggering receptor expressed on myeloid cells，TREM)2是主要表达 于中性粒细胞和单核细胞表面的免疫球蛋白超家族成员，由胞外免疫球蛋白样区域、跨膜区 域和胞内区域组成。发明人研究发现，采用流式细胞术检测，TREM-2在新型冠状病毒肺炎 患者外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞的表达明显高于健康对照，且TREM-2在重症患者的表 达明显高于非重症患者。进一步采用流式细胞术检测TREM-2在新型冠状病毒肺炎患者发病 前期(pre-ICU)、危重症期(ICU)和恢复期(post-ICU)的趋势是先升高后降低，提示TREM-2 与重症病情发生密切相关，因此，TREM-2可以作为新型冠状病毒肺炎诊断和预后的标志物。

优选的，所述抗体可以偶联或者带有检测标记，更优选的，所述抗体为髓系细胞触发受 体2的单克隆抗体或者多克隆抗体。

优选的，所述髓系细胞触发受体2来自CD4+T细胞、CD8+T细胞。

CD4+和CD8+T细胞中的TREM-2的表达丰度在新型冠状病毒肺炎患者远高于健康人， 且与病情加重相关。因此，检测CD4+和CD8+T细胞中TREM-2的表达准确率好，灵敏度高。因此可以通过检测外周血中的TREM-2的含量，来诊断新型冠状病毒肺炎，并且预测患者病情进展是否转变为重症。

具体的，当作为诊断试剂时，诊断过程包括：利用与TREM-2特异性结合的抗体检测受 试者的血液样品(或者活检组织样品)中的TREM-2的表达水平，并将其与参考水平进行比 较，当TREM-2的表达水平显著上调，诊断结果为阳性；当TREM-2的表达水平没有显著变化，诊断结果为阴性，其中参考水平为健康人群外周血样品中所述TREM-2的表达水平。

具体的，当作为预后试剂时，预后过程包括：利用与TREM-2特异性结合的抗体检测受 试者不同病程时期的血液样品(或者活检组织样品)中的TREM-2的表达水平，并将其与参 考水平进行比较，绘制不同病程时期TREM-2的表达水平曲线，从而确定患者的预后情况。 其中参考水平为健康人群外周血样品中所述TREM-2的表达水平。

本发明还提供一种用于减轻新型冠状病毒肺炎引起的炎症反应的药物，所述药物包括特 异性抑制髓系细胞触发受体2表达的物质。

免疫共沉淀实验证实TREM-2与SARS-CoV-2病毒膜蛋白(M protein)结合，与核蛋白 (N protein)N蛋白、血管紧张素转化酶2(ACE2)不结合。采用SARS-CoV-2 M protein刺激条件下，TREM-2促进CD4+和CD8+T细胞分泌细胞因子包括干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏 死因子(TNF)、白介素-2(IL-2)和颗粒酶B(GranzymeB)。进一步采用TREM-2-Fc(TREM-2 胞外段连接免疫球蛋白恒定区)融合蛋白处理，减少了CD4+和CD8+T细胞分泌以上4个细 胞因子的水平。

从细胞水平上来看，阻断TREM-2受体信号抑制CD4+和CD8+T细胞分泌干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)、白介素-2(IL-2)和颗粒酶B(GranzymeB)；另外，《新 型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》提出，老龄、淋巴细胞(lymphocyte)计数减少、 C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)和D-二聚体(D-dimer)升高是新型冠状病毒肺炎重症 的指标，本发明还研究了TREM-2表达与年龄(Age)、CRP和D-dimer分别呈正相关，相 关系数(r)分别是0.385、0.5368、0.323，且统计学P值均小于0.01，即两指标比较具有显 著性差异。TREM-2表达与lymphocyte数量呈负相关，相关系数(r)为-0.4084，且P值小于 0.001，即具有显著性差异。

以上结果证实，TREM-2与新型冠状病毒肺炎的临床重症指标具有相关性，因此通过干 预体内靶向髓系细胞触发受体2的表达，能够减轻新型冠状病毒肺炎患者的炎症反应，从而 可用于治疗新型冠状病毒肺炎。

优选的，所述药物包括靶向髓系细胞触发受体2的融合蛋白、特异性抗体、siRNA、反 义RNA。

本发明还提供特异性抑制髓系细胞触发受体2表达的物质在制备减轻新型冠状病毒肺炎 引起的炎症反应的药物中的应用。

优选的，所述药物包括靶向髓系细胞触发受体2的融合蛋白、特异性抗体、siRNA、反 义RNA。

更优选地，所述药物为TREM-2-Fc融合蛋白。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过研究发现TREM-2在新型冠状病毒肺炎病人外周血CD4+和CD8+T细胞中高 表达，并且与疾病严重程度呈正相关。表明TREM-2可以作为新型冠状病毒肺炎诊断和预后 的标志物，该标志物可以来自于外周血，直接取血液样品进行检测相对于生化、凝血、血样 饱和度多指标检测等复杂程序，减轻了患者的痛苦，并且创伤小，敏感性高。

本发明还研究了采用TREM-2-Fc融合蛋白对病人CD4+和CD8+T细胞进行干预，发现TREM-2-Fc融合蛋白(作用效果是阻断TREM-2信号)明显细胞因子IFN-g、TNF、IL-2和GranzymeB的水平，提示干预TREM-2的表达可以减轻新型冠状病毒肺炎引起的炎症反应，从而有望治疗新型冠状病毒肺炎。

本发明提供的新型冠状病毒肺炎诊断和预后的分子标志物，具有简便、快捷、创伤小、 易复查等优点，应用前景广阔。

附图说明

图1为TREM-2在健康体检者和新型冠状病毒肺炎患者外周血CD4+和CD8+T细胞表面 的表达水平图；

图2为TREM-2在新型冠状病毒肺炎患者疾病发展时期包括前期(Pre-ICU)、重症期(ICU)和缓解期(Post-ICU)的表达水平图；

图3为TREM-2与SARS-CoV-2病毒M蛋白结合，不与其它病毒蛋白结合的图；

图4为SARS-CoV-2病毒M蛋白刺激条件下，TREM-2+CD4+和CD8+T细胞分泌IFN-g、TNF、IL-2和GranzymeB的表达水平图；

图5为采用TREM-2-Fc融合蛋白阻断TREM-2受体信号，CD4+和CD8+T细胞分泌IFN-g、 TNF、IL-2和GranzymeB的表达水平图；其中，ns表示与对照组相比，统计学差异P＞0.05；*表示与对照组相比，统计学差异P＜0.05；**表示与对照组相比，统计学差异P＜0.01；***表示与对照组相比，统计学差异P＜0.001；

图6为TREM-2表达与四个指标(老龄、C-反应蛋白、D-二聚体、淋巴细胞)的相关性分析。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的 说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实 施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等， 如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

试验中所有受试者均签署知情同意书，患者一般资料差异无统计学意义。

实施例1

选取新型冠状病毒肺炎患者重症(Severe)15例，非重症(Non-severe)20例，设为实 验组；选取健康体检者20例，设为对照组。

健康体检者：无临床症状的体检受试者。

新型冠状病毒肺炎患者：SARS-CoV-2病毒核酸检测阳性，且临床症状表现为肺炎的受 试患者。

分别采集实验组和对照组受试者的外周血5mL，裂解红细胞制备单细胞悬液，调整细胞 总量至5×10

图1为TREM-2在健康体检者、新型冠状病毒肺炎重症和非重症患者外周血CD4+和CD8+T细胞表面的表达水平图。设门分别为CD4+和CD8+细胞，可以看出，新型冠状病毒 肺炎患者的TREM-2阳性细胞的比例远高于健康体检者，并且重症患者的TREM-2阳性细胞 比例明显高于非重症患者，说明TREM-2在新型冠状病毒肺炎病人外周血CD4+和CD8+T细 胞中高表达，且与患病严重程度相关。

实施例2

选取新型冠状病毒肺炎危重症患者5例，分别检测疾病发展时期包括前期(Pre-ICU)、 重症期(ICU)和缓解期(Post-ICU)病人TREM-2的表达情况。

对上述重症期判断参考《新冠肺炎诊疗方案(试行第七版)》，在3个时期取患者外周血5 mL，进行如下检测。对上述样品分别裂解红细胞制备单细胞悬液，并调整细胞总量至5×10

图2为TREM-2在新型冠状病毒肺炎危重症患者前期(Pre-ICU)、重症期(ICU)和缓解期(Post-ICU)外周血CD4+和CD8+T细胞表面的表达水平。设门分别为CD4+和CD8+ 细胞；可以看出，TREM-2在患者疾病前期表达较低，发展为重症后表达升高，且具有统计 学差异；经治疗后进入缓解期，TREM-2表达下降，且具有统计学差异。

实施例3

结果如图3所示，共构建5种质粒，包括Vector空白质粒，带HA标签的TREM-2表达质粒(TREM-2-HA)，带FLAG标签的SARS-CoV-2膜蛋白表达质粒(M-FLAG)，带FLAG 标签的SARS-CoV-2核蛋白表达质粒(N-FLAG)，带FLAG标签的血管紧张素转化酶2(ACE2) 表达质粒(ACE2-FLAG)。

将上述5种质粒如图所示组合转入293T细胞，-表示该质粒不转入，+表示该质粒转入。 转入24小时后，收集细胞，裂解取蛋白，免疫共沉淀检测TREM-2与病毒蛋白的结合情况。 左边Input表示免疫印记检测细胞裂解蛋白中以上质粒转入后的表达，结果显示，以上质粒转 入293T细胞均能有效的表达蛋白，黑色条带从上往下分别是ACE2-FLAG、N-FLAG和M-FLAG以及TREM-2-HA表达。右边IP：FLAG表示，采用靶向FLAG标签的琼脂糖珠子 处理细胞裂解蛋白，通过免疫共沉淀方法把FLAG标签的蛋白(本实验指ACE2-FLAG、 N-FLAG和M-FLAG)及其结合蛋白拉下来，其余没有FLAG标签的蛋白或者不与以上蛋白 结合的蛋白被去除，最后免疫印记检测共沉淀的蛋白。结果显示，黑色条带从上往下分别是 ACE2-FLAG、N-FLAG和M-FLAG，TREM-2-HA仅在和M-FLAG共同转入的条件下才能检 测到条带，提示了TREM-2和M存在相互作用；而TREM-2-HA与N-FLAG或者ACE2-FLAG 共同转入均没有出现条带，提示TREM-2与N以及ACE2没有相互作用。

实施例4

选取新型冠状病毒肺炎患者10例，采用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)。采用包含SARS-CoV-2 M蛋白的VSV-G病毒载体刺激PBMC，采用流式细胞仪 分别检测并分析IFN-g、TNF、IL-2和GranzymeB在TREM-2阴性表达和阳性表达的CD4+ (即TREM-2

结果如图4所示，为IFN-g、TNF、IL-2和GranzymeB在CD4+和CD8+T细胞的表达水平。Mock为阴性对照，即不加任何刺激；VSV-G为病毒载体的空白对照刺激PBMC；VSV-GSARS-CoV-2 M为实验组，即含SARS-CoV-2 M的VSV-G病毒载体刺激PBMC。

从图4中可以看出，Mock组中IFN-g、TNF、IL-2和GranzymeB 4种细胞因子基本不表达，VSV-G空白病毒刺激后4个细胞因子表达没有明显升高，且TREM-2

实施例5

选取新型冠状病毒肺炎患者10例，采用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)。采用包含SARS-CoV-2 M蛋白的VSV-G病毒载体刺激PBMC，同时加入 TREM-2-Fc融合蛋白(效果是阻断TREM-2信号)或同型对照IgG，采用流式细胞仪分别检 测并分析IFN-g、TNF、IL-2和GranzymeB在CD4+和CD8+T细胞的表达水平。

结果如图5所示，图中Mock为不加任何刺激的阴性对照。Control为加SARS-CoV-2M 蛋白的VSV-G病毒刺激。IgG为加SARS-CoV-2 M蛋白的VSV-G病毒刺激同时加入IgG同 型对照。TREM-2-Fc为加SARS-CoV-2 M蛋白的VSV-G病毒刺激同时加入TREM-2-Fc融合 蛋白，即实验组。

从图5中可以看出，新型冠状病毒肺炎患者PBMC加入TREM-2-Fc融合蛋白，CD4+ 和CD8+T细胞分泌的IFN-g、TNF、IL-2和GranzymeB显著减少，且具有统计学意义。而同 型对照IgG加入不影响IFN-g、TNF、IL-2和GranzymeB表达水平(与Control组相比)。提 示阻断TREM-2受体信号抑制CD4+和CD8+T细胞分泌IFN-g、TNF、IL-2和GranzymeB。

实施例6

选取新型冠状病毒肺炎患者103例，采集患者外周血，采用实施例1的方法检测T细胞 表面TREM-2的表达，并分析TREM-2表达与临床指标的相关性。

《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》提出，老龄、淋巴细胞(lymphocyte)计数减少、C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)和D-二聚体(D-dimer)升高是新型冠状病毒肺炎重症的指标。在此，本文分析TREM-2表达与以上四个指标的相关性。

结果如图6所示，TREM-2表达与年龄(Age)、CRP和D-dimer分别呈正相关，相关系数(r)分别是0.385、0.5368、0.323，且统计学P值均小于0.01，即两指标比较具有显著性 差异。TREM-2表达与lymphocyte数量呈负相关，相关系数(r)为-0.4084，且P值小于0.001， 即具有显著性差异。以上结果证实，TREM-2与新型冠状病毒肺炎的临床重症指标具有相关性，提示TREM-2是新型冠状病毒肺炎的诊疗靶点。

本领域技术人员应该理解的是，本发明的使用不受限于上述特定应用。就本文描述或描 绘的特定元素和/或特征而言，本发明也不局限于其优选实施方案。应当理解的是，本发明不 限于所公开的实施方案例或各个实施方案，且在不脱离由以下权利要求所阐述和限定的本发 明的范围的情况下能够进行许多重新布置、修改和替换。