一种槟榔直接体胚诱导及其悬浮培养获得再生植株的方法

摘要

本发明属生物技术领域，涉及一种槟榔直接体胚诱导及其悬浮培养获得再生植株的方法，是取槟榔佛焰苞未裂幼嫩花序作为外植体，接种到体胚诱导培养基中，在25～28℃下暗培养获得体细胞胚，然后经过悬浮增殖、分化培养获得体胚；将体胚接种到体胚萌芽培养基中培养得到再生植株。本发明工艺简单，操作方便，以槟榔幼嫩花序为外植体材料直接诱导获得早期胚，利用悬浮培养技术进行大量增殖，再将体胚培养成植株，周期较短，增殖效率较高，且悬浮胚系具有遗传背景一致，生理状态基本相同,具有较好的细胞全能性，对高效繁育槟榔健康优良种植材料和缩短品种选育周期具有现实意义，对槟榔产业的发展具有促进作用。

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种组织培养获得再生植株的方法，具体是一种以槟榔花序为外植体材料直接体胚诱导及其悬浮培养获得再生植株的方法。

背景技术

槟榔(Areca catechu L.)为棕榈科槟榔属单一生长点常绿乔木，原产于马来半岛的热带雨林中，现广泛分布于印度、巴基斯坦、斯里兰卡、马来西亚，在中国主要分布在海南，台湾、云南南部，此外，广东、广西、云南、福建等省(区)也有少量栽培。槟榔是重要的药用植物，为我国四大南药之首，其果实具有固齿杀菌、消积化食、消脚气及驱虫等功效。除了具有良好的药用价值，槟榔还逐渐成了人们继香烟、酒和含咖啡因饮料后的咀嚼嗜好品，受到广大消费者的喜爱。目前世界上爱吃槟榔的人大概有10到12亿人，其中中国有1亿人。槟榔由于其良好的药用价值和嗜好品用途，随着越来越多的人对槟榔认识加深，并喜爱和消费，市场需求不断扩大，产业前景广阔。

目前，具有高度杂合体的槟榔以种子繁育种苗为主，种植材料良莠不齐，单位面积产量较低，且由于气候环境、其他作物竞争和槟榔黄化病等因素，致使可用于种植槟榔的土地面积有限，虽然近几年槟榔全球收获面积和产量在递增，但远远不能满足市场需求，迫切需要规模化提供健康优质槟榔种苗以提高单位面积产量，促进种植业产业升级。

通过对高产健康槟榔单株组织培养，所获得的种苗种植材料既保存亲本优良性状且个体间遗传性状又均一，可有效提高槟榔单位面积产量，其技术体系具有良好的市场应用前景和很高的商业价值，也是生物技术育种的基础。高效的槟榔组织培养方法是本领域科技人员长期想探索的技术问题。

悬浮系具有遗传背景一致，生长条件容易控制，生理状态基本相同，发生各种反应更为迅速一致，具有较好的细胞全能性，是良好的分子生物学育种材料。

国内尚未见槟榔直接体胚诱导及其悬浮培养研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种槟榔直接体胚诱导及其悬浮培养获得再生植株的方法，以槟榔花序为外植体材料直接诱导获得体细胞胚，再通过悬浮培养诱导和增殖次生胚，再将次生胚培养成植株，保存了亲本优良遗传性状，可以高效地满足槟榔种植业升级中对健康优质种苗的迫切需求。

本发明所采用的技术方案：

一种槟榔直接体胚诱导及其悬浮培养获得再生植株的方法，其步骤如下：

1、外植体获取：选择高产健康槟榔单株，取佛焰苞未裂幼嫩花序作为外植体，冲洗干净，消毒，置于无菌滤纸上吸干表面水分。

2、直接体细胞胚诱导：取经过消毒的外植体横切切成1～3mm厚的小片，接种到体胚诱导培养基中，在25～28℃下暗培养获得体细胞胚。所述体胚诱导培养基的成分和配比如下：NH

3、悬浮增殖培养

取体细胞胚(浅米色球形胚团)接种到悬浮增殖培养液中，25～28℃、黑暗条件下摇床培养，每7d继代1次，每次继代时移除占总体积75％的上清液(每次继代时先静置沉降，再取上清液)，补充新鲜的悬浮增殖培养液至原体积量继续培养。培养过程中，每14d过滤一次悬浮增殖培养液，保留直径为0.2～0.3mm的胚粒继续培养增殖，获得生长状态均一、分散性好的悬浮系。所述悬浮增殖培养液的成分和配比如下：NH

4、体胚成熟培养

悬浮增殖培养过程中，每14d取直径大于0.3mm的胚粒转移到分化培养基中培养，在25～28℃、黑暗条件下，150rpm下悬浮培养，每7d更换培养基1次，55～65天获得1～2mm大小的体胚。所述分化培养基是以MS或WPM为基本培养基，并添加蔗糖3000mg/L、椰汁50～200ml/L、活性炭2000mg/L，pH5.8。

5、植株再生

将获得的体胚接种到体胚萌芽培养基中，在26～30℃，1800～2200lx光照下培养得到再生植株。所述体胚萌芽培养基是以MS或WPM为基本培养基，并添加谷氨酰胺500～1000mg/L、蔗糖30000～45000mg/L、椰汁50～200ml/L、活性炭2000mg/L、6-BA1～3mg/L、琼脂7g/L，pH6.0。

本发明工艺简单，操作方便，以槟榔幼嫩花序为外植体材料直接诱导获得早期胚，利用悬浮培养技术大量增殖早期胚，再将体胚培养成植株，其获得无性系植株周期较短，增殖效率较高，且悬浮胚系具有遗传背景一致,生长条件容易控制,生理状态基本相同,发生各种反应更为迅速一致，具有较好的细胞全能性，对高效繁育槟榔健康优良种植材料和应用于生物技术育种以缩短品种选育周期具有现实意义，对槟榔产业的发展具有促进作用。

附图说明

图1以槟榔佛焰苞未裂幼嫩花序作为外植体直接诱导出体细胞胚。

图2建立体细胞胚悬浮系进行增殖培养。

图3槟榔体胚分化成熟培养。

图4槟榔体胚经萌芽培养获再生植株。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。

一、直接体胚诱导及其悬浮培养获得再生植株

实施例一、

1、外植体获取：选择高产健康槟榔单株，取佛焰苞未裂幼嫩花序作为外植体，用饱和洗衣粉溶液清洗花序表面后冲洗干净，在超净工作台中用75％酒精将整个花序表面均匀擦拭数次后，用0.1％HgCl

2、直接体细胞胚诱导：取上述经消毒的外植体横切切成1-3mm厚的小片，接种到体细胞胚导培养基中，在25-28℃下暗培养获得体细胞胚(见图1)。

体细胞胚诱导培养基：NH

3、悬浮增殖培养

取上述浅米色球型体细胞胚，按8-12粒/ml密度接种到装有悬浮增殖培养液的组培容器中，置于往复式摇床上，在150rpm、25-28℃、黑暗条件下培养，每7d继代1次，每次继代时用吸管移除占总体积75％的上清液，再补充新鲜的悬浮增殖培养液至原体积量继续培养。培养过程中，每14d对悬浮增殖培养液进行过滤，保留直径为0.2～0.3mm的胚粒继续培养增殖(过滤时先用孔径为0.2mm无菌不锈钢筛网过滤，将直径大于0.2mm的胚粒转移到新鲜的悬浮增殖培养液中，再用0.3mm的无菌不锈钢筛网过滤，将直径大于0.3mm的胚粒过滤掉，从而保留直径为0.2-0.3mm的胚粒继续培养增殖)，获得生长状态均一、分散性好的悬浮系(见图2)。

悬浮增殖培养液：NH

4、体胚成熟培养

悬浮增殖培养过程中，每14d用孔径为0.3mm的无菌不锈钢筛网过滤1次，取直径大于0.3mm的胚转移到装有分化培养基的组培容器中，置于往复式摇床上，在150rpm、25-28℃、黑暗条件下悬浮培养，每7d更换培养基1次，60天左右获得1-2mm大小的体胚(图3)。

分化培养基：MS+蔗3000mg/L+椰汁200ml/L+活性炭2000mg/L，pH5.8。

5、植株再生

将获得的1-2mm大小的体胚接种到体胚萌芽培养基中，在26～30℃，2000lx光照下培养，60～90天得到再生植株(见图4)。

体胚萌芽培养基：MS+谷氨酰1000mg/L+蔗糖30000+椰汁50ml/L+活性炭2000mg/L+6-BA3mg/L+琼脂7g/L，pH6.0。

实施例二

1、外植体获取：选择高产健康槟榔单株，取佛焰苞未裂幼嫩花序作为外植体，用饱和洗衣粉溶液清洗花序表面后冲洗干净，在超净工作台中用75％酒精将整个花序表面均匀擦拭数次后，用0.1％HgCl

2、直接体细胞胚诱导：取上述经消毒的外植体横切切成1-3mm厚的小片，接种到体细胞胚导培养基中，在25-28℃下暗培养获得体细胞胚。

体细胞胚诱导培养基：NH

3、悬浮增殖培养

取上述浅米色球型体细胞胚，按8-12粒/ml密度接种到装有悬浮增殖培养液的组培容器中，置于往复式摇床上，在150rpm、25-28℃、黑暗条件下培养，每7d继代1次，每次继代时用吸管移除占总体积75％的上清液，再补充新鲜的悬浮增殖培养液至原体积量继续培养。培养过程中，每14d对悬浮增殖培养液进行过滤，保留直径为0.2～0.3mm的胚粒继续培养增殖(过滤时先用孔径为0.2mm无菌不锈钢筛网过滤，将直径大于0.2mm的胚粒转移到新鲜的悬浮增殖培养液中，再用0.3mm的无菌不锈钢筛网过滤，将直径大于0.3mm的胚粒过滤掉，从而保留直径为0.2-0.3mm的胚粒继续培养增殖)，获得生长状态均一、分散性好的悬浮系。

悬浮增殖培养液：NH

4、体胚成熟培养

悬浮增殖培养过程中，每14d用孔径为0.3mm的无菌不锈钢筛网过滤1次，取直径大于0.3mm的胚转移到装有分化培养基的组培容器中，置于往复式摇床上，在150rpm、25-28℃、黑暗条件下悬浮培养，每7d更换培养基1次，60天左右获得1-2mm大小的体胚。

分化培养基：WPM+蔗糖3000mg/L+椰汁100ml/L+活性炭2000mg/L，pH5.8。

5、植株再生

将获得的1-2mm大小的体胚接种到体胚萌芽培养基中，在26～30℃，2000lx光照下培养，60～90天得到再生植株。

体胚萌芽培养基：MS+谷氨酰胺500mg/L+蔗糖38000+椰汁100ml/L+活性炭2000mg/L+6-BA2mg/L+琼脂7g/L，pH6.0。

实施例三

1、外植体获取：选择高产健康槟榔单株，取佛焰苞未裂幼嫩花序作为外植体，用饱和洗衣粉溶液清洗花序表面后冲洗干净，在超净工作台中用75％酒精将整个花序表面均匀擦拭数次后，用0.1％HgCl

2、直接体细胞胚诱导：取上述经消毒的外植体横切切成1-3mm厚的小片，接种到体细胞胚导培养基中，在25-28℃下暗培养获得体细胞胚。

体细胞胚诱导培养基：NH

3、悬浮增殖培养

取上述浅米色球型体细胞胚，按8-12粒/ml密度接种到装有悬浮增殖培养液的组培容器中，置于往复式摇床上，在150rpm、25-28℃、黑暗条件下培养，每7d继代1次，每次继代时用吸管移除占总体积75％的上清液，再补充新鲜的悬浮增殖培养液至原体积量继续培养。培养过程中，每14d对悬浮增殖培养液进行过滤，保留直径为0.2～0.3mm的胚粒继续培养增殖(过滤时先用孔径为0.2mm无菌不锈钢筛网过滤，将直径大于0.2mm的胚粒转移到新鲜的悬浮增殖培养液中，再用0.3mm的无菌不锈钢筛网过滤，将直径大于0.3mm的胚粒过滤掉，从而保留直径为0.2-0.3mm的胚粒继续培养增殖)，获得生长状态均一、分散性好的悬浮系。

悬浮增殖培养液：NH

4、体胚成熟培养

悬浮增殖培养过程中，每14d用孔径为0.3mm的无菌不锈钢筛网过滤1次，取直径大于0.3mm的胚转移到装有分化培养基的组培容器中，置于往复式摇床上，在150rpm、25-28℃、黑暗条件下悬浮培养，每7d更换培养基1次，60天左右获得1-2mm大小的体胚(图3)。

分化培养基：WPM+蔗糖30000mg/L+椰汁50ml/L+活性炭2000mg/L，pH5.8。

5、植株再生

将获得的1-2mm大小的体胚接种到体胚萌芽培养基中，在26～30℃，2000lx光照下培养，60～90天得到再生植株(见图4)。

体胚萌芽培养基：WPM+谷氨酰胺700mg/L+蔗糖45000+椰汁150ml/L+活性炭2000mg/L+6-BA1.5mg/L+琼脂7g/L，pH6.0。

二、体细胞胚直接诱导及其悬浮培养效果鉴定

1.体细胞胚的诱导效果鉴定：

为鉴定体细胞胚的直接诱导效果，对上述实施例的直接体细胞胚诱导情况进行观察，统计直接诱导出体细胞胚的外植体数，计算体细胞胚诱导率，结果见表1。

表1槟榔外植体直接诱导出体细胞胚的情况

上述体细胞胚的直接诱导结果表明，本申请以槟榔幼嫩花序为外植体材料直接诱导获得体细胞胚，诱导率达到50％左右，为规模化高效繁育槟榔健康优良种苗奠定良好基础。

2.悬浮系增殖培养效果鉴定：

为鉴定悬浮系胚粒的增殖效果，对上述实施例的悬浮系胚粒增殖情况进行观察，统计悬浮系胚粒数，计算增殖倍数，结果见表2。

表2悬浮系胚粒增殖情况

上述胚粒的增殖结果表明，本申请通过建立悬浮系对胚粒进行增殖培养，增殖倍数达到2.0左右，具有较高的增殖效果，可以满足批量种苗繁殖。

3.体胚培养获得再生植株效果鉴定：

为鉴定槟榔种苗的繁殖效果，对上述实施例的体胚萌芽情况进行观察，统计萌芽数，计算繁殖率，结果见表3。

表3体胚萌芽情况

上述体胚的萌芽结果表明，本申请以槟榔幼嫩花序为外植体材料直接诱导获得体细胞胚，利用悬浮培养技术进行大量增殖，再体胚培养成植株，体胚萌芽率达到60％以上，具有较高的萌芽率，对缩短无性系植株培育周期、提高繁育槟榔健康优良种植材料效率和缩短品种选育周期具有现实意义，对槟榔产业的发展具有促进作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。