一种肿瘤细胞三维模型及其活力检测方法

摘要

一种肿瘤细胞三维模型及其活力检测方法，涉及建立细胞模型及其检测方法，本发明通过预处理的96孔板，每孔加入1%琼脂糖溶液冷却后备用。将HT29细胞以1.975×104、2.96×104、4.444×104、6.667×104、1×105个·mL‑1每孔100μL接种于预处理的96孔板，通过倒置的显微镜观察细胞球形态并计算细胞球体积，完成细胞的三维模型的制备。并通过利用酸性磷酸酶法（APH）和噻唑蓝法（MTT）测定细胞活力，比较两种方法的优劣。采用96孔平底培养板结合琼脂糖凝胶培养法建立人结肠癌HT29细胞三维培养模型，并结合APH法进行细胞活力检测，此方法简单、便捷、准确、经济，可用于进一步的药物活性筛选及机制研究。

说明书

技术领域

本发明涉及建立细胞三维模型及其检测方法，特别是涉及一种肿瘤细胞三维模型及其活力检测方法。

背景技术

近年来，细胞培养在生物学技术方面扮演着重要的角色，细胞实验己经广泛应用于生命科学研究。人体内组织为三维（ Three - dimensional，3D）结构，然而目前的细胞实验大多采用二维培养。二维培养的细胞呈单层分布，其增殖速度快于体内细胞，对于抗癌药物和抗病毒药物高度敏感。三维条件下培养的细胞呈三维立体分布，细胞张力低，以多种方式迁移，对于药物的敏感性低，这类似于细胞在体内的生物学功能和特征。

与二维细胞培养相比，三维细胞培养能在接近生理相关的环境下模拟体内细胞的形态特征、细胞行为、细胞增殖、细胞迁移等。

三维细胞培养具有灵活性、成本效益高以及高通量的特点。

三维培养模型可允许营养物质以及代谢产物在细胞内外进行交换，还能够监测和控制培养微环境中的理化条件，如温度、pH值、氧气浓度等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肿瘤细胞三维模型及其活力检测方法，本发明基于普通96孔板，采用琼脂糖凝胶三维培养方法及一种肿瘤细胞活力检测，确立了一种简便、快速、可靠的三维细胞活力检测方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种肿瘤细胞三维模型，所述肿瘤细胞三维模型包括用琼脂糖凝胶培养法培养HT29细胞培养三维细胞球，显微镜下考察细胞球形态；通过测量细胞球提及，绘制细胞接种数对细胞球体积曲线；使用酸性酶APH、MTT法、测定相应的吸光度值，绘制细胞接种数与吸光度值曲线；通过吉非替尼和紫杉醇处理三维细胞球；

建立细胞三维模型具体步骤：

1．用于肿瘤细胞三维培养的琼脂糖凝胶的配置

1） 精密称量琼脂糖，放入锥形瓶中，加入蒸馏水，制成 1 % 的琼脂糖悬浮液；

2）加塞密封，放入高压灭菌锅内高温灭菌；

3） 灭菌完成后，即成琼脂糖溶液，冷却后成为凝胶保存在4 ℃冰箱备用；

4） 将琼脂糖凝胶加热至95 ℃左右，使其充分融化，琼脂糖溶液设置三个铺设量:35、45、55μL每孔，趁热将琼脂糖溶液加入到96孔板中，放入37 ℃，5 % CO2培养箱备用；

2.琼脂糖凝胶三维细胞培养

1）将培养皿中培养到细胞对数生长期的细胞用胰蛋白酶消化液消化下来，制成不同浓度的细胞悬液；

2）以1.975×104、 2.96×104、 4.444×104、 6.667×104、 1×105 个·mL- 1每孔 100 μL 接种于预处理的 96 孔板，每孔 100 μL 细胞悬液量接种于制备的琼脂糖培养板底部凹面，1000 r·min- 1 离心 1 min 后放入培养箱，进行后续相关检测；

3）细胞球体积

细胞培养结束后，在倒置显微镜下拍摄细胞球照片，使用Image J测量细胞球的长径（Ra）与短径（Rb），计算细胞球体积，并绘制细胞球体积——细胞接种数量曲线；细胞球体积计算公式：V=3.14xRa×Rb2/6。

所述的一种肿瘤细胞三维模型，所述培养板为96孔普通培养板；三维培养中，每孔琼脂糖溶液量为30-60 μL；培养板中琼脂糖浓度为1 %；细胞集中数为2000-6000个·孔-1。

一种肿瘤细胞活力检测方法，所述方法为APH法检测细胞活力，步骤如下：

1）细胞培养结束后，离心弃上清液，每孔加入 100 μL的APH反应液（0.1 mol/L醋酸钠、0.1 % Triton X-100、2 mg/mL 4-硝基苯基磷酸二钠），37 ℃反应 3 h；

2）反应结束后每孔加入 20 μL的反应终止液（1 mol/L NaOH），震荡混匀，于酶标仪在 405 nm 处测定吸光度值A405；

所述的一种肿瘤细胞活力检测方法，所述APH 法是基于胞质酸性磷酸酶活性的定量方法，活细胞内的酸性磷酸酶将 4-硝基苯基磷酸水解成 4-硝基苯酚；在 APH 反应液中加入表面活性剂 TritonX 100，将细胞膜溶解，进而充分释放细胞胞质内的酸性磷酸酶。

本发明的优点与效果是：

1.本发明用于肿瘤细胞三维培养的琼脂糖凝胶的是利用琼脂糖其水溶性加热后融化，冷却至37℃凝胶化现象，将其热溶液加入普通平底培养板底部，冷却后制备成低吸附的凹底培养板。酸性磷酸酶法（APH）进行体外细胞活力检测的方法，为一种简便、快速、可靠的三维细胞活力检测方法。

2.琼脂糖是一种安全、低廉、可降解的高分子材料，用其预处理培养板底部，建立肿瘤细胞的三维培养模型，此方法简单、便捷、准确、经济，可广泛用于药物活性筛选及机制研究。

附图说明

图1是在45μL琼脂糖下细胞球形态学观察结果；

图2是细胞球直径分布在300-700 μm是细胞球体积与细胞接种数量的线性关系；

图3是用APH法检测细胞活力于酶标仪在405 nm 处测定吸光度值A

图4是用MTT法检测细胞活力于酶标仪在490 nm 处测定吸光度值A

具体实施方式

下面结合附图所示实施例依步骤对本发明进行详细说明。

1、琼脂糖凝胶的配置，具体包括以下步骤：

1）精密称量琼脂糖，放入锥形瓶中，加入一定量的蒸馏水，制成 1 % 的琼脂糖悬浮液。

2）加塞密封，放入高压灭菌锅内高温灭菌。

3）灭菌完成后，即成琼脂糖溶液，冷却后成为凝胶保存在4 ℃冰箱备用。

4）将琼脂糖凝胶加热至95 ℃左右，使其充分融化，琼脂糖溶液设置三个铺设量:35、45、55μL每孔，趁热将琼脂糖溶液加入到96孔板中，放入37 ℃，5 % CO2培养箱备用。

本发明采用了96孔平底培养板并结合了琼脂糖凝胶法，形成的细胞球形态较为规则完整。其中，琼脂糖作为一种来源丰富、价格低廉、具有可降解性的高分子材料，使得该方法具有操作简便、材料易得、价格低廉、具有可降解性、适用于较高通量药物筛选等优点。

2、琼脂糖凝胶三维细胞培养，具体包括以下步骤：

1）将培养皿中培养到细胞对数生长期的细胞用胰蛋白酶消化液消化下来，制成不同浓度的细胞悬液。

2）以1.975×104、 2.96×104、 4.444×104、 6.667×104、 1×105 个·mL- 1每孔 100 μL 接种于预处理的 96 孔板，每孔 100 μL 细胞悬液量接种于制备的琼脂糖培养板底部凹面，1000 r·min- 1 离心 1 min 后放入培养箱，进行后续相关检测。

3、细胞球体积

细胞培养结束后，在倒置显微镜下拍摄细胞球照片，使用Image J测量细胞球的长径（Ra）与短径（Rb），计算细胞球体积，并绘制细胞球体积——细胞接种数量曲线。细胞球体积计算公式：V=3.14xRa×Rb2/6。

三维培养结果表明，通过琼脂糖凝胶培养法建立HT29细胞三维培养，琼脂糖铺设量在35μL、45μL、55μL时都可以得到较为规则的细胞球，以45μL琼脂糖下细胞球形态学观察结果为例（图1）。在该实验条件下 HT29 细胞可以形成较为规则的细胞球：第0天，细胞生长较为松散，呈圆饼状；第1天，细胞生长较为紧密，呈球形；随着培养时间的延长，细胞球体积不断增大，形成致密的细胞球。该细胞球直径分布在300-700 μm，以细胞球体积对原始细胞接种数量作图可见，细胞球体积随着细胞接种数量的增大而增大，每孔中接种量在 1.975×103 ～ 6.667×103 个与细胞球体积呈现良好的线性关系（图2）。

通过对细胞球体积的测量可以发现，每孔中接种量在 1.975×103 ～ 6.667×103 个与细胞球体积呈现良好的线性关系，而接种数量过高时，线性关系则变得不明显。其中原因是因为细胞球达到一定的体积时对营养物质的吸收利用率会降低，球体中心区缺乏氧气、营养、代谢产物堆积和低 pH 值会导致细胞球内部的细胞发生坏死和凋亡。

检测方法：

APH 法是基于胞质酸性磷酸酶活性的定量研究方法，活细胞内的酸性磷酸酶可将4-硝基苯基磷酸水解成 4-硝基苯酚。4-硝基苯酚是一种黄色物质，在 405nm 处有紫外吸收。在 APH 反应液中加入表面活性剂 TritonX 100，具有较强的裂解能力，可以将细胞膜溶解，进而充分释放细胞胞质内的酸性磷酸酶，在细胞球活力检测中应用较多。

1、APH法检测细胞活力，具体包括以下步骤：

1）细胞培养结束后，离心弃上清液，每孔加入 100 μL的APH反应液（0.1 mol/L醋酸钠、0.1 % Triton X-100、2 mg/mL 4-硝基苯基磷酸二钠），37 ℃反应 3 h。

2）反应结束后每孔加入 20 μL的反应终止液（1 mol/L NaOH），震荡混匀，于酶标仪在 405 nm 处测定吸光度值A405，并对细胞接种数量作图3。

2、 MTT法检测细胞活力，具体包括以下步骤：

1）培养结束后，离心弃上清液，未消化组每孔直接加入 200 μL的0.5 mg/mL MTT反应液，37 ℃下反应3 h。消化组每孔加入 100 μL的胰酶消化液，37 ℃下反应 5 min，每孔加入200 μL 的细胞培养液终止消化并吹散细胞球，离心吸弃上清后每孔加入 200 μL的 0.5 mg/ L MTT 反应液，37 ℃条件下反应 3 h。

2）待反应结束后，离心吸弃上清，每孔加入 200 μL 的二甲基亚砜（DMSO），震荡 2min 后，每孔吸取 150 μL至 96 孔板中，于酶标仪在 490 nm 处测定吸光度值A490，并对细胞接种数量作图4。

检测方法比较分析：APH 检测结果显示，随着细胞接种数量的增加，A405 值逐渐增加，呈现出较好的线性关系。MTT 法检测结果，由图发现与未经消化组相比，细胞球经消化后随着细胞接种数量的增加 A490 值逐渐增加，除第一组外结果均大于未经消化组，呈现较好的线性关系，且平台出现的较晚。本发明APH法虽未经消化处理，但所得结果的线性关系却比较理想。 MTT法消化处理与未经消化处理测得的结果存在较大差异，三维培养的细胞球中，由于细胞呈立体方式生长，较二维培养相比细胞间的连接更为紧密，所以两种脱氢酶底物并不能完全渗入细胞球内部，从而导致未经消化的细胞球的吸光度值随细胞数量的增加变化幅度较小。经过胰蛋白酶消化后，细胞球内的细胞分散开来，能与 MTT 充分反应，其吸光度值——细胞接种曲线与 APH 趋于一致。然而在初始两个浓度组的测试结果中，消化后 MTT 的吸光度值是小于未经消化组的。其中的原因是因为对细胞球进行长时间的胰蛋白酶消化后，对细胞造成了一定的损伤，使细胞活力降低，进而造成测定结果较未消化组偏低。

因此，在本发明对三维细胞球进行活力测定时，APH 法是一种操作简单且结果较为理想的细胞活力检测方法。

综上所述，本发明采用96孔培养板并结合琼脂糖凝胶培养法，成功的构建了HT29细胞的三维培养模型，且APH法更适用于细胞的活力检测。