高效表达的EGFR和PD-L1双特异性结合蛋白

摘要

本文公开了同时结合EGFR和PD‑L1的双特异性Fabs‑In‑Tandem免疫球蛋白(FIT‑Ig)结合蛋白。这样的双特异性EGFR/PD‑L1 FIT‑Ig结合蛋白被有效表达并且可用于阻断EGFR信号传导、阻断PD‑L1信号传导以及治疗癌症。

说明书

技术领域

本发明涉及识别表皮生长因子受体(EGFR)和程序性死亡配体1(PD-L1)的新的工程化双特异性结合蛋白。该双特异性结合蛋白可用于治疗癌症。

背景技术

程序性死亡配体1(PD-L1)是大小约为40千道尔顿(kD)的I型跨膜糖蛋白。在人类，PD-L1在多种免疫细胞类型上表达，包括活化的和无活性的/衰竭的T细胞、幼稚的和活化的B细胞、髓样树突状细胞(DC)、单核细胞、肥大细胞和其他抗原呈递细胞(APC)。其还在非免疫细胞上表达，包括胰腺的胰岛、肝脏的Kupffer细胞、血管内皮和选定的上皮，例如气道上皮和肾小管上皮，在炎症发作期间其表达会增强。在许多恶性肿瘤中PD-L1也以升高的水平存在，所述恶性肿瘤包括但不限于乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、肺癌、肾癌(包括肾细胞癌)、胃癌、膀胱癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肝细胞癌(HCC)、胰腺癌和黑色素瘤。还已经表明，通过刺激IFN-γ(干扰素gamma)，可上调PD-L1在细胞表面的表达。

PD-L1(CD274，B7-H1)结合程序性细胞死亡蛋白1(PD-1，CD279)，其是CD28受体家族的成员，该受体家族包括CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1和BTLA。PD-1通常在免疫细胞中表达，例如T细胞、B细胞、单核细胞和自然杀伤(NK)细胞。PD-L1和PD-L2(CD273，B7-DC)都是PD-1的细胞表面糖蛋白配体。PD-1与PD-L1或PD-L2的结合启动抑制T细胞活化和细胞因子分泌的信号。这种T细胞活化的下调反过来导致T细胞增殖、IL-2分泌、IFN-γ分泌以及其他生长因子和细胞因子的分泌减少。Freeman等人,J.Exp.Med.,192:1027-1034(2000)；Latchman等人,Nat.Immunol.,2:261-8(2001)；Carter等人,Eur.J.Immunol.,32:634-43(2002)；Ohigashi等人,Clin.Cancer Res.,11:2947-53(2005)。据信通过PD-1/PD-L1相互作用的信号传导通过负调节T细胞应答，在免疫系统内起着至关重要的、非冗余的功能。该调节参与胸腺中T细胞的发育、慢性炎性反应的调节以及外周耐受和免疫赦免的维持。在PD-1缺陷型小鼠中例证了这些功能的关键性质，这些PD-1缺陷型小鼠表现出自身免疫表型。C57BL/6小鼠中的PD-1缺陷导致慢性进行性狼疮样肾小球肾炎和关节炎。在Balb/c小鼠中，由于存在心脏组织特异性自身反应抗体，PD-1缺陷导致严重的心肌病。

已经提出PD-L1通过增加抗原特异性T细胞克隆的凋亡，在肿瘤免疫中发挥作用。Dong等人,Nat.Med.,8:793-800(2002)。此外，已经表明PD-L1可能参与肠粘膜炎症，对PD-L1抑制与结肠炎相关的消耗性疾病进行抑制。Kanai等人,J.Immunol.,171:4156-63(2003)。通常，已经提出了抑制PD-L1信号传导可作为增强T细胞免疫性以治疗癌症(例如肿瘤免疫)和感染的手段，包括急性和慢性(例如持续性)感染。

由于PD-L1、PD-L2和PD-1参与下调免疫应答，包括抑制抗肿瘤免疫应答，其被称为“免疫检查点”蛋白。Pardoll,Nat.Rev.Cancer,12:252-264(2012)。使用免疫检查点抑制剂(例如，靶向PD-1、PD-L1或CTLA-4的抗体)的临床研究已取得了有前景的结果，但是，已经观察到只有一部分患者最初对当前的抑制剂有反应，并且越来越多的临床证据表明相当大比例的初始反应者最终复发，数月或数年后，成为致命的药物抗性疾病。Syn等人,The LancetOncology,18(12):e731–e741(2017)。

表皮生长因子受体(EGFR)是跨膜糖蛋白，是受体酪氨酸激酶ErbB超家族的成员。已经表明EGFR在复杂的信号传导级联中起重要作用，该信号传导级联促进上皮癌的发展、存活和转移。当EGFR结合其同源配体表皮生长因子(EGF)、然后与另一个EGFR(同二聚化)或另一个受体酪氨酸激酶(异二聚化)形成二聚体时，就会触发EGFR信号传导。此后，二聚体被内化以在细胞核中降解或积聚，在细胞核中EGFR可以调节参与癌症转化的多个基因的转录。因此，EGFR已经被认为是抗肿瘤疗法的有吸引力的治疗靶标。批准的靶向EGFR的抗癌疗法包括单克隆抗体西妥昔单抗(一种人鼠嵌合的抗EGFR单克隆抗体)和帕尼单抗(一种人抗EGFR单克隆抗体)。许多抑制EGFR和其他酪氨酸激酶受体的小分子酪氨酸激酶抑制剂已被批准用作抗癌疗法，包括吉非替尼、厄洛替尼、拉帕替尼和卡奈替尼。这些批准的药物已单独使用或以多种组合形式用于治疗各种癌症。有关在抗癌疗法中靶向EGFR的综述，参见Seshacharyulu等人,Expert Opin.Ther.Targets,16(1):15-31(2012)。

PD-L1和EGFR参与不同信号传导通路的调节，已知这两种通路均有助于癌细胞在人体内的启动、生长、维持和扩散。但是，在某些癌细胞中，已显示EGFR的活化上调PD-L1表达，表明这两种通路之间存在一定程度的“串扰”(Chen等人,J.Thorac.Oncol.,10(6):910-923(2015)。抑制这两种蛋白以阻断其各自调节功能的疗法可提供一种有效的治疗多种癌症的方法。

发明内容

本发明通过提供结合EGFR和PD-L1的工程化的双特异性蛋白来满足上述需求。特别地，本发明提供了结合人EGFR和人PD-L1的双特异性、多价结合蛋白。本发明的优选的双特异性结合蛋白是结合EGFR和PD-L1的“Fabs-In-Tandem免疫球蛋白”(FIT-Ig)结合蛋白。如本文中所示，根据本发明的这种“EGFR/PD-L1”FIT-Ig结合蛋白在哺乳动物细胞培养物中以显著高的产率生产，并且不表现出显著的聚集体形成。低生产率和显著的聚集体形成是问题，其使得之前针对EGFR和PD-L1制备的FIT-Ig结合蛋白无法进行临床前和临床阶段评估，而这些评估是确定此类结合蛋白是否可用作治疗性抗癌药所必须的。

在一个实施方案中，本发明提供了结合EGFR和PD-L1的EGFR/PD-L1FIT-Ig结合蛋白，其包含第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链，其中

所述第一多肽链(“重链”)从氨基末端到羧基末端包含VL

VL

VH

第二多肽链(“第一轻链”)从氨基末端到羧基末端包括VH

VH

第三多肽链(“第二轻链”)从氨基末端到羧基末端包含VL

VL

在一个优选的实施方案中，上述EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白是六多肽链FIT-Ig结合蛋白，其包含两条上述第一多肽链、两条上述第二多肽链、和两条上述第三多肽链，其中所述多肽链结合形成四个Fab结合单元，其中两个Fab结合单元结合EGFR，两个Fab结合单元结合PD-L1。

优选地，存在于本发明的FIT-Ig结合蛋白的一条或多条多肽链(例如上述的第一多肽链和第三多肽链)中的CL结构域是人CL kappa结构域(hCκ)。优选地，本发明的FIT-Ig结合蛋白的CL结构域源自人IgG1(hIgG1)抗体。存在于本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白的一条或多条多肽链中的优选的hIgG1 CL kappa结构域包含SEQ ID NO：1的氨基酸残基108-214。

优选地，存在于本发明的FIT-Ig结合蛋白的一条或多条多肽链(例如上述的第一多肽链和第二多肽链中)的CH1结构域源自人IgG1抗体。存在于本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白的一条或多条多肽链中的优选的hIgG1 CH1结构域包含SEQ ID NO：1的氨基酸残基332-434。

优选地，存在于本发明的FIT-Ig结合蛋白的第一多肽链(或“重链”)中的多肽链中的Fc包含抗体Fc区，所述抗体Fc区包含铰链-CH2-CH3结构域。优选地，Fc源自人IgG1抗体。存在于本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白的第一多肽链中的优选的hIgG1 Fc区包含SEQ ID NO：1的氨基酸残基435-661。

本发明还提供了结合EGFR和PD-L1的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白，其包含：

第一多肽链，其包含根据SEQ ID NO：1的氨基酸残基的序列；

第二多肽链，其包含根据SEQ ID NO：2的氨基酸残基的序列；和

第三多肽链，其包含根据SEQ ID NO：3的氨基酸残基的序列；

其中EGFR/PD-L1 FIT-Ig包含EGFR的Fab结合单元和PD-L1的Fab结合单元。

在一个优选的实施方案中，上述EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白是六多肽链FIT-Ig结合蛋白，其包含两条包含根据SEQ ID NO：1的氨基酸残基的序列的第一多肽链、两条包含根据SEQ ID NO：2的氨基酸残基的序列的第二多肽链、和两条包含根据SEQ ID NO：3的氨基酸残基的序列的第三多肽链，其中所述多肽链结合形成四个Fab结合单元，其中两个Fab结合单元结合EGFR，两个Fab结合单元结合PD-L1。

优选地，本文所述的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白同时结合EGFR和PD-L1。在另一个实施方案中，本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白结合两个EGFR蛋白和两个PD-L1蛋白。在一个更优选的实施方案中，本文所述的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白同时结合两个EGFR蛋白和两个PD-L1蛋白。

在一个实施方案中，根据本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白结合EGFR和PD-L1，其中对EGFR和PD-L1的亲和力基本上与各亲本抗体对EGFR和PD-L1的亲和力相同(即，相同或在30％以内)，所述FIT-Ig结合蛋白的各个EGFR和PD-L1抗原结合位点源自所述亲本抗体。

在一个实施方案中，本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白结合EGFR，并且对人EGFR的结合速率常数(k

在一个实施方案中，本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白结合人EGFR，并且对人EGFR的解离速率常数(k

在一个实施方案中，本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白结合人EGFR，并且对人EGFR的解离常数(KD)小于1×10

在一个实施方案中，本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白结合PD-L1，并且对人PD-L1的结合速率常数(k

在一个实施方案中，本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白结合人PD-L1，并且对人PD-L1的解离速率常数(k

在一个实施方案中，本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白结合人PD-L1，并且对PD-L1的解离常数(k

在一个实施方案中，根据本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白在哺乳动物细胞培养物中以大于10mg/L的水平表达。

可以使用蛋白A亲和色谱法从细胞培养基中纯化完全装配的六多肽链EGFR/PD-L1FIT-Ig结合蛋白“单体”。可以使用尺寸排阻色谱法(SEC)进一步分析已使用蛋白A亲和色谱法纯化的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白的溶液或悬浮液可能的聚集体，其中蛋白聚集体检测为分子量大于六链EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白单体的分子量的分子种类，后者的分子量约为240,000道尔顿。在一个实施方案中，本发明提供了包含本文所述的EGFR/PD-L1FIT-Ig结合蛋白的组合物(例如溶液或悬浮液)，所述EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白已使用蛋白A亲和色谱法(优选地，色谱柱)纯化并且具有小于或等于0.1％(≤0.1％)的FIT-Ig蛋白聚集体。

在另一个实施方案中，本文所述的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白是糖基化的。优选地，糖基化是人糖基化模式。

在一个实施方案中，本文所述的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白抑制或阻断EGFR信号传导或PD-L1信号传导。优选地，本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白抑制或阻断EGFR信号传导和PD-L1信号传导。

在一个实施方案中，本文所述的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白抑制癌细胞的生长或存活。

本发明还提供了一种或多种分离的核酸，其编码上述EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白的一条或多条多肽链。

在一个优选的实施方案中，本发明的分离的核酸分子编码EGFR/PD-L1FIT-Ig结合蛋白的第一多肽链(重链)、第二多肽链(第一轻链)或第三多肽链(第二轻链)，其中：

第一多肽链(重链)包含根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列；

第二多肽链(第一轻链)包含根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列；和

第三多肽链(第二轻链)包含根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明提供了一种表达载体，其包含编码EGFR/PD-L1FIT-Ig结合蛋白的一条或多条多肽链的上述一个或多个分离的核酸分子，其中一个或多个分离的核酸分子可操作地连接至与表达载体相容的宿主细胞中的合适的转录和/或翻译序列，该转录和/或翻译序列是表达EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白的一条或多条编码的多肽链所需要的。优选地，单个表达载体包含仅编码本文所述的FIT-Ig结合蛋白的三条组分多肽链之一的单个核酸，使得在宿主细胞中必须存在三个单独的表达载体(每个仅编码和表达三个组分多肽之一)，以产生本文所述的FIT-Ig结合蛋白。

本文所述用于克隆和表达核酸的优选载体包括但不限于pcDNA、pcDNA3.1、pTT(Durocher等人Nucleic Acids Res.,30(2e9):1-9(2002))、pTT3(具有其他多克隆位点的pTT)、pEFBOS(Mizushima和Nagata,Nucleic Acids Res.,18(17):5322(1990))、pBV、pJV、pcDNA3.1 TOPO、pEF6 TOPO和pBJ。

本发明的载体可以是自主复制载体或可以是掺入宿主细胞基因组中的载体。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含上述一个或多个载体的分离的宿主细胞。这样的分离的宿主细胞可以是分离的原核细胞或分离的真核细胞。

在本发明的一个实施方案中，包含本文所述的一个或多个载体的分离的原核宿主细胞是细菌宿主细胞。细菌宿主细胞可以是革兰氏阳性、革兰氏阴性或革兰氏可变细菌细胞。优选地，包含一个或多个本文所述载体的细菌宿主细胞是革兰氏阴性细菌。甚至更优选地，包含一个或多个本文所述的载体的细菌宿主细胞是大肠杆菌细胞。

在本发明的一个实施方案中，包含一个或多个本文所述载体的分离的宿主细胞是真核宿主细胞。可以包含本文所述的一个或多个载体的分离的真核宿主细胞的示例包括但不限于哺乳动物宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真菌宿主细胞、真核藻类宿主细胞、线虫宿主细胞、原生动物宿主细胞和鱼类宿主细胞。

可以包含本文所述的一个或多个载体的分离的真菌宿主细胞选自：曲霉菌(Aspergillus)、脉孢属(Neurospora)、酿酒酵母(Saccharomyces)、毕赤酵母(Pichia)、汉逊酵母(Hansenula)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、耶氏酵母(Yarrowia)和念珠菌(Candida)。优选的真菌宿主细胞是酿酒酵母宿主细胞。更优选地，酿酒酵母宿主细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞。根据本发明用作宿主细胞的昆虫细胞是昆虫Sf9细胞。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的宿主细胞是分离的哺乳动物宿主细胞，其包含本文所述的一个或多个表达载体，其中所述哺乳动物宿主细胞表达在一个或多个表达载体上编码的三条多肽链，并且其中多肽链结合形成FIT-Ig结合蛋白，其包含两个结合EGFR的Fab结合单元和两个结合PD-L1的Fab结合单元。特别优选的是选自以下的哺乳动物宿主细胞：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、Vero细胞、SP2/0细胞、NS/0骨髓瘤细胞、人胚肾(HEK293)细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、HeLa细胞、人B细胞、CV-1/EBNA细胞、L细胞、3T3细胞、HEPG2细胞、PerC6细胞和MDCK细胞。

更优选地，根据本发明的分离的哺乳动物宿主细胞包含三个表达载体，其中每个表达载体编码并表达本文所述的FIT-Ig结合蛋白的三条组分多肽链之一，并且其中三条表达的多肽链结合，以形成包含两个结合EGFR的Fab结合单元和两个结合PD-L1的Fab结合单元的FIT-Ig结合蛋白。

本发明还提供了产生本文所述的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白的方法，该方法包括在足以产生EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白的条件下培养包含本文所述的一个或多个表达载体的分离的宿主细胞。

本发明的另一方面是通过以下方法产生的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白，该方法包括在足以产生EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白的条件下培养包含本文所述的一个或多个表达载体的分离的宿主细胞。

本文所述的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白可以与另一化合物缀合，例如，以与其他缀合抗体相似的方式，沿着或在一条或两条第一(重)多肽链的Fc区的CH3结构域的羧基末端缀合。可以缀合至EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白的此类化合物包括但不限于显像剂和治疗剂。可与EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白缀合的优选的显像剂包括但不限于：放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记、生物素、链霉亲和素和抗生物素蛋白。可以与本文描述的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白缀合的放射性标记包括但不限于

在另一个实施方案中，本文所述的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白可以是结晶的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白，其保留了非结晶的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白对EGFR和PD-L1的结合亲和力。当施用于个体时，这种结晶的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白还可提供EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白的无载体控释。与非结晶形式相比，当施用于个体时，本发明的结晶的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白还可以表现出更大的体内半衰期。本发明的结晶的结合蛋白可以根据本领域已知的方法生产，如国际公开号WO 02/072636(Shenoy等人)中所公开的，其通过引用并入本文。

本发明的一个实施方案提供了用于释放结晶的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白的组合物，其中该组合物包含本文所述的结晶的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白、赋形剂成分和至少一种聚合物载体。优选地，赋形剂成分选自：白蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇、明胶、羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。优选地，聚合物载体是选自以下的一种或多种的聚合物：聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(氨基酸)、聚(酸酐)、聚(缩肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-乙醇酸共聚物)或PLGA、聚(β-羟基丁酸酯)、聚(己内酯)、聚(二恶烷酮)；聚乙二醇、聚(羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚[(有机)磷腈]、聚(原酸酯)、聚乙烯醇、聚(乙烯基吡咯烷酮)、马来酸酐/烷基乙烯基醚共聚物、普朗尼克多元醇、白蛋白、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原蛋白、纤维蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖、硫酸化多糖、其掺合物及其共聚物。

本发明的药物组合物包含本文所述的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白和一种或多种药学上可接受的组分，例如药学上可接受的载体(载剂、缓冲液)、药学上可接受的赋形剂和/或其他药学上可接受的成分。

可用于本发明药物组合物中的优选药学上可接受的载体包括但不限于：水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇及其组合。

本发明的药物组合物可以进一步包含等渗剂。在本发明的药物组合物中，有用的优选的等渗剂选自：糖、多元醇(例如甘露醇或山梨醇)、氯化钠及其组合。

包含本文所述的EGFR/PD-L1 FTI-Ig结合蛋白的药物组合物可以进一步包含一种或多种其他治疗活性化合物(治疗剂)。可掺入本发明的药物组合物中的此类其他治疗剂的示例包括但不限于与本文所述的EGFR/PD-L1 FTI-Ig结合蛋白不同的抗癌剂(例如，含细胞毒性金属的抗癌化合物或基于细胞毒性放射性同位素的抗癌化合物及其组合)、抗生素、抗病毒化合物、镇静剂、兴奋剂、局部麻醉剂、抗炎类固醇(例如天然或合成的抗炎类固醇及其组合)、镇痛剂(例如乙酰水杨酸、对乙酰氨基酚、萘普生、布洛芬、COX-2抑制剂、吗啡、羟考酮及其组合)、抗组胺剂、非甾体抗炎药(“NSAID”，例如，乙酰水杨酸、布洛芬、萘普生、COX-2抑制剂及其组合)，及其组合。

在另一个实施方案中，本发明的药物组合物包含如本文所述的EGFR/PD-L1FIT-Ig结合蛋白、药学上可接受的载体和佐剂，其中所述佐剂提供对患者免疫系统的一般刺激。

在一个实施方案中，本发明提供了一种在需要其的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向受试者施用如本文所述的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白。

本发明还提供了抑制或阻断细胞中EGFR信号传导的方法，该方法包括使表达EGFR的细胞与本文所述的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白接触。

在另一个实施方案中，本发明提供了抑制或阻断细胞中PD-L1信号传导的方法，该方法包括使表达PD-L1的细胞与本文所述的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白接触。

在一个实施方案中，本发明提供了一种在需要其的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向受试者施用如本文所述的包含EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白的药物组合物。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗癌症患者的癌症的方法，其中将如本文所述的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白施用于受试者，并且其中所述癌症是通常对免疫疗法反应的癌症。在另一个实施方案中，癌症是与免疫疗法无关的癌症。在另一个实施方案中，癌症是难治性或复发性恶性肿瘤。

优选地，使用根据本发明的方法治疗的癌症是上皮癌。

在另一个实施方案中，使用根据本发明的方法治疗的癌症选自：黑色素瘤(例如，转移性恶性黑色素瘤)、肾癌(例如，透明细胞肾细胞癌，“CCRCC”)、前列腺癌(例如，激素难治性前列腺腺癌)、胰腺腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、食道癌、头颈部鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、白血病、淋巴瘤和其他肿瘤性恶性肿瘤。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于治疗患有其中EGFR和/或PD-L1活性是有害的疾病的人受试者的方法，该方法包括向受试者施用本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白，使得降低或阻断由受试者中的PD-L1/PD1结合和/或EGFR/EGF结合介导的活性。

在一个实施方案中，本发明提供了一种检测样品中的EGFR和/或PD-L1的方法，其中所述样品含有或疑似含有EGFR或PD-L1或表达EGFR或PD-L1的细胞，其中所述样品与本文所述的FIT-Ig结合蛋白接触。例如，本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白可用于在常规免疫测定法中检测EGFR或PD-L1或两者，例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)或组织免疫组织化学，其中使用FIT-Ig结合蛋白，而不是抗EGFR抗体或抗PD-L1抗体。本发明提供了用于检测生物样品中的EGFR或PD-L1的方法，该方法包括使生物样品与本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白接触，和检测是否发生与靶抗原(EGFR或PD-L1)的结合，从而检测生物样品中是否存在靶标。可以用可检测物质直接或间接标记FIT-Ig结合蛋白，以促进结合或未结合的FIT-Ig结合蛋白的检测。适当的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质和放射性物质。适当的酶的示例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适当的辅基复合物的示例包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适当的荧光物质的示例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的示例包括鲁米诺；适当的放射性物质的示例包括

附图说明

图1是说明构建用于表达实施例1中描述的每种FIT-Ig结合蛋白的三种类型多肽链的三个表达载体的一般程序的图。

如图1中所示，为了表达FIT-Ig结合蛋白的第一多肽链(“重链”)，合成了编码第一多肽链的VL

如图1所示，为了表达FIT-Ig结合蛋白的第二多肽链(“轻链#1)，合成编码抗体VH

为了表达第三多肽链(“轻链#2)，合成编码抗体VL

有关更多详细信息，参见实施例1。

图2显示了之前通过蛋白A亲和色谱法纯化的FIT-Ig1样品的尺寸排阻色谱法洗脱图。洗脱图是复合的，表明显著比例的FIT-Ig1聚集体。FIT-Ig1六链单体占纯化蛋白的小于30％。有关详细信息，参见实施例1.7。

图3显示了之前通过蛋白A亲和色谱法纯化的FIT-Ig2样品的尺寸排阻色谱法洗脱图。洗脱图显示了FIT-Ig2六链单体的主峰和表明聚集体的几个峰。图下方的表格提供了几个峰的分析结果。FIT-Ig2六链单体占纯化蛋白的小于75％。有关详细信息，参见实施例1.7。

图4显示了之前通过蛋白A亲和色谱法纯化的FIT-Ig3样品的尺寸排阻色谱法洗脱图。洗脱图是复合的，表明显著比例的聚集体。FIT-Ig3六链单体占纯化蛋白的小于40％。有关详细信息，参见实施例1.7。

图5显示了之前通过蛋白A亲和色谱法纯化的FIT-Ig4样品的尺寸排阻色谱法洗脱图。洗脱图显示了FIT-Ig4六链单体的主峰和表明低比例聚集体的几个峰。图下方的表格提供了几个峰的分析结果。FIT-Ig4六链单体占纯化蛋白的约91％。有关详细信息，参见实施例1.7。

图6显示了之前通过蛋白A亲和色谱法纯化的FIT-Ig5样品的尺寸排阻色谱法洗脱图。洗脱图显示了FIT-Ig5六链单体的主峰和表明非常低比例聚集体的小峰。图下方的表格提供了几个峰的分析结果。FIT-Ig5六链单体占纯化蛋白的大于98％。有关详细信息，参见实施例1.7。

图7显示了之前通过蛋白A亲和色谱法纯化的FIT-Ig6样品的尺寸排阻色谱法洗脱图。洗脱图显示了FIT-Ig6六链单体的主峰和几乎检测不到的峰，其可表明即便存在聚集体，其也以极低比例存在。图下方的表格提供了几个峰的分析结果。FIT-Ig6六链单体令人惊讶地占纯化蛋白的99.9％。有关详细信息，参见实施例1.7。

图8显示了三只雄性Sprague-Dawley大鼠中FIT-Ig6的血清浓度随时间变化的图。以5mg/kg体重的静脉内剂量向每只大鼠施用FIT-Ig6。有关详细信息，参见实施例3。

具体实施方式

已表明Fabs-In-Tandem免疫球蛋白(“FIT-Ig”)结合蛋白形式高度适应于提供针对多种不同靶抗原对或针对同一抗原上不同表位的双特异性、多价结合蛋白。参见，例如国际公开号WO 2015/103072 A1和WO 2017/136820 A2。在优选的形式中，FIT-Ig结合蛋白包含四个Fab结合单元(而不是天然IgG抗体中的两个)，其中两个Fab单元中的每个结合第一抗原(或表位)，而另两个Fab单元中的每个结合第二抗原(或表位)。尽管成功地使用FIT-Ig形式产生了多种结合与治疗相关的靶抗原对的双特异性结合蛋白，但是，之前并没有产生适合的数量和质量的结合PD-L1和EGFR的FIT-Ig结合蛋白，以进行作为候选抗癌治疗药物的常规临床前阶段评估。例如，如本文所示，许多结合PD-L1和EGFR的FIT-Ig结合蛋白在标准哺乳动物细胞培养物中，不能以足够高(即大于10mg/L)的水平表达，以提供足够量的支持临床前评估所需的蛋白，包括例如标准化学、制造和控制(“CMC”)阶段评估。另一个问题是之前生产的结合PD-L1和EGFR的FIT-Ig结合蛋白已显示出大量的聚集体形成，这大大减少了药物开发所必需的功能性六肽链(EGFR和PD-L1结合蛋白的“单体”)的量。在从蛋白A亲和色谱法洗脱的FIT-Ig结合蛋白的级分中，不可接受的FIT-Ig聚集体水平是明显的。成本分析显示，没有任何现有的FIT-Ig结合蛋白构建体能够以足够的数量和质量获得，以实现临床前阶段的抗癌评估。

本发明基于发现了在哺乳动物细胞培养物中以足够高的水平表达并且没有显著水平的聚集体形成的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白，从而使得能够进行作为治疗性抗癌药物的临床前和临床评估。

本文所述的FIT-Ig结合蛋白包含两个或更多个抗原结合位点，并且通常是四价(四个抗原结合位点)蛋白。根据本发明的优选的FIT-Ig结合蛋白结合EGFR和PD-L1，因此是双特异性的。示意性地，在FIT-Ig结合蛋白中，两条第一(重)多肽链(每条具有一般结构“V-C-V-C-Fc”，其中“V”是抗体可变结构域，C是抗体恒定结构域)和四条“轻”多肽链(每条具有一般结构“V-C”)缔结形成具有四个Fab结合单元(VH-CH1与VL-CL配对，有时称为VH-CH1::VL-CL)的六聚体。每个Fab结合单元包含抗原结合位点，该抗原结合位点包含重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域，每个抗原结合位点共有六个CDR。因此，FIT-Ig结合蛋白的每一半均包含一条重多肽链和两条轻多肽链，并且这三条链的VH-CH1和VL-CL元件的互补免疫球蛋白配对产生两个Fab结合单元，其串联排列。在本发明中，在重链多肽中，Fab结合单元的免疫球蛋白结构域直接融合，而不使用人工的结构域间接头。即，每条重多肽链的N末端V-C元件在其C末端直接融合至另一V-C元件的N末端，后者又与C末端抗体Fc区连接。在双特异性FIT-Ig结合蛋白中，串联Fab结合单元将与不同的抗原反应。

国际公开号WO2015/103072中提供了FIT-Ig结合蛋白的设计、表达和表征的描述。本文所述的此类FIT-Ig分子的优选示例包括一条重多肽链和两条不同的轻多肽链。重链包含结构式VL

使用以上方案，可以用其来源的抗原结合位点的抗原(或表位)特异性来命名FIT-Ig结合蛋白的每个多肽链的每个V结构域。例如，使用该“抗原特异性”命名方案，可以将实施例1.6和表6中所述的FIT-Ig6结合蛋白的第一多肽链(多肽链#1)的结构命名为“VL

在替代的命名方案中，不是命名抗原结合位点的各可变结构域的抗原特异性(例如，VL

如上所述，重多肽链与两条不同的轻多肽链中的每条结合形成两个完整的Fab结合单元，每个单元均包含典型的抗体VH::VL抗原结合位点。与天然IgG抗体一样，重链上的Fc区将与另一条重链上的Fc区结合，形成同二聚体，从而提供包含6条多肽链和4个Fab结合单元的FIT-Ig结合蛋白。FIT-Ig结合蛋白的每个臂具有氨基末端或“外部”Fab结合单元和羧基近端或“内部”Fab结合单元。在本文采用的FIT-Ig命名法中，特定的双特异性FIT-Ig结合蛋白可以被指定前缀，该前缀首先表示外部Fab结合单元的抗原特异性，然后表示内部Fab结合单元的抗原特异性。因此，“EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白”是指具有结合EGFR的两个外部Fab结合单元和结合PD-L1的两个内部Fab结合单元的FIT-Ig结合蛋白。

通常，与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、肿瘤学、遗传学和生物化学相关使用的命名法和技术是本领域众所周知的且常用的。除非另有说明，否则本发明的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法进行，并且在本说明书通篇所引用和讨论的各种一般性和更具体的参考文献中描述。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书进行，如本领域通常完成的或如本文所述。与本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学相关所使用的命名法以及实验步骤和技术是本领域众所周知的且常用的。使用标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制、递送和患者治疗。

为了更容易理解本发明，下面定义选择术语。

“肿瘤”是组织的异常肿块。

“良性”肿瘤是生长缓慢且自限性的异常组织块，因为它没有侵入附近组织并扩散到其原始部位之外的能力。良性肿瘤不是癌症。

术语“癌症”具有医学和肿瘤学领域中已知的含义，并且包括根据美国国立癌症研究所(“NCI”，美国国立卫生研究院的部门，贝塞斯达，马里兰州)的定义。因此，根据NCI，术语“癌症”是疾病的术语，在所述疾病中异常细胞不受控制地分裂，并可能侵袭和损害或破坏附近组织。癌细胞也可能从原发性肿瘤脱落并通过血液和/或淋巴系统扩散(转移)到身体的其他部位，并形成“继发性肿瘤”，也称为“转移性肿瘤”或“转移性癌症”。因此，术语“癌症”是指一种恶性肿瘤，其中其细胞不受控制地生长并且可以穿透和损害或破坏邻近组织，并且可以通过循环转移到身体的远处并形成新的肿瘤。

“抗癌”化合物或药物是阻断、抑制或中止癌细胞生长的化合物或药物。优选的抗癌化合物对癌细胞具有细胞毒性。

除非另外区别，否则在将本发明的化合物或组合物引入癌症患者的循环系统的途径方面，术语“静脉内的”(或“静脉内地”)和“全身的”(或“全身地”)可互换使用。

如本文所用，术语“治疗”和“治疗”通常是指任何方案，其减轻癌症的一种或多种症状或表现、抑制癌症的进展、阻止癌症的进展或逆转癌症的进展、防止继发性(转移性)癌症的发生、提供显著的杀伤转移性癌细胞、减少原发性或继发性(转移性)癌症肿瘤的大小、在一段时间内增加一种或多种继发性(转移性)肿瘤的缓解、减缓原发性或继发性(转移性)肿瘤的进展、在一段时间内减少继发性(转移性)肿瘤的数量、在一段时间内减少新的继发性(转移性)肿瘤的数量、增加癌症患者的器官或组织功能、增加癌症患者的生命力、延长患者的寿命、或其组合。

“转移”具有肿瘤学或医学领域技术人员已知和使用的相同含义，并且是指癌细胞从原发性肿瘤扩散到患者体内另一位置的过程。“转移性”癌细胞是已经从原发性肿瘤脱落或以其他方式脱离的癌细胞，并且正处在通过血液或淋巴从原发性肿瘤移动到患者体内的另一位置的过程中，或者已经通过血液或淋巴从原发性肿瘤移动到患者体内的另一位置。在这种情况下，癌症或其细胞被称为已“转移”。因此，“转移性”肿瘤是由从原发性肿瘤转移到患者体内不同位置的转移性癌细胞发展而来的肿瘤，在该位置癌细胞建立了另一(“继发性”、“转移性”)肿瘤，其与原发性肿瘤的类型相同。例如，肝脏中的转移性肠肿瘤由从原发性肠肿瘤转移并通过血液移动到肝脏的肠癌细胞启动并由其组成，然后癌细胞在肝脏中建立了继发性(转移性)肠肿瘤。还应理解，转移性肿瘤也可以是转移性癌细胞的另一来源，其可以移动到其他组织和器官并建立其他转移性肿瘤。

除非另有说明，否则当将术语“大约”和“大约”与量、数量或值组合使用时，该组合描述了所述量、数量、整数或值本身以及该量、数量、或值加上或减去5％的量、数量、或值。举例来说，短语“大约40”和“大约40”公开了“40”和“38至42，包括38和40”。

术语“多肽”是指氨基酸的任何聚合链。术语“肽”和“蛋白”与术语多肽互换使用，并且也指氨基酸的聚合链。术语“多肽”涵盖天然或人工蛋白、蛋白片段和蛋白氨基酸序列的多肽类似物。除非上下文矛盾，否则术语“多肽”涵盖其片段和变体(包括变体的片段)。对于抗原性多肽，多肽的片段任选地包含至少一个连续或非线性的多肽表位。可以使用本领域的普通技术确认至少一个表位片段的精确边界。片段包含至少约5个连续氨基酸，例如至少约8个连续氨基酸、至少约10个连续氨基酸、至少约15个连续氨基酸或至少约20个连续氨基酸。

术语“分离的蛋白”或“分离的多肽”是如下的蛋白或多肽：根据其衍生的起源或来源，其与在其天然状态下伴随的天然相关组分分离、基本上不含来自同一物种的其他蛋白、由来自不同物种的细胞表达、或者在自然界中不存在。因此，化学合成的或在不同于其天然来源的细胞的细胞系统中合成的多肽是从其天然相关组分中“分离的”。还可以使用本领域众所周知的蛋白纯化技术，通过分离使由一条或多条多肽链组成的蛋白基本上不含天然相关组分。

术语“回收”是指通过分离(例如使用本领域众所周知的蛋白纯化技术)，使化学物质(例如多肽)基本上不含天然相关组分的过程。

术语PD-L1或EGFR的“生物活性”分别是指PD-L1或EGFR的任何或全部固有的生物学特性。

涉及抗体、结合蛋白或肽与第二化学物质的相互作用的术语“特异的结合”或“特异性结合”是指相互作用取决于第二化学物质上存在的特定结构(例如，抗原决定簇或表位)。例如，抗体识别并结合特定的蛋白结构，而不是整个蛋白。如果抗体对表位“A”具有特异性，则在包含标记的“A”和抗体的反应中，存在包含表位A(或游离的未标记的A)的分子将减少与抗体结合的标记的A的量。本文所述的双特异性FIT-Ig结合蛋白包含特异性结合EGFR的两个Fab结合单元和特异性结合PD-L1的两个Fab结合单元。

术语“抗体”广义上是指由四条多肽链(两条重(H)链和两条轻(L)链)组成的任何免疫球蛋白(Ig)分子，或保留了Ig分子的基本表位结合特征的其任何功能片段、突变体、变体或衍生物。抗体形式的此类突变体、变体或衍生物是本领域已知的。下面讨论其非限制性示例。

在全长抗体中，每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域组成：CH1、CH2和CH3。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着更为保守的区，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。VH结构域的第一、第二和第三CDR通常被列举为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；同样，VL结构域的第一、第二和第三CDR通常被列举为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。

一般而言，术语“Fc区”或简称“Fc”是指抗体重链的C末端区域，其可以通过木瓜蛋白酶消化完整抗体产生。Fc区可以是天然序列Fc区或变体Fc区。Fc区通常包含两个恒定结构域，即，CH2结构域和CH3结构域，并且任选地包含CH4结构域，例如在IgM和IgE抗体的Fc区的情况下。IgG、IgA和IgD抗体的Fc区包含铰链区、CH2结构域和CH3结构域。相反，IgM和IgE抗体的Fc区缺乏铰链区，但是包含CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域。在Fc部分具有氨基酸残基取代以改变抗体效应子功能的变体Fc区是本领域已知的(参见，例如，Winter等人，美国专利号5,648,260和5,624,821)。除非另有说明，否则本文所述的FIT-Ig结合蛋白的“Fc区”是源自人IgG1抗体的Fc区，其包含铰链区、CH2结构域和CH3结构域，并且具有本文公开的以下实施例的表1-6的任何一个中的氨基酸(SEQ ID NO：8)。

抗体的Fc区介导几种重要的效应子功能，例如，细胞因子诱导、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、补体依赖性细胞毒性(CDC)以及抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除率。在某些情况下，这些效应子功能对于治疗性抗体是期望的，但在其他情况下可能是不必要的甚至是有害的，这取决于治疗目的。某些人IgG同种型，尤其是IgG1和IgG3，通过与Fc gamma受体(FcγR)和补体C1q结合分别介导ADCC和CDC。除非另有说明，否则本文所述的FIT-Ig结合蛋白中使用的Fc区保留至少一种或多种或全部与其原始供体抗体中的Fc区所具有的功能特性相同的功能特性。

在一个实施方案中，在Fc区中至少一个氨基酸残基被取代，从而改变抗体的一种或多种效应子功能。如在IgG抗体中，本文所述的FIT-Ig结合蛋白的两条相同重链的二聚化由CH3结构域的二聚化介导，并通过将FIT-Ig重链的CH1或CL结构域连接到Fc恒定结构域(例如CH2和CH3)的铰链区内的二硫键稳定。IgG的抗炎活性完全取决于IgG Fc片段的N-连接聚糖的唾液酸化。已经确定了抗炎活性的精确的聚糖需求，使得可以产生合适的IgG1 Fc片段，从而产生具有大大的增强效力的完全重组的唾液酸化IgG1 Fc(参见，Anthony等人,Science,320:373-376(2008))。此类唾液酸化的Fc区可用于本文所述的FIT-Ig结合蛋白中。

术语抗体的“抗原结合部分”和“抗原结合片段”或“功能片段”可互换使用，是指保留特异性结合抗原能力的抗体的一个或多个片段，即与衍生该部分或片段的全长抗体结合相同的抗原(例如EGFR,PD-L1)。已经表明抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。此类抗体的实施方案也可以是双特异性、双特异的或多特异的形式；其特异性结合两种或更多种不同的抗原。术语抗体的“抗原结合部分”中涵盖的结合片段的示例包括：(i)Fab片段(Fab结合单元)，其是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')

除非另有说明，否则术语“供体”和“亲本”是指任何抗体或抗原结合片段，其是提供用于制备本文所述的FIT-Ig结合蛋白的抗体可变结构域、抗体恒定结构域、Fab结合单元或Fc区的来源。非天然或工程化的抗体也可用作制备本文所述的FIT-Ig结合蛋白的供体或亲本抗体。

抗体(或免疫球蛋白)恒定结构域(C)是指抗体重链恒定结构域(CH)或轻链恒定结构域(CL)。鼠和人免疫球蛋白重链和轻链恒定结构域氨基酸序列是本领域已知的。

术语“单克隆抗体”或“mAb”是指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能少量存在的可能是天然发生的突变以外，构成该群体的各抗体是相同的。单克隆抗体针对单个抗原决定簇(表位)具有高度特异性。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种mAb针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”不应解释为要求通过任何特定方法产生抗体。

术语“人抗体”包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以，例如在CDR中，特别是在CDR3中包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外的随机或位点特异性诱变或通过体内的体细胞突变引入的突变)。但是，术语“人抗体”不包括此类抗体，其中，衍生自另一哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已移植到人框架序列上。

术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体、从重组、组合人抗体文库分离的抗体(Hoogenboom,H.R.,Trends Biotechnol.,15:62-70(1997)；Azzazy和Highsmith,Clin.Biochem.,35:425-445(2002)；Gavilondo和Larrick,BioTechniques,29:128-145(2000)；Hoogenboom和Chames,Immunol.Today,21:371-378(2000)),从人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如，小鼠)中分离的抗体(参见，例如，Taylor等人,Nucl.Acids Res.,20:6287-6295(1992)；Kellermann和Green,Curr.Opin.Biotechnol.,13:593-597(2002)；Little等人,Immunol.Today,21:364-370(2000))；或通过任何其他方法(包括将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列)制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，将此类重组人抗体进行体外诱变(或，当使用人Ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是源自人种系VH和VL序列并与之相关的序列，但可能不是在体内人抗体种系库中天然存在的。

术语“多价结合蛋白”表示包含两个或更多个抗原结合位点的结合蛋白。多价结合蛋白优选地被工程化为具有三个或更多个抗原结合位点，并且通常不是天然存在的抗体。术语“双特异性结合蛋白”是指能够结合两个不同特异性靶标的结合蛋白。

术语“活性”包括特性，例如特异性结合靶抗原的能力、抗体或结合蛋白对抗原的亲和力、中和靶抗原的生物学活性的能力、抑制靶抗原与其天然受体或天然配体相互作用的能力，等等。本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白的活性可包括但不限于，抑制EGFR与其同源配体(EGF)的结合、抑制EGFR信号传导、抑制PD-L1与PD-1的结合、抑制PD-1/PD-L1信号传导、上调T细胞对癌症的反应、杀死癌细胞、抑制癌细胞生长、抑制癌细胞存活以及抑制癌细胞扩散。

如本文所用，术语“kon”(也称为“Kon”、“kon”)是指结合蛋白(例如抗体)与抗原结合以形成结合复合物(例如，如本领域已知的抗体/抗原复合物)的结合速率常数。如本文可互换使用的，“kon”还已称为术语“结合速率常数”或“ka”。例如，该值可以表示抗体与其靶抗原的结合速率或抗体与抗原之间复合物形成的速率，如以下等式所示：

抗体(“Ab”)+抗原(“Ag”)→Ab-Ag。

如本文所用，术语“koff”(也称为“Koff”、“koff”)是指结合蛋白(例如抗体)从如本领域已知的结合复合物(例如，抗体/抗原复合物)解离的解离速率常数，或“解离速率常数”。例如，该值可以表示抗体从其靶抗原的解离速率、或Ab-Ag复合物随时间分离成游离抗体和抗原的解离速率，如以下等式所示：

Ab+Ag←Ab-Ag。

如本文所用，术语“K

术语“分离的核酸”是指多核苷酸(例如，基因组、cDNA或合成来源的多核苷酸，或其某种组合)，其通过人为干预从与其一起天然存在的全部或部分多核苷酸分离，与不是天然连接的多核苷酸可操作地连接，或不会作为天然中较大序列的一部分存在。

如本文所用，术语“载体”旨在指能够转运已与其连接的另一核酸的核酸分子。载体的一种类型是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可以连接其他DNA区段。载体的另一种类型是病毒载体，其中可以将其他DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。在导入宿主细胞后，其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)可以整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括具有等同功能的此类其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

术语“可操作地连接”是指并置，其中所描述的组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系中。控制序列与编码序列以在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达的方式“可操作地连接”。“可操作地连接”的序列包括与感兴趣基因连续的表达控制序列和以反式或远距离作用控制感兴趣基因的表达控制序列。如本文所用，术语“表达控制序列”是指实现与它们连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止子、启动子和增强子序列；有效的RNA处理信号，例如剪接和聚腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；以及在需要时，增强蛋白分泌的序列。此类控制序列的性质根据宿主生物体而不同；在原核生物中，此类控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，通常，此类控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在包括其存在对于表达和加工是必需的组分，并且还可以包括其存在是有利的其他组分，例如前导序列和融合伴侣序列。

术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)旨在指已将外源DNA引入其中的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞包含两个或更多个(例如，多个)编码抗体的核酸，例如美国专利号7,262,028中描述的宿主细胞。此类术语不仅旨在指特定的受试细胞，而且还指此类细胞的后代。因为由于突变或环境影响，某些修饰可能在后代中发生，所以此类后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。在一个实施方案中，宿主细胞包括选自任何生命界的原核和真核细胞。在另一个实施方案中，真核细胞包括原生生物、真菌、植物和动物细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞包括但不限于原核细胞系大肠杆菌；哺乳动物细胞系CHO、HEK293、COS、NS0、SP2和PER.C6；昆虫细胞系Sf9；和真菌细胞酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成、细胞培养、组织培养和转化(例如，转染、电穿孔、脂转染)。酶促反应和纯化技术可以根据制造商的说明书或如本领域通常完成的或如本文所述的进行。前述技术和步骤通常可以根据本领域公知的常规方法来执行，并且如本说明书通篇所引用和讨论的各种一般性和更具体的参考文献中所述。参见，例如，Sambrook等人,

如本文所用，术语“激动剂”是指调节剂，当与感兴趣分子接触时，与不存在激动剂时所观察到的活性或功能的大小相比，所述激动剂引起分子的某种活性或功能的大小增加。如本文所用，术语“拮抗剂”和“抑制剂”是指调节剂，当与感兴趣分子接触时，与不存在拮抗剂时所观察到的活性或功能的大小相比，其引起分子的某种活性或功能的大小降低。本发明的特定拮抗剂是本文所述的EGFR/PD-L1 FIT-Ig，其阻断或抑制EGFR与EGF的结合，阻断或抑制PD-L1与PD-1的结合，阻断或抑制EGFR信号传导，阻断或抑制PD-L1信号传导，阻断或抑制EGFR依赖性信号传导的促癌症活性，阻止或抑制PD-L1依赖性信号传导的促癌症活性，及其一种或多种组合。

如本文所用，术语“有效量”是指足以降低或减轻疾患或其一种或多种症状的严重性和/或持续时间；预防疾患的进展；使疾患消退；防止与疾患相关的一种或多种症状的复发、发展或进展；检测疾患；或增强或改善其他疗法(例如预防剂或治疗剂)的预防或治疗效果的疗法的量。

除非本文另有定义，否则与本发明结合使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应该清楚，但是，在任何潜在歧义的情况下，本文提供的定义优先于任何词典或外部定义。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用表示“和/或”。此外，术语“包括”以及其他形式，例如“包含”和“包括的”的使用不是限制性的。同样，术语，例如“元件”或“成分”即包括包含一个单元的元件和成分，也包括包含多于一个亚单元的元件和成分，除非另外特别说明。

本文描述为“包括”一个或多个命名元件或步骤的组合物或方法是开放式的，这意味着命名元件或步骤是必须的，但是可以在组合物或方法的范围内添加其他元件或步骤。为避免累赘，还应理解，本文描述为“包含”(或“其包含”)一个或多个命名元件或步骤的任何组合物或方法也描述了相应的、更限制性的“基本上由相同的命名元件或步骤组成”或“基本上由……组成”)的组合物或方法，表示该组合物或方法包括命名的必须元件或步骤，并且还可以包括不会实质性影响该组合物和方法的基本和新颖特征的其他元件或步骤。还应理解，本文描述为“包含”或“基本上由一个或多个命名元件或步骤组成的”任何组合物或方法，也描述了相应的、更限制性的和封闭式的“由命名元件或步骤组成”(或由其组成)的组合物或方法，以排除任何其他未命名的元件或步骤。在本文公开的任何组合物或方法中，任何命名的必须元件或步骤的已知或公开的等同物可以代替该元件或步骤。

本发明优选的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白，称为“FIT-Ig6”(或“EGFR/PD-L1FIT-Ig6”)，其结合EGFR和PD-L1，并包含：

第一多肽链(重链)，其包含根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列；

第二多肽链(第一轻链)，其包含根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列；

第三多肽链(第二轻链)，其包含根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

上述第一、第二和第三多肽链的结合提供了“半个FIT”分子，该分子包含对EGFR特异的氨基末端或“外部”Fab结合单元，其串联连接至对PD-L1特异的羧基近端或“内部”Fab结合。与在天然IgG1抗体中一样，第一多肽链羧基末端区域的Fc(铰链-CH2-CH3)可以与另一半FIT分子的Fc结合，形成完全组装的六多肽链FIT-Ig结合蛋白，其包含两个外部EGFR特异的Fab结合单元和两个内部PD-L1特异的Fab结合单元。

FIT-Ig结合蛋白的Fab结合单元的特异性源自亲本抗体，该亲本抗体用作形成特异性抗原结合位点的抗体重链和轻链可变结构域(VH，VL)的来源。

本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白同时结合EGFR和PD-L1。在另一个实施方案中，EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白同时结合两个EGFR蛋白和两个PD-L1蛋白。

根据本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白以与EGFR和PD-L1特异性所来源的每种亲本抗体相似的亲和力结合EGFR和PD-L1。

可以使用多种系统中的任一种来测量根据本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白对EGFR和PD-L1的亲和力，包括生物层干涉法(例如，使用

本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白结合EGFR，并且对人EGFR的结合速率常数(k

本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白结合人EGFR，并且对人EGFR的解离速率常数(k

本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白结合人EGFR，并且对人EGFR的解离常数(KD)小于1×10

本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白结合PD-L1，并且对人PD-L1的结合速率常数(k

本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白结合人PD-L1，并且对人PD-L1的解离速率常数(k

在一个实施方案中，本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白结合人PD-L1，并且对PD-L1的解离常数(k

在使用蛋白A亲和色谱法从细胞培养基中一步纯化后，本发明优选的EGFR/PD-L1FIT-Ig结合蛋白没有显示出显著的聚集体形成。如本文所示，在蛋白A亲和色谱法纯化后，可以使用尺寸排阻色谱法(例如，使用高效液相色谱(HPLC)柱的尺寸排阻色谱法)分析含有EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白的柱洗脱液中是否存在聚集体。尺寸排阻色谱法(SEC)将根据尺寸分离分子，因此，将具有完全组装的六多肽链EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白(也称为六链“单体”)的预期分子量的分子从具有更高或更低分子量的其他物质分离。六链单体的分子量约为240,000道尔顿。已经使用蛋白A亲和层析从培养基中纯化的本发明的优选的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白具有小于或等于0.1％的聚集体。即，在哺乳动物细胞培养物中产生的本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白的至少99.9％将作为完全组装的六链单体存在。认为小于或等于0.1％(≤0.1％)的蛋白聚集体的水平是非显著的量，其不会妨碍EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白作为抗癌药物的有效临床前和临床评估。相反，如本文所示，在其他先前产生的EGFR/PD-L1和PD-1/EGFR FIT-Ig结合蛋白中发现的聚集体的量为1.2％至大于70％。因此，在聚集体形成的方面，本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白更稳定并且比先前产生的结合EGFR和PD-L1的FIT-Ig结合蛋白具有显著更低的聚集体百分比(例如，至少低10倍)。参见下文实施例1.7中的表7。

本发明提供了产生本文所述的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白的方法，其包括在足以产生EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白的条件下培养分离的宿主细胞，所述宿主细胞包含一个或多个编码EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白的三条多肽链的载体。期望的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白表达为六多肽链FIT-Ig结合蛋白，其包含两个外部EGFR特异性Fab结合单元和两个内部PD-L1特异性Fab结合单元。

包含表达载体和相容的原核或真核宿主细胞的多种表达系统可用于表达重组异源蛋白。经常用于表达重组蛋白的原核宿主细胞的一个示例是大肠杆菌细胞。可用于表达重组蛋白的真核宿主细胞包括但不限于哺乳动物宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真菌宿主细胞、藻类宿主细胞、线虫宿主细胞、原生动物宿主细胞和鱼宿主细胞。可用于表达重组蛋白的真菌宿主细胞包括但不限于：曲霉菌(Aspergillus)、脉孢属(Neurospora)、酿酒酵母(Saccharomyces)、毕赤酵母(Pichia)、汉逊酵母(Hansenula)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、耶氏酵母(Yarrowia)和念珠菌(Candida)。用于表达重组蛋白的优选的酿酒酵母宿主细胞是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞。根据本发明用作宿主细胞的昆虫细胞是昆虫Sf9细胞。

FIT-Ig结合蛋白优选使用哺乳动物细胞表达系统产生。FIT-Ig结合蛋白的构建和表达先前已在国际公开号WO 2015/103072 A1和WO 2017/136820 A2中描述。可以使用类似的材料和方法来产生本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白。此类方法通常用于在所选宿主细胞中表达重组抗体和工程化的结合蛋白。

通常，FIT-Ig结合蛋白的每条多肽链与氨基末端信号序列(信号肽)一起在分离的核酸分子上编码，后者将新生的多肽链导向内质网(ER)的腔然后进入高尔基体进行分泌。可以使用化学DNA合成方法、使用重组DNA方法或使用两种方法的组合来制备编码本文所述的FIT-Ig结合蛋白的多肽链的各个核酸分子。

然后，将编码FIT-Ig结合蛋白的多肽链之一的每个核酸分子插入单独的表达载体中，从而可操作地连接至合适的转录和/或翻译序列，以允许该多肽链在与表达载体相容的宿主细胞中表达。

载体可以是自主复制载体或将载体中存在的分离的核酸掺入宿主细胞基因组中的载体。本文所述用于表达核酸的优选载体包括但不限于pcDNA、pTT(Durocher等人Nucleic Acids Res.,30(2e9):1-9(2002))、pTT3(具有其他多克隆位点的pTT)、pEFBOS(Mizushima和Nagata,Nucleic Acids Res.,18(17):5322(1990))、pBV、pJV、pcDNA3.1TOPO、pEF6 TOPO和pBJ,以及根据在特定宿主细胞中表达本文所述EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白的需要对其进行的修饰。

在产生FIT-Ig结合蛋白的优选方案中，FIT-Ig结合蛋白在用三个表达载体转染的哺乳动物宿主细胞中表达，其中每个表达载体包含编码FIT-Ig结合蛋白的三条组分多肽链之一的核酸。

优选地，包含本文所述的载体的分离的哺乳动物宿主细胞选自：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、Vero细胞、SP2/0细胞、NS/0骨髓瘤细胞、人胚肾(HEK293)细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、HeLa细胞、人B细胞、CV-1/EBNA细胞、L细胞、3T3细胞、HEPG2细胞、PerC6细胞和MDCK细胞。

转染的HEK293细胞通常用作瞬时转染系统，该系统可以提供短期产生重组蛋白，包括工程化的抗体和结合蛋白，例如在转染后4到10天。转染的HEK293细胞通常用于初始实验室克隆、产生和分析重组蛋白，从而避免了分离稳定转染的生产细胞系(例如稳定的转染CHO细胞系)所需的时间和劳力。对于熟悉工程化抗体和结合蛋白产生的技术人员，瞬时转染细胞的培养物中低于10mg/L的表达水平太低，以至于无法期望有足够量的结合蛋白可用于进行初步的临床前评估，例如生物活性研究、初步稳定性研究、药代动力学(PK)研究以及动物模型中的功效。此外，该领域的技术人员还认识到，瞬时转染的HEK293细胞的培养物中低于10mg/L的表达水平表明，即使花费大量时间和精力也不太可能成功分离具有高表达性(例如，大于1g/L)的稳定表达的CHO细胞。相反，认为在瞬时转染的HEK293细胞的培养物中，FIT-Ig结合蛋白的表达水平高于10mg/L是足够高的，可以提供一定量的结合蛋白，以便在生成稳定转染的CHO细胞之前进行早期发现阶段的评估，也表明有可能成功分离稳定转染的CHO细胞，以生成后期临床前阶段和临床阶段评估所需的更高的量。

如本文所示，根据本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白可以在转染的HEK293细胞中以高于每升细胞培养物10mg(>10mg/L)EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白的水平表达。鉴于之前产生的EGFR/PD-L1和PD-1/EGFR FIT-Ig结合蛋白仅以约1mg/L至约8mg/L的水平表达，因此该表达水平是意想不到的。另外，与其他FIT-Ig结合蛋白相比，不仅仅是生产水平的逐步提高，本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白在转染的HEK293细胞培养物中的表达水平确保了结合蛋白可以足够的量用于作为新的抗癌治疗药物的临床前阶段和临床阶段的评估。

本发明的药物组合物包含本文所述的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白和一种或多种药学上可接受的组分，例如药学上可接受的载体(载剂、缓冲液)、赋形剂和/或其他成分。“药学上可接受的”是指组合物的载体、化合物、组分或其他成分与人受试者的生理学相容，并且对期望的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白的结合特异性无害，或者对施用于人受试者的组合物中存在的任何其他组分的任何其他期望的性质或活性无害。可用于本发明的药物组合物中的药学上可接受的载体的示例包括但不限于水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，以及它们的组合。在一些情况下，优选包括等渗剂，包括但不限于糖；多元醇，例如甘露醇或山梨糖醇；氯化钠；及其组合。

本发明的药学上可接受的组合物可进一步包含一种或多种赋形剂、少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、填充剂、防腐剂或缓冲剂，以延长药物组合物的保质期或有效性。赋形剂通常是为药物组合物提供除主要治疗性化合物或活性以外的有益特性或特征的任何化合物或化合物的组合。对于包含本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白(主要的治疗化合物)的药物组合物，赋形剂提供了除期望的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白的结合特异性或EGFR/PD-L1 FTI-Ig结合蛋白引起的抗癌活性以外的期望的有益特征。

在另一个实施方案中，本发明的药物组合物包含如本文所述的EGFR/PD-L1FIT-Ig结合蛋白、药学上可接受的载体和佐剂，其中所述佐剂提供对人免疫系统的一般刺激。

可以根据需要调节药物组合物中的pH，例如，为了促进或维持组分成分的溶解度、维持制剂中一种或多种组分成分的稳定性、和/或阻止潜在引入组合物中的不希望的微生物生长。

可以制备包含本发明的EGFR/PD-L1 FTI-Ig结合蛋白的药物组合物，以提供结合蛋白的持续或延时释放。用于制备这种控释或延时组合物的多种方法是本领域技术人员已知的，包括但不限于植入物、透皮贴剂和微囊递送系统。也可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、聚乳酸及其组合，以制备包含本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白的控释或延时组合物。

包含本文所述的EGFR/PD-L1 FTI-Ig结合蛋白的药物组合物可以进一步包含一种或多种其他治疗活性化合物(治疗剂)。可掺入本发明的药物组合物中的此类其他治疗剂的示例包括但不限于与本文所述的EGFR/PD-L1 FTI-Ig结合蛋白不同的抗癌剂(例如，含细胞毒性金属的抗癌化合物或基于细胞毒性放射性同位素的抗癌化合物及其组合)、抗生素、抗病毒化合物、镇静剂、兴奋剂、局部麻醉剂、抗炎类固醇(例如天然或合成的抗炎类固醇及其组合)、镇痛剂(例如乙酰水杨酸、对乙酰氨基酚、萘普生、布洛芬、COX-2抑制剂、吗啡、羟考酮及其组合)、抗组胺剂、非甾体抗炎药(“NSAID”，例如，乙酰水杨酸、布洛芬、萘普生、COX-2抑制剂及其组合)，及其组合。

配制根据本发明的药物组合物以通过本领域已知的多种途径中的任一种来施用。此类途径包括但不限于肠胃外、静脉内(全身)、皮下、肌内、口服(即，胃肠)、舌下、颊、鼻内(例如吸入)、透皮(例如局部)、肿瘤内、经粘膜、关节内、支气管内、囊内、软骨内、腔内、颈管内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸腔内、子宫内、膀胱内、阴道和直肠。

优选地，根据本发明的药物组合物被配制用于静脉内施用于患有癌症的人受试者。静脉内施用包含EGFR/PD-L1 FTI-Ig结合蛋白的药物组合物可在整个循环系统中提供EGFR/PD-L1 FTI-Ig结合蛋白，从而通过循环的血液达到组织和器官。通常，用于静脉内施用的组合物是在无菌、等渗、水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂，例如利多卡因，以减轻注射部位的疼痛。

本发明药物组合物的皮下施用是可以将EGFR/PD-L1 FTI-Ig结合蛋白提供给淋巴系统的途径。因此，可以配制包含本发明的EGFR/PD-L1 FTI-Ig结合蛋白的药物组合物，用于皮下施用。

本发明的药物组合物可以配制用于通过注射(例如通过快速浓注或持续输注)的肠胃外施用。用于注射的制剂可以以单位剂型(例如，在安瓿中或在多剂量容器中)与添加的防腐剂一起存在。组合物可以采取在油性或水性载剂中的悬浮液或溶液或乳液的形式，并且可以包含配制试剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分(即，本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白)可以是粉末形式(例如，冻干形式)，在使用前，用合适的载剂(例如无菌、无热原水)重构。

可以将本发明的药物组合物配制成长效制剂类型的储库制剂，用于递送。此类长效制剂可以通过植入(例如，皮下或肌内)或通过肌内注射来施用。因此，例如，药物组合物可以用合适的聚合或疏水物质(例如，作为在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂配制，或作为难溶的衍生物(例如，作为难溶的盐)配制。

在另一个实施方案中，本文所述的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白可以是结晶的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白，其保留了非结晶的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白对EGFR和PD-L1的结合活性。当施用于个体时，这种结晶的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白还可提供EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白的无载体控释。与非结晶形式相比，当施用于个体时，本发明的结晶的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白还可以表现出更大的体内半衰期。本发明的结晶的结合蛋白可以根据本领域已知的方法生产，如国际公开号WO 02/072636(Shenoy等人)中所公开的，其通过引用并入本文。

一种用于释放结晶的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白的药物组合物，其中该组合物包含本文所述的结晶的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白、赋形剂成分和至少一种聚合物载体。优选地，赋形剂成分选自：白蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇、明胶、羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。优选地，聚合物载体是选自以下的一种或多种的聚合物：聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(氨基酸)、聚(酸酐)、聚(缩肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-乙醇酸共聚物)或PLGA、聚(β-羟基丁酸酯)、聚(己内酯)、聚(二恶烷酮)；聚乙二醇、聚(羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚[(有机)磷腈]、聚(原酸酯)、聚乙烯醇、聚(乙烯基吡咯烷酮)、马来酸酐/烷基乙烯基醚共聚物、普朗尼克多元醇、白蛋白、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原蛋白、纤维蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖、硫酸化多糖、其掺合物及其共聚物。

EGFR/PD-1FIT-Ig结合蛋白与EGFR和PD-L1结合的能力主要在提供抗癌疗法中受到关注。推测EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白与EGFR和PD-L1的结合会抑制或阻断EGFR和PD-L1与其各自的配体(例如EGFR和PD-1)结合，进而抑制或阻断各自独立的信号传导通路(即EGFR/EGF信号传导和PD-L1/PD-1信号传导)，这些信号传导通路参与癌变、癌细胞生长和癌细胞扩散(转移)。本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白优选能够在体外和体内阻断人EGFR或人PD-L1信号传导活性。因此，本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白可用于抑制或阻断人受试者中或推测具有EGFR和PD-L1的其他哺乳动物受试者中(本发明的EGFR/PD-L1FIT-Ig结合蛋白与其交叉反应)的人EGFR和/或人PD-L1信号传导。

抑制或阻断细胞中EGFR信号传导的方法包括使表达EGFR的细胞与本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白接触。

抑制或阻断细胞中PD-L1信号传导的方法包括使表达PD-L1的细胞与EGFR/PD-L1FIT-Ig结合接触。

抑制或阻断EGFR信号传导和PD-L1信号传导的方法包括使包含表达EGFR的细胞和表达PD-L1的细胞的细胞群与本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白接触。

在上述方法中，有用的FIT-Ig结合蛋白是EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白，其包含包含根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第一(重)多肽链；包含根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列的第二(第一轻)多肽链；以及包含根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第三(第二轻)多肽链。

本发明还提供了一种在需要治疗的人受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向该受试者施用EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白或包含该EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白的药物组合物，其中EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白包含包含根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第一(重)多肽链；包含根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列的第二(第一轻)多肽链；以及包含根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第三(第二轻)多肽链。

在根据本发明的治疗人受试者中癌症的方法中，所述癌症可以是上皮癌。

在另一个实施方案中，在本发明的方法中治疗的癌症选自：黑色素瘤(例如，转移性恶性黑色素瘤)、肾癌(例如，透明细胞癌)、前列腺癌(例如，激素难治性前列腺腺癌)、胰腺腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、食道癌、头颈部鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、子宫颈癌、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、白血病、淋巴瘤和其他肿瘤性恶性肿瘤。

在一个实施方案中，本发明提供了一种恢复活化的T细胞的活性(逆转抑制)的方法，该方法包括使表达人PD-L1的细胞与本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白接触，使得PD-L1/PD-1启动的T细胞抑制被抑制。在另一个实施方案中，本发明提供了抑制由EGFR/EGF结合诱导的癌变的方法，其包括使表达人EGFR的细胞与本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白接触，使得EGFR/EGF介导的信号传导被抑制或阻断。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗患有其中EGFR和/或PD-L1活性是有害的疾病的人受试者的方法，该方法包括向受试者施用本发明的EGFR/PD-L1结合蛋白，使得降低受试者中由PD-L1/PD1结合和/或EGFR/EGF结合介导的活性。

在上述方法中，有用的FIT-Ig结合蛋白是EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白，其包含包含根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第一(重)多肽链；包含根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列的第二(第一轻)多肽链；以及包含根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第三(第二轻)多肽链。

如本文所用，术语“其中EGFR和/或PD-L1活性是有害的疾病”旨在包括这样的疾病，其中在患有疾患的受试者中EGFR与其配体(EGR)的相互作用或PD-L1与配体(PD-1)的相互作用，是该疾病病理生理学的原因或是导致该疾病恶化的因素。因此，其中EGFR和/或PD-L1活性是有害的疾病是预期抑制EGFR和/或PD-L1活性以减轻疾病的症状和/或进展的疾病。

考虑到本发明的EGFR/PD-L1-FIT-Ig结合蛋白与人EGFR和PD-L1结合，因而EGFR/PD-L1结合蛋白也可以用于例如在生物样品中检测EGFR或PD-L1，或两者，所述生物样品包含表达那些靶蛋白中的一种或两种的细胞。例如，本发明的EGFR/PD-L1结合蛋白可用于常规免疫测定法中，例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)或组织的免疫组织化学。本发明提供了用于检测生物样品中的EGFR或PD-L1的方法，该方法包括使生物样品与本发明的EGFR/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白接触，和检测是否发生与靶抗原(EGFR或PD-L1)的结合，从而检测生物样品中是否存在靶标。可以用可检测物质直接或间接标记结合蛋白，以促进结合或未结合的抗体/片段/结合蛋白的检测。适当的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质和放射性物质。适当的酶的示例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适当的辅基复合物的示例包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适当的荧光物质的示例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的示例包括鲁米诺；适当的放射性物质的示例包括

现在已经详细描述了本发明，通过参考以下实施例将更清楚地理解本发明，这些实施例仅出于说明的目的而被包括，并且不旨在限制本发明。

实施例1：结合EGFR和PD-L1的FIT-Ig结合蛋白的产生。

使用来自抗PD-L1和抗EGFR亲本抗体的结合位点构建六个识别人EGFR和人PD-L1的双特异性Fabs-in-Tandem免疫球蛋白(FIT-Ig)结合蛋白。

先前已描述了抗PD-L1单克隆抗体(mAb)1B12、10A5和3G10。参见，例如，美国专利号7,943,743 B2。

先前已经描述了使用抗EGFR mAb帕尼单抗的特定氨基酸序列来制备FIT-Ig结合蛋白。参见，例如，国际公开号WO 2017/136820 A2。

实施例1.1：FIT-Ig1。

利用来自亲本抗体mAb 1B12和帕尼单抗的免疫球蛋白结构域的编码序列，构建了命名为“FIT-Ig1”的PD-L1/EGFR FIT-Ig(也称为“PD-L1/EGFR FIT-Ig1”)。FIT-Ig1是由三组分多肽链组成的六聚体：

多肽链#1具有结构域式：VL

多肽链#2具有结构域式：VH

多肽链#3具有结构域式：VL

下表1中显示了三个表达的FIT-Ig1多肽链的氨基酸序列，包括N末端信号序列：

表1 FIT-Ig1组分多肽链的氨基酸序列

实施例1.2：FIT-Ig2

利用来自亲本抗体帕尼单抗和mAb 1B12的免疫球蛋白结构域的编码序列，构建命名为“FIT-Ig2”的EGFR/PD-L1 FIT-Ig(也称为“EGFR/PD-L1 FIT-Ig2”)。FIT-Ig2是由三组分多肽链组成的六聚体：

多肽链#1具有结构域式：VL

多肽链#2具有结构域式：VH

多肽链#3具有结构域式：VL

下表2中显示了三个表达的FIT-Ig2多肽链的氨基酸序列，包括N末端信号序列：

表2 FIT-Ig2组分多肽链的氨基酸序列

实施例1.3：FIT-Ig3

利用来自亲本抗体10A5和帕尼单抗的免疫球蛋白结构域的编码序列，构建了命名为“FIT-Ig3”的PD-L1/EGFR FIT-Ig(也称为“PD-L1/EGFR FIT-Ig3”)。FIT-Ig3是由三组分多肽链组成的六聚体：

多肽链#1具有结构域式：VL

多肽链#2具有结构域式：VH

多肽链#3具有结构域式：VL

下表3中显示了三个表达的FIT-Ig3多肽链的氨基酸序列，包括N末端信号序列：

表3 FIT-Ig3组分多肽链的氨基酸序列

实施例1.4：FIT-Ig4

利用来自亲本抗体帕尼单抗和mAb 10A5的免疫球蛋白结构域的编码序列，构建命名为“FIT-Ig4”的EGFR/PD-L1 FIT-Ig(也称为“EGFR/PD-L1 FIT-Ig4”)。FIT-Ig4是由三组分多肽链组成的六聚体：

多肽链#1具有结构域式：VL

多肽链#2具有结构域式：VH

多肽链#3具有结构域式：VL

下表4中显示了三个表达的FIT-Ig4多肽链的氨基酸序列，包括N末端信号序列：

表4 FIT-Ig4组分多肽链的氨基酸序列

实施例1.5：FIT-Ig5

利用来自亲本抗体mAb 3G10和帕尼单抗的免疫球蛋白结构域的编码序列，构建了命名为“FIT-Ig5”的PD-L1/EGFR FIT-Ig(也称为“PD-L1/EGFR FIT-Ig5”)。FIT-Ig5是由三组分多肽链组成的六聚体：

多肽链#1具有结构域式：VL

多肽链#2具有结构域式：VH

多肽链#3具有结构域式：VLpani-CL。

下表5中显示了三个表达的FIT-Ig5多肽链的氨基酸序列，包括N末端信号序列：

表5 FIT-Ig5组分多肽链的氨基酸序列

实施例1.6：FIT-Ig6

利用来自亲本抗体帕尼单抗和mAb 3G10的免疫球蛋白结构域的编码序列，构建命名为“FIT-Ig6”的EGFR/PD-L1 FIT-Ig(也称为“EGFR/PD-L1 FIT-Ig6”)。FIT-Ig6是由三组分多肽链组成的六聚体：

多肽链#1具有结构域式：VL

多肽链#2具有结构域式：VH

多肽链#3具有结构域式：VL

下表6中显示了三个表达的FIT-Ig6多肽链的氨基酸序列，包括N末端信号序列：

表6 FIT-Ig6组分多肽链的氨基酸序列

实施例1.7：FIT-Ig结合蛋白的表达

六个FIT-Ig构建体FIT-Ig1、FIT-Ig2、FIT-Ig3、FIT-Ig4、FIT-Ig5、FIT-Ig6是一类双特异性多价结合蛋白，其已知为无接头的Fabs-in-Tandem免疫球蛋白(或无接头的FIT-Ig)，在WO 2015/103072和WO 2017/136820中一般性地描述了。通过在用全部三条链的表达载体转染的哺乳动物宿主细胞中共表达三条组分多肽链来产生结合蛋白。结合蛋白的设计要求第一多肽链(或“重链”)与第二多肽链(或“第一轻链”)和第三多肽链(或“第二轻链”)配对，以形成功能性串联的Fab部分，并且重链也设计成通过Fc区(铰链-CH2-CH3)二聚化，从而形成了显示四个完整Fab结合位点的六链结合蛋白。没有使用合成的氨基酸接头肽来连接免疫球蛋白结构域，因此命名为“无接头FIT-Igs”；发现这种结合蛋白在宿主细胞中表达良好，类似于重组产生的单克隆抗体，并且不存在接头防止了可能的免疫原性位点的引入，这可能导致具有接头的FIT-Ig更快地清除。还发现无接头的FIT-Ig表现出与亲本抗体相当的对其靶抗原的结合特性，其中基于VH-CH1和VL-CL，出乎意料地避免了在先前工程化的具有串联排列的抗原结合位点的抗体中发现的“内部”和“外部”结合位点之间的空间位阻。然而，如本文所示，尽管使用无接头FIT-Ig模型以待有效用于评估治疗性抗癌药物所需的常规临床前和临床测定法中，但之前的结合PD-L1和EGFR的FIT-Ig蛋白构建体(例如FIT-Ig 1-5)表现出异常低水平的表达和/或不期望的高百分比聚集体。

在结合蛋白FIT-Ig1、FIT-Ig3和Fit-Ig5中，N末端或“外部”Fab结合位点结合PD-1，而相邻的“内部”Fab结合位点结合EGFR。(抗PD-L1 mAb 1B12、10A5或3G10)的外部Fab片段仅通过重链如下与(抗EGFR帕尼单抗的)内部Fab片段连接，即通过(抗PD-L1 mAb 1B12、10A5或3G10)的VL-CL在其C末端与(抗EGFR帕尼单抗)的VH-CH1的N末端直接融合，而无需使用连接免疫球蛋白结构域的接头。

在结合蛋白FIT-Ig2、FIT-Ig4和Fit-Ig6中，N末端或“外部”Fab结合位点结合EGFR，而相邻的“内部”Fab结合位点结合PD-L1。(抗EGFR帕尼单抗)的外部Fab片段仅通过重链如下与(抗PD-L1 mAb 1B12、10A5或3G10的)内部Fab片段连接，即通过(抗EGFR帕尼单抗)的VL-CL在其C末端与(抗PD-L1mAbs 1B12、10A5或3G10)的VH-CH1的N末端直接融合，而无需使用连接免疫球蛋白结构域的接头。

使用转染的人胚胎肾293E(HEK293)细胞瞬时表达每种FIT-Ig。HEK293E细胞系是表达EBNA-1的HEK293的衍生物，可提供增高水平的载体编码的重组蛋白的表达。

表达载体允许表达任何FIT-Ig结合蛋白的三条多肽链中的每条，其中第一(重)多肽链具有以下结构式：VL

如图1中所示，为了表达FIT-Ig结合蛋白的第一多肽链(“重链”)，合成了编码第一多肽链的VL

还如图1所示，为了表达FIT-Ig结合蛋白的第二多肽链(“轻链#1)，合成编码抗体VH

如图1所示，为了表达FIT-Ig结合蛋白的第三多肽链(轻链#3)，合成编码抗体VH

通过DNA测序确认所得表达载体的序列。

使用重链：轻链#1∶轻链#2为1∶3∶3的摩尔比，将得到的编码每个FIT-Ig的三条组分多肽链的表达载体转染到HEK293E细胞中。这样设计的目的是相对于重链，成比例地表达更多的轻链#1和#2，这反过来将降低重链上未与相应的轻链配对、从而将导致无法形成功能性Fab片段的VL-CL和VH-CH1片段的出现。参见WO 2015/103072。使用聚乙烯亚胺(PEI)作为转染剂，用表达载体转染HEK293E细胞。在此转染方案中，将FreeStyle

FIT-Ig蛋白表达产物通过蛋白A色谱法纯化。然后通过尺寸排阻色谱法(SEC)分析纯化的FIT-Ig的组成和纯度。将包含纯化的FIT-Ig的PBS施加到TSKgel SuperSW3000，300×4.6mm柱(TOSOH)上。HPLC仪器，U3000型(DIONEX)用于SEC，在280nm和214nm处使用UV检测。除六多肽链FIT-Ig6单体(分子量为240,000道尔顿)以外，SEC检测到的物质，包括较大(较高分子量)的聚集体和较小物质(包括FIT-Ig6单体的片段)为杂质。

图2-7分别显示了FIT-Ig1至FIT-Ig6的SEC洗脱图。

图2中显示的FIT-Ig1的SEC洗脱图揭示了蛋白聚集体的多个重叠峰。图太复杂，无法对单个峰的物质进行详细分析。

图3中显示的FIT-Ig2的SEC洗脱图表明，在六多肽FIT-Ig2单体的预期位置上有一个主峰，之前是蛋白聚集体的至少两个其他峰。

图4中显示的FIT-Ig3的SEC洗脱图表明蛋白聚集体的多个重叠峰。图太复杂，无法对单个峰的物质进行详细分析。

图5中显示的FIT-Ig4的SEC洗脱图表明，六肽FIT-Ig4单体的预期位置处有一个主峰，之前是蛋白聚集体的次要峰，之后是未知物质的另一个次要峰(可能是降解的产品)。

图6中显示的FIT-Ig5的SEC洗脱图表明，六肽FIT-Ig5单体的预期位置处有一个主峰，之前是蛋白聚集体的次要峰，其显著小于之前的图2-5中发现的任何聚集体的次要峰。

图7中显示的FIT-Ig6的SEC洗脱图表明，在六多肽FIT-Ig6单体的预期位置上有一个主峰，之前是蛋白聚集体区域的几乎检测不到的峰。在使用蛋白A亲和色谱法一步纯化后，明显地获得了为基本上完全均质产物的FIT-Ig6结合蛋白，而没有显著的聚集体形成。估计聚集体的百分比小于或等于0.1％(≤0.1％)。FIT-Ig6明显超过所有其他FIT-Ig，没有显著的聚集体百分比。

FIT-Ig 1-6的表达和SEC数据显示在下表7中。

表7：FIT-Ig结合蛋白的表达和SEC分析

以上数据表明：

·FIT-Ig 1、2和3在转染的HEK293细胞培养物中表现出异常高的聚集体百分比和不可接受的低水平表达，因此不能提供作为治疗药物的用于进一步临床前评估所需的蛋白质量(无聚集体或不显著的、低百分比的聚集体)和数量。

·FIT-Ig4的聚集体百分比低于FIT-Ig 1、2和3，但对于药物开发而言，该水平并非不显著。此外，FIT-Ig4表现出不可接受的低水平表达。因此，FIT-Ig4也无法提供作为治疗药物的进一步临床前评估所需的蛋白数量和质量。

·FIT-Ig5的聚集体和表达水平几乎可以接受，但是，表达水平低于10mg/ml时，预示着需要努力分离稳定转染的CHO细胞系，以获得临床前和临床评估所需的量，这种努力将不会成功，或者不具有成本效益。

·FIT-Ig6令人惊讶地在转染的HEK293细胞培养物中表现出高水平的表达，并且没有显著量的聚集体形成(≤0.1％)。因此，在聚集体形成方面，在使用蛋白A亲和色谱法一步纯化后，FIT-Ig6比FIT-Ig5更稳定，并且聚集体百分比至少低10倍。FIT-Ig6在哺乳动物细胞培养物中的表达水平和异常低的聚集体水平，使该结合蛋白有资格用于作为抗癌治疗药物的临床前和临床评估的候选物。

·FIT-Ig6的特殊特性是由于：

1.使用抗PD-L1 mAb 3G10作为VH和VL结构域的来源，这些结构域在FIT-Ig6的每个PD-L1特异性Fab结合单元中形成PD-L1特异性抗原结合位点，

2.使用帕尼单抗抗EGFR mAb作为VH和VL结构域的来源，这些结构域在FIT-Ig6的每个EGFR特异性Fab结合单元中形成EGFR特异性抗原结合位点，

3.将EGFR特异性Fab结合单元定位为FIT-Ig6的外部Fab结合单元，和

4.将PD-L1特异性Fab结合单元定位为FIT-Ig6的内部Fab结合单元。

实施例2：FIT-Ig5和FIT-Ig6的结合亲和力。

通过生物层干涉法测定亲本抗EGFR帕尼单抗、亲本抗PD-L1 mAb 3G10、FIT-Ig5和FIT-Ig6的结合亲和力。简而言之，通过

表8亲本mAb和FIT-Ig对PD-L1和EGFR的结合亲和力

结果表明，FIT-Ig5和FIT-Ig6对EGFR和PD-L1靶抗原的结合亲和力分别与亲本帕尼单抗和亲本mAb 3G10的结合亲和力相似。特别是，FIT-Ig6对EGFR的K

因此，这些数据表明FIT-Ig6结合蛋白保留了亲本mAb的结合亲和力。此外，FIT-Ig6结合蛋白的结合亲和力对于继续进行FIT-Ig6作为抗癌药物的临床前和临床评估是可以接受的。

实施例3.FIT-Ig6在雄性Sprague-Dawley大鼠中的药代动力学研究。

在雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠中评估了FIT-Ig6的药代动力学特性。以5mg/kg的单次静脉内剂量向雄性SD大鼠施用FIT-Ig蛋白。在28天期间的不同时间点收集血清样本，其中在0分钟、5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时、2天、4天、7天、10天、14天、21天和28天通过尾静脉连续采血取样，并通过常规ELISA分析。简而言之，用125ng/孔的山羊抗人IgG Fc抗体(Rockland,目录号：609-101-017)在4℃下过夜包被ELISA板，用1X PBS/1％BSA/0.05％Tween-20/0.05％ProClin

图8显示了三只SD大鼠中FIT-Ig6的血清浓度与时间的图。

对图8显示的其中两只动物(大鼠#1和大鼠#3)的结果分析产生了下表9中所示的PK参数。(由于与前两个数据点相关的未解决问题(这两个数据点被软件排除了，尽管其余时间点在通常范围内)，无法与大鼠#1和大鼠#3一起分析大鼠#2的完整数据集)。

表9雄性Sprague-Dawley大鼠中FIT-Ig6的PK参数

CL(总清除率隙)、Vss(稳态分布体积)、V1(初始体积分布)、αt

以上PK数据表明FIT-Ig6在SD大鼠中稳定，并且具有与常规mAb相似的PK参数。

重要的是，FIT-Ig6相对长的消除半衰期(βt

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