诱导细胞和/或组织片段片状剥脱以增强细胞病理性细胞收集的方法

摘要

使用超声造影剂和超声处理从受试者的器官获得富集的细胞样品的方法和技术。获得了连续的上皮片段，其可用于随后的组织学分析以及用于提供治疗和其他医学考虑的信息。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求享有2018年3月23日提交的美国临时申请号62/647,133和2018年10月30日提交的美国临时申请号62/752,823和2019年1月16日提交的美国临时申请号62/793,061的权益，每一篇申请的内容通过引用并入本文。

发明背景

成人中超过95％的癌症(cancer)是上皮恶性肿瘤(carcinomas)，这意味着它们起源于器官的上皮衬层。在许多情况下，这些上皮与周围体液直接接触，使上皮细胞不断地脱落到该周围体液中，作为上皮再生自然过程的一部分。实例是不断脱落到胰液中的胰腺导管细胞、不断脱落到痰中的肺细胞和不断脱落到尿液中的膀胱细胞。可以存在于受试者上皮中的发育异常细胞和癌细胞也与正常上皮细胞一起自然地脱落到周围流体中。在许多情况下，这些体液可通过无创或微创采样方法获得。然后，可以使用标准实验室技术浓缩在这些采样的流体中发现的片状剥脱的细胞，随后由细胞病理学家用于显微镜评价，从而在理论上实现发育异常和癌症的早期检测。虽然对片状剥脱到周围体液中的细胞进行细胞病理学检查通常具有高度特异性，但其对发育异常和癌症检测的敏感性通常受到以下事实的限制：上皮细胞自然片状剥脱到周围流体中的速度较慢，导致样品非常少，几乎没有细胞供病理学家检查。目前，这限制了以下部位中的发育异常和癌症的细胞病理学检测：纵隔、胸膜、心包膜、腹膜、肺、乳房、唾液腺、脑膜、胰腺导管、胰腺包囊、肾脏、肝脏、膀胱和卵巢等。

例如，胰腺由多种细胞类型组成，每种细胞都可能引起不同类型的癌症。胰腺导管腺癌(PDAC)是美国癌症相关死亡的第四大主要原因。这归因于其通常在转移阶段的较晚诊断、其侵略性生物学以及对已知化学疗法仅部分的应答。胰液的细胞学评价已显示具有高敏感性，在诊断胰腺癌中高于79％。

因为通常具有很少或没有早期症状，因此胰腺癌在发现时通常就已经是晚期的。出于这种原因，到2030年，胰腺癌预计将成为美国癌症死亡的第二大主要原因(1)。

对因其胰腺癌家族史、胰腺癌易感基因突变或偶然检测到胰腺囊肿而处于发展胰腺癌的升高的风险的患者进行胰腺筛查和监测。

当前的胰腺癌检查包括内窥镜超声检查(EUS)和内窥镜磁共振成像/磁共振胆管胰腺造影术(ERCP)。尽管这些检查对于检测胰腺囊肿是准确的(2,3,4)，但是它们不太适合用于检测小的实体胰腺癌，这可由尽管定期监测但仍发展为胰腺癌的患者人数证明。这反映错过了早期检测的机会(5)。

细胞病理学是诊断疾病的重要临床标准，已经过检验作为胰腺癌的诊断手段。例如，1974年，Yoshihiko Endo及其同事首次报道了用十二指肠镜收集胰液后对胰腺癌的细胞学诊断(6)。他们报道敏感性为79％。在随后的几十年中，许多研究人员尝试使用胰液的细胞学检查来确定胰腺恶性肿瘤，但敏感性范围仍然顽固地停留在70-80％左右(7,8)。多年来，多个内窥镜医师观察到的敏感性不足可能反映了典型的细胞收集和分析方法存在的缺陷。另外，获得用于进行生物测定中组织学分析的流体样品中的细胞或组织片段的水平低是多种生物测定类型存在的问题。

因此，需要增加从各种器官和组织类型片状剥脱的细胞的产率供收集和后续分析，以便增强这些诊断性检查的特异性。还需要诱导完整组织的片状剥脱，其可用于提供组织片段的前位视图。特别是关于胰腺癌，需要改善的细胞收集和组织片段收集技术，用于从胰腺的正常细胞背景中检测到稀少的细胞。

发明内容

本文阐述的本发明的实施方案提供了以比以前通过不同手段观察到的比率大得多的比率获得细胞和/或组织片段和其他分子的方法和系统。在一个实施方案中，方法包括施用超声造影剂，该超声造影剂在患者的循环系统中形成微泡，以及对受试者进行超声处理(insonating)。引入微泡后，使器官或组织(例如胰腺)经受广域超声能量。本发明的实施方案的超声应用可以被描述为低强度非聚焦超声(LINFU)。在本发明的实施方案中，超声能量与微泡施加的能量的组合导致胰腺细胞和任选的组织片段分解和/或片状剥脱。在获得胰腺样品的情况下，随后给患者注射促胰液素(一种诱导胰腺分泌的药物)。在这方面，一些片状剥脱和移动的细胞和组织片段可以沉积到胰液中，然后在内窥镜下对其进行收集。然后对获得的富集样品中的细胞和/或组织片段进行形态学分析和/或使用分子生物标志物进行分析，以检测是否存在细胞异常。

这些程序可以显著增加在胰液中表达的细胞总数。此外，本文阐述的程序可以诱导完整的组织片段从胰腺分离。

这些操作在应用于其他器官或身体部位(例如纵隔、胸膜、心包膜、腹膜、肺、乳房、唾液腺、脑膜、胰腺导管、胰腺包囊、肾脏、肝脏、膀胱或卵巢)时可以显著增加在这些器官的周围流体中压出的细胞总数。另外，本文阐述的操作可以额外诱导完整的组织片段从上述示例性器官分离。例如，本文阐述的操作用于诱导肺细胞片状剥脱到周围的痰中或诱导膀胱细胞和膀胱组织片状剥脱到周围的尿液中。

提供了一种从受试者的器官获得细胞样品的方法，所述方法包括：向受试者施用一定量的超声造影剂；以及用有效引起超声造影剂的稳定空化的量的超声能量对受试者的器官进行超声处理，从而引起细胞或上皮组织片段从受试者的器官片状剥脱。

还提供了一种从受试者获得胰腺细胞的方法，该方法包括：

向受试者施用一定量的超声造影剂；和

对受试者的胰腺进行超声处理至超声能量的量有效引起超声造影剂的稳定空化，

从而引起细胞片状剥脱到受试者的胰腺导管中。

还提供了一种从受试者获得胰腺细胞的方法，该方法包括：用有效引起细胞片状剥脱到受试者的胰腺导管中的量的单频超声能量对受试者的胰腺进行超声处理。

还提供了一种从受试者获得胰腺细胞的方法，该方法包括：用一定量的来自多频阵列的超声能量对受试者的胰腺进行超声处理，所述量的超声能量有效地在受试者胰腺的预定点处实现非对称超声波并引起细胞片状剥脱到受试者的胰腺导管中。

还提供了一种治疗受试者的胰腺疾病的方法，所述方法包括：

a)通过本文所述的方法确定受试者在其胰腺中是否具有发育异常的胰腺细胞或胰腺癌细胞，和

b)对在a)中发现其胰腺中具有发育异常的胰腺细胞或胰腺癌细胞的受试者施行化学疗法、放射疗法、免疫疗法或胰腺切除术。

在一些实施方案中，通过细胞形态学分析、组织形态学分析或生物分子标志物分析中的一项或多项来确定受试者在其胰腺中是否具有发育异常的胰腺细胞或胰腺癌细胞。

还提供了一种在对受试者的测定操作中提高从组织收集细胞样品的功效的方法，该方法包括在从组织收集细胞样品之前，用有效引起超声造影剂的稳定空化的量的超声能量对受试者的组织进行超声处理，从而引起受试者的细胞或组织片段片状剥脱，然后收集来自受试者组织的细胞样品。

还提供了一种对受试者的细胞或组织样品进行测定以确定该细胞或组织是否包含癌或癌前细胞或组织的方法，该方法包括：

a)接收细胞或组织样品，其中预先已通过以下方法获得了该样品：向受试者施用一定量的超声造影剂；和用有效引起超声造影剂的稳定空化的量的超声能量对受试者的器官进行超声处理，从而引起细胞或上皮组织片段从受试者的器官片状剥脱，以及收集片状剥脱的细胞或组织样品；

b)进行细胞形态学分析、组织形态学分析或生物分子标志物分析中的一项，以确定该细胞或组织是否包含癌或癌前细胞或组织。

还提供了一种用于早期检测胰腺中的发育异常细胞和癌细胞的方法，该方法包括施加指向胰腺的超声能量以诱导细胞片状剥脱，然后在内窥镜下收集含有片状剥脱的细胞和细胞簇的胰腺流体，用于分子检查和显微镜形态学检查。

还提供了一种分离的体液样品，其中所述样品直接获自已对其组织或器官进行超声处理的受试者，其中所述样品包含来自组织或器官的上皮细胞或其他细胞，其富集水平与获自未曾进行超声处理的受试者的其他方面相同的样品中的上皮细胞或其他细胞的水平相比多于2倍。

还提供了一种从受试者获得连续胰腺导管细胞样品的方法，该方法包括：

在用超声能量进行超声处理之前或之后的一小时内，向受试者施用有效引起胰腺分泌的量的促胰液素多肽；

在胰腺的预定点处用一定量的超声能量对受试者的胰腺进行超声处理，并引起细胞片状剥脱到受试者的胰腺导管中；然后

取出含有来自受试者的连续胰腺导管细胞的流体样品。

附图简要说明

图1：如下文的实施例1中所述，从对动物进行超声处理后收集的胰腺流体中获得的胰腺上皮组织的大片段。

发明详述

提供了一种从受试者的器官获得细胞样品的方法，所述方法包括：

向受试者施用一定量的超声造影剂；和

用有效引起超声造影剂的稳定空化的量的超声能量对受试者的器官进行超声处理，

从而引起细胞或上皮组织片段从受试者器官片状剥脱。

在一些实施方案中，细胞包括上皮细胞。

在一些实施方案中，使器官上皮的上皮组织片段片状剥脱。

在一些实施方案中，器官是膀胱、乳房、肝脏、肾脏、肺甲状腺、胃肠道或胰腺。从中收集细胞样品的器官可以称为目标器官。

在一些实施方案中，施加超声处理以便对除了目标器官之外的任何其他器官不进行超声处理。在一些实施方案中，施加超声处理以在除了目标器官之外的任何器官中都不引起稳定的空化。在一些实施方案中，施加超声造影剂以便选择性地在目标器官中累积。在一些实施方案中，在时间上(temporally)施加超声处理和/或超声造影剂，以便选择性地在除了目标器官之外的任何器官中都不引起稳定的空化。在一些实施方案中，在空间上施加超声处理和/或超声造影剂，以便选择性地在除了目标器官之外的任何器官中都不引起稳定的空化。在一些实施方案中，在时间和空间上施加超声处理和/或超声造影剂，以便选择性地在除了目标器官之外的任何器官中都不引起稳定的空化。在一些实施方案中，在时间上施加超声处理以便仅选择性地对目标器官进行超声处理。在一些实施方案中，在空间上施加超声处理以便仅选择性地对目标器官进行超声处理。在一些实施方案中，在时间和空间上施加超声处理，以便仅选择性地对目标器官进行超声处理。

在一些实施方案中，该方法进一步包括取出含有受试者的细胞的流体样品。

在一些实施方案中，流体样品获自器官的包囊。

在一些实施方案中，流体样品获自器官的分泌物。

还提供了一种从受试者获得胰腺细胞的方法，该方法包括：

向受试者施用一定量的超声造影剂；和

对受试者的胰腺进行超声处理至超声能量的量有效引起超声造影剂的稳定空化，

从而引起细胞片状剥脱到受试者的胰腺导管中。

在一些实施方案中，超声能量的机械指数不超过0.03，或机械指数不超过0.05。

还提供了一种从受试者获得胰腺细胞的方法，该方法包括：

用有效引起细胞片状剥脱到受试者的胰腺导管中的量的单频超声能量对受试者的胰腺进行超声处理。

在一些实施方案中，超声能量的机械指数为0.03至1.3。

还提供了一种从受试者获得胰腺细胞的方法，该方法包括：

用一定量的来自多频阵列的超声能量对受试者的胰腺进行超声处理，所述量的超声能量有效地在胰腺的预定点处实现非对称超声波，并引起细胞片状剥脱到受试者的胰腺导管中。

在一些实施方案中，超声能量的机械指数为0.03至1.3。

还提供了一种从受试者获得连续胰腺导管细胞样品的方法，该方法包括：

在用超声能量开始进行超声处理之前或之后一小时内，向受试者施用有效引起胰腺分泌的量的促胰液素多肽；在胰腺的预定点处用一定量的超声能量对受试者的胰腺进行超声处理，并引起细胞片状剥脱到受试者的胰腺导管中；然后取出含有受试者的连续胰腺导管细胞的流体样品。连续细胞是两个或更多个细胞，其中每个细胞都与至少另一个细胞连接。例如，上皮组织的片段或细胞片层。

在一些实施方案中，超声能量的机械指数为0.03至1.3。

在一些实施方案中，该方法进一步包括在用超声能量开始进行超声处理之前或之后一小时内，向受试者施用有效引起胰腺分泌的量的促胰液素多肽或引起胰腺分泌的其他物质。

在一些实施方案中，该方法包括与一定量的超声造影剂一起施用一定量的促胰液素或其他引起胰腺分泌的物质。

在一些实施方案中，施用促胰液素，并且促胰液素是人促胰液素。

在一些实施方案中，该方法还包括将导管或其他收集装置定位在受试者的胰腺导管的开口处。

在一些实施方案中，胰腺导管的开口是十二指肠乳头。

在一些实施方案中，该方法进一步包括使用导管或其他收集装置获得胰腺分泌物样品。

在一些实施方案中，该方法进一步包括分析所获得的胰腺分泌物样品，以确定该样品是否含有胰腺癌细胞或发育异常的胰腺细胞，或者是否是非病理性的。

在一些实施方案中，使用计算机辅助分析来鉴定细胞是癌性的还是发育异常的。在一些实施方案中，使用细胞形态学分析、组织形态学分析和/或分子生物学分析来鉴定细胞是癌性的还是发育异常的。

在一些实施方案中，该方法有效地引起胰腺的导管细胞和/或腺泡细胞的片状剥脱。

在一些实施方案中，该方法有效地引起胰腺的上皮组织片段的片状剥脱。

在一些实施方案中，超声能量的量在受试者的胰腺中引起稳定的空化。

在一些实施方案中，超声能量的量不引起受试者器官内的微泡的惯性空化或内爆。

在一些实施方案中，超声能量的量不引起受试者胰腺内的微泡的惯性空化或内爆。

在一些实施方案中，该方法还包括在对受试者进行至少一部分超声处理期间监测受试者的微泡内爆或超声造影剂。

在一些实施方案中，超声能量的量有效地在受试者的器官中产生多个微泡。

在一些实施方案中，超声能量在受试者的器官中是未聚焦的。

在一些实施方案中，超声能量在受试者的胰腺中是未聚焦的。

在一些实施方案中，超声能量是部分未聚焦的。

在一些实施方案中，超声能量在受试者的器官中是聚焦的。

在一些实施方案中，超声能量在受试者的胰腺中是聚焦的。

在一些实施方案中，超声造影剂包括微球。

在一些实施方案中，造影剂不直接施加至胰腺，而是静脉内施用。

在一些实施方案中，超声造影剂包含六氟化硫脂质A型微球。

在一些实施方案中，超声能量从接触受试者皮肤或邻近受试者皮肤的换能器发射，并且其中换能器的最近点在受试者的胰腺表面的2-4英寸之内。

在一些实施方案中，机械指数不超过0.03。

在一些实施方案中，机械指数不超过0.05。

在一些实施方案中，进行超声处理的超声能量的频率包括1.5MHz至3.0MHz。

在一些实施方案中，超声能量从接触受试者皮肤或邻近受试者皮肤的换能器发射，并且其中换能器的最近点在距受试者的胰腺表面大于4英寸且最高达9英寸的位置处。

在一些实施方案中，机械指数不超过0.03。

在一些实施方案中，机械指数不超过0.05。

在一些实施方案中，进行超声处理的超声能量的频率包括1.0MHz至1.5MHz。

在一些实施方案中，超声能量从换能器阵列发射，该换能器阵列为长度3到5英寸乘以宽度1到3英寸。

在一些实施方案中，超声能量从成像探头和超声成像系统发射。

在一些实施方案中，超声能量从容积探头和超声成像系统发射。

在一些实施方案中，超声能量从形状基本上为三角形的换能器阵列发射。

在一些实施方案中，超声能量从形状基本上为矩形的换能器阵列发射。

在一些实施方案中，超声能量从柔性换能器阵列发射。

在一些实施方案中，超声能量从换能器阵列发射，该换能器阵列包括用于在操作期间监视和定位空化的多个空化检测器。

在一些实施方案中，超声从换能器阵列发射，该换能器阵列通过带子连接至受试者。

在一些实施方案中，用所述量的超声能量对受试者进行超声处理，持续大于5分钟。

在一些实施方案中，用所述量的超声能量对受试者进行超声处理，持续少于15分钟。

在一些实施方案中，在用所述量的超声能量对受试者开始进行超声处理之前的1小时内，向该受试者施用所述量的超声造影剂。

在一些实施方案中，在用所述量的超声能量对受试者开始进行超声处理之前的30分钟内，向该受试者施用所述量的超声造影剂。

在一些实施方案中，在用所述量的超声能量对受试者开始进行超声处理之后的1小时内，向受试者施用所述量的促胰液素。

在一些实施方案中，在用所述量的超声能量对受试者开始进行超声处理之后的30分钟内，向受试者施用所述量的促胰液素。

在一些实施方案中，在用所述量的超声能量开始进行超声处理之前，向受试者施用所述量的促胰液素。

在一些实施方案中，在用所述量的超声能量开始进行超声处理之后，向受试者施用所述量的促胰液素。

在一些实施方案中，在终止用所述量的超声能量进行超声处理之后少于10分钟的时间内，向受试者施用所述量的促胰液素。

在一些实施方案中，在用所述量的超声能量进行超声处理期间向受试者施用所述量的促胰液素。

在一些实施方案中，向受试者同时施用所述量的促胰液素和超声造影剂。

在一些实施方案中，使用超声成像来辅助放置换能器，该换能器在器官上方或胰腺上方发射超声能量。

在一些实施方案中，使用超声成像来辅助将导管或其他收集装置放置在受试者的胰腺导管的开口处。

在一些实施方案中，使用超声成像来辅助将导管或其他流体收集装置放置在受试者的器官中或其附近。

在一些实施方案中，不向受试者施用超声造影剂。

在一些实施方案中，静脉内施用超声造影剂。

在一些实施方案中，仅静脉内施用超声造影剂。

在一些实施方案中，超声能量是多频和/或多相的。

在一些实施方案中，用超声能量动态地对受试者进行超声处理。

在一些实施方案中，从第一侧面上的多于一个位置处用所述量的超声能量进行超声处理。

在一些实施方案中，从垂直于第一侧面的第二侧面上的多于一个位置处用所述量的超声能量进行超声处理。

在一些实施方案中，使受试者的胰腺在胰腺的冠状面、矢状面或横断面上的至少两个不同位置处暴露于一定量的超声辐射。

在一些实施方案中，使受试者的器官在器官的冠状面、矢状面或横断面上的至少两个不同位置处暴露于一定量的超声辐射。

在一些实施方案中，受试者是仰卧的。

在一些实施方案中，受试者是人。

还提供了一种治疗受试者的胰腺疾病的方法，所述方法包括：

a)通过本文所述的方法确定受试者在其胰腺中是否具有发育异常的胰腺细胞或胰腺癌细胞，和

b)对在a)中发现其胰腺中具有发育异常的胰腺细胞或胰腺癌细胞的受试者施行化学疗法、放射疗法、免疫疗法或胰腺切除术。

在一些实施方案中，通过细胞形态学分析、组织形态学分析或生物分子标志物分析中的一项或多项来施行确定受试者在其胰腺中是否具有发育异常的胰腺细胞或胰腺癌细胞。

还提供了一种在对受试者的测定操作中提高从组织收集细胞样品的功效的方法，该方法包括在收集来自组织的细胞样品之前，用有效引起超声造影剂的稳定空化的量的超声能量对受试者的组织进行超声处理，从而引起受试者的细胞或组织片段片状剥脱，然后收集来自受试者组织的细胞样品。

在一些实施方案中，组织包括上皮细胞。

还提供了一种对受试者的细胞或组织样品进行测定以便确定该细胞或组织是否包含癌或癌前细胞或组织的方法，该方法包括：

a)接收细胞或组织样品，其中预先已通过以下方法获得了该样品：向受试者施用一定量的超声造影剂；和用有效引起超声造影剂的稳定空化的量的超声能量对受试者的器官进行超声处理，从而引起细胞或上皮组织片段从受试者的器官片状剥脱，以及收集片状剥脱的细胞或组织样品；

b)进行细胞形态学分析、组织形态学分析或生物分子标志物分析中的一项，以确定该细胞或组织是否包含癌或癌前细胞或组织。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括向受试者施用所述量的超声造影剂，并用有效引起超声造影剂的稳定空化的量的超声能量对受试者的器官进行超声处理，从而引起细胞或上皮组织片段从受试者的器官片状剥脱，以及收集片状剥脱的细胞或组织样品。

还提供了一种用于早期检测胰腺中的发育异常细胞和癌细胞的方法，该方法包括施加指向胰腺的超声能量以诱导细胞片状剥脱，然后在内窥镜下收集含有片状剥脱的细胞和细胞簇的胰腺流体，用于进行分子检查和显微镜形态学检查。

在一些实施方案中，在患者体外将指向胰腺以增加细胞片状剥脱到胰液中的超声能量施加于患者的身体。

在一些实施方案中，在内窥镜下施加指向胰腺以增加细胞片状剥脱到胰液中的超声能量。

在一些实施方案中，将施用超声能量以增加片状剥脱与施用促胰液素(一种增加胰腺流体产生的激素)组合。

在一些实施方案中，借助于基于神经网络的计算机辅助显微镜系统检查胰液。

还提供了一种分离的体液样品，其中所述样品直接获自已对其组织或器官进行超声处理的受试者，其中所述样品包含来自组织或器官的上皮细胞或其他细胞，其富集水平与获自未曾进行超声处理的受试者的其他方面相同的样品中的上皮细胞或其他细胞的水平相比多于2倍。

在一些实施方案中，还向受试者施用在对组织或器官进行超声处理期间存在的超声造影剂。

在一些实施方案中，在直接从受试者获得样品之前，已经对受试者的胰腺进行超声处理并且已经向受试者施用促胰液素。

在一些实施方案中，器官是膀胱、乳房、肝脏、肾脏、肺、甲状腺、胃肠道或包囊(cist)。为了增加目的细胞(例如体液样品中的异常细胞)的产量，本发明利用超声能量的施加，优选地，以对于诊断目的是安全的水平(例如，机械指数(“MI”)为1.9或更低)。在一些实施方案中，用MI为0.01的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为0.02的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为0.03的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为0.04的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为0.05的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为0.06的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为0.07的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为0.08的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为0.09的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为0.1的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为0.11的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为0.12的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为0.13的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为0.14的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为0.15的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为0.16的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为0.17的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为0.18的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为0.19的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为0.2的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为0.3的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为0.4的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为0.5的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为0.6的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为0.7的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为0.8的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为0.9的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为1.0的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为1.1的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为1.2的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为1.3的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为1.4的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为1.5的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为1.6的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为1.7的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为1.8的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为1.9的超声能量对受试者进行超声处理。在一些实施方案中，用MI为2.0的超声能量对受试者进行超声处理。

在收集细胞之前，使患者经受一段时间的超声能量。在一些实施方案中，用超声能量对受试者进行超声处理1分钟。在一些实施方案中，用超声能量对受试者进行超声处理2分钟。在一些实施方案中，用超声能量对受试者进行超声处理3分钟。在一些实施方案中，用超声能量对受试者进行超声处理4分钟。在一些实施方案中，用超声能量对受试者进行超声处理5分钟。在一些实施方案中，用超声能量对受试者进行超声处理6分钟。在一些实施方案中，用超声能量对受试者进行超声处理7分钟。在一些实施方案中，用超声能量对受试者进行超声处理8分钟。在一些实施方案中，用超声能量对受试者进行超声处理9分钟。在一些实施方案中，用超声能量对受试者进行超声处理10分钟。在一些实施方案中，用超声能量对受试者进行超声处理10-15分钟。在一些实施方案中，用超声能量对受试者进行超声处理15-20分钟。

在一些实施方案中，进行超声处理的超声能量的频率包括1.0MHz至1.5MHz。在一些实施方案中，进行超声处理的超声能量的频率包括1.0MHz至3.0MHz。在一些实施方案中，进行超声处理的超声能量的频率包括1.5MHz至3.0MHz。在一些实施方案中，进行超声处理的超声能量的频率包括1.5MHz至2.0MHz。在一些实施方案中，进行超声处理的超声能量的频率包括2.0MHz至3.5MHz。在一些实施方案中，进行超声处理的超声能量的频率包括2.5MHz至3.0MHz。在一些实施方案中，进行超声处理的超声能量的频率包括小于1.0MHz。

在一些实施方案中，进行超声处理的超声能量的波形包括振幅大于正峰的负峰。在一些实施方案中，进行超声处理的超声能量的波形包括振幅小于正峰的负峰。在一些实施方案中，进行超声处理的超声能量的波形包括振幅等于正峰的负峰。可以通过本领域中已知的方式来实现这种增强的超声，例如，参见2011年3月15日颁布的Dan Adam的美国专利号7,905,836，该专利通过引用并入本文。

在一些实施方案中，进行超声处理的超声能量不引起受试者的皮肤发热或者不引起受试者的组织发热。在一些实施方案中，在体外将进行超声处理的超声能量施加于受试者。在一些实施方案中，例如经由内窥镜超声换能器，从受试者内部施加进行超声处理的超声能量。

在本发明的实施方案中，在向受试者施用微泡超声造影剂之前或与之同时进行超声能量的超声处理。在一些实施方案中，造影剂是可商购的

在本发明的实施方案中，超声能量与在患者的循环系统中循环的微泡组合，提供足够的能量以诱导细胞以及任选的完整组织片段从器官、优选器官的上皮片状剥脱。

在关于胰腺的实施方案中，在上消化道内窥镜检查操作期间获得胰液。例如，在静脉内施用促胰液素后，将一次性抽吸导管通入到十二指肠中以收集胰液。或者，通过内窥镜的抽吸通道直接抽吸十二指肠流体来收集胰液。在获得胰液之后，其细胞内容物可以例如固定在一个或多个样品载玻片上。然后可以对样品载玻片进行处理和准备以用于诊断分析。

在关于胰腺的实施方案中，所施用的促胰液素是人的。在一些实施方案中，所施用的促胰液素是人的、牛的或猪的。一种可用的人促胰液素形式由ChiRhoClin,Inc.(Burtonsville,Md.)生产，其商品名为“CHIRHOSTIM”。在一个实施方案中，Hum(一种促胰液素)具有序列His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser-Arg-Leu-Arg-Asp-Ser-Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val；SEQ ID NO:1。一种可用的猪促胰液素形式由ChiRhoClin,Inc.(Burtonsville,Md.)生产，并由Repligen Corporation(Waltham,Mass.)以商品名“SECREFLO”进行销售。另一种可用的猪促胰液素形式由ChiRhoClin,Inc.(Burtonsville,Md.)生产，商品名为“SECREMAX”。一种可用的人促胰液素形式由ChiRhoClin,Inc.以商品名“SECRETIN-HUMAN”生产和销售。促胰液素可以与药学上可接受的载体组合在组合物中，并以这种组合物的形式施用。促胰液素可以通过本领域已知的任何方式施用。在一个实施方案中，静脉内施用促胰液素或含有促胰液素的组合物。

如本文中所用，“和/或”，例如选项A和/或选项B，涵盖了以下单独的实施方案：(i)选项A，(ii)选项B和(iii)选项A加选项B。

除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则本文描述的各种要素的所有组合均在本发明的范围内。

在介绍本发明或其优选实施方案的要素时，冠词“一个”、“一种”、“该”和“所述”旨在表示存在一个或多个要素。术语“包含”、“包括”和“具有”旨在是包括性的，并且表示除所列要素之外可以有其他要素。

在本文提供数值范围的情况下，应理解，该范围的所有数值子集，以及其中所包含的所有个体整数，以及至小数点后第二位，均作为本发明的一部分提供。因此，长度为1.5到2.0MHz的频率包括1.51到1.61MHz的频率子集、1.7到2.0MHz的频率子集以及1.65到1.85MHz的频率子集，等等，除非另有明确说明。

尽管已经结合以上概述的实施方案描述了本发明，但是显然，许多替代、修改和变化对于本领域技术人员而言将是显而易见的。因此，如上所述的本发明的示例性实施方案旨在是说明性的，而不是限制性的。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种改变。

实验实施例

实施例1

将事先禁食24小时的猪麻醉以使其舒适，并使其处于侧仰卧位。使用荧光检查法在猪胰腺的出口处将收集导管放置到十二指肠中。对猪静脉内施用超声造影剂(BraccoImaging的

随后对获得的样品进行的组织学分析表明，通过超声技术已诱导胰腺上皮组织的个体细胞以及大片段(见图1)片状剥脱到胰腺流体中。

实施例2

将事先禁食24小时的猪麻醉以使其舒适，并将其置于侧仰卧位。使用荧光检查法在猪胰腺的出口处将收集导管放置到十二指肠中。在用超声对动物进行超声处理之前，使用导管抽吸来清洁邻近胰腺出口的区域(在Vater壶腹/Oddi括约肌附近)。通过放置在动物胰腺正上方约3-4英寸处的动物皮肤上的换能器，用机械指数为1.3至1.4的单频超声(例如在2.0Mz下)对动物进行超声处理10分钟。当超声被正确放置时，通过观察胰腺中的不透明外观来实现超声换能器的正确放置。在超声处理结束时，向动物静脉内施用促胰液素(0.2至0.4mg/kg体重)。动物的胰腺随后产生胰腺流体，使用放置在Vater壶腹/Oddi括约肌附近的十二指肠中的导管收集该胰腺流体至50mL的体积(这约需5分钟)。观察到脉动流。

随后对获得的样品进行的组织学分析表明，通过超声技术已诱导胰腺上皮组织的个体细胞片状剥脱到胰腺流体中。然而，还观察到动物表现出明显的胰腺炎体征，这有时是胰腺流体收集的不良副作用。确定了优选较低的机械指数1.3至1.4来减少可能的胰腺炎。

实施例3

将事先禁食24小时的猪麻醉以使其舒适，并将其置于侧仰卧位。使用荧光检查法在猪胰腺的出口处将收集导管放置到十二指肠中。在用超声对动物进行超声处理之前，使用导管抽吸来清洁邻近胰腺出口的区域(在Vater壶腹/Oddi括约肌附近)。通过放置在动物胰腺正上方约3-4英寸处的动物皮肤上的换能器，用机械指数大于0.03但不超过1.3的多频(以及任选地多相、非对称波)超声(在1.5Mhz至3.0Mz的频率下)对动物进行超声处理10分钟。当超声被正确放置时，通过观察胰腺中的不透明外观来实现超声换能器的正确放置。在超声处理结束时，向动物静脉内施用促胰液素(0.2至0.4mg/kg体重)。使用放置在Vater壶腹/Oddi括约肌附近的十二指肠中的导管收集胰腺流体至50mL的体积并对样品进行组织学分析。

参考文献

(1)Rahib L,Smith BD,Aizenberg R,et al.Projecting cancer incidence anddeaths to 2030:the unexpected burden of thyroid,liver,and pancreas cancers inthe United States.Cancer Res 2014；74:2913–2921.

(2)Canto MI,Goggins M,Yeo CJ,et al.Screening for pancreatic neoplasiain high-risk individuals:an EUS-based approach.Clin Gastroenterol Hepatol2004；2:606–621.

(3)Canto MI,Goggins M,Hruban RH,et al.Screening for early pancreaticneoplasia in high-risk individuals:a prospective controlled study.ClinGastroenterol Hepatol 2006；4:766–781.

(4)Canto MI,Hruban RH,Fishman EK,et al.Frequent detection ofpancreatic lesions in asymptomatic high-risk individuals.Gastroenterol 2012；142:796–804；

(5)Yu J,Sadakari Y,Shindo K,et al.Digital next-generation sequencingidentifies low-abundance mutations in pancreatic juice samples collected fromthe duodenum of patients with pancreatic cancer and intraductal papillarymucinous neoplasms.Gut 2017；66:1677–1687.

(6)Endo Y,Morii T,Tamura H,et al.Cytodiagnosis of pancreaticmalignant tumors by aspiration,under direct vision,using a duodenalfiberscope.Gastroenterol 1974；67:944-51.

(7)Blackstone MO,Cockerham L,Kirsner JB et al.Intraductal aspirationfor cytodiagnosis in pancreatic malignancy.Gastrointest Endosc 1977；23:145-7.

(8)Nakaizumi A,Tatsuta M,Uehara H.et al.Cytologic examination of purepancreatic juice in the diagnosis of pancreatic carcinoma.The endoscopicretrograde intraductal catheter aspiration cytologic technique.Cancer 1992；70:2610-14.