一种多糖SPS-F2、多糖SPS-F3及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种多糖SPS‑F2由鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖连接而成，且其中，按照摩尔百分比，鼠李糖的含量高于半乳糖醛酸，鼠李糖的含量≥30%，鼠李糖的分支度为30%~40%。本发明还公开了一种多糖SPS‑F3，由鼠李糖、半乳糖和阿拉伯糖连接而成，且其中鼠李糖的含量≥35%，鼠李糖的分支度为20%~25%。多糖SPS‑F2和多糖SPS‑F3，均体现了较强的与成纤维细胞生长因子FGF2的结合能力，为开发基于成纤维细胞生长因子FGF2功能调节相关的食品和药物提供了开发方向。

说明书

技术领域

本发明属于多糖的开发和制备领域，具体涉及一种多糖SPS-F2、多糖SPS-F3及其制备方法和应用，尤其涉及一种多糖SPS-F2、多糖SPS-F3，以及从南瓜中提取多糖SPS-F2、多糖SPS-F3的方法，和所述多糖SPS-F2、多糖SPS-F3的应用。

背景技术

生长因子（GFs）在细胞的生存、增殖、分化等过程中起着关键作用，成纤维细胞生长因子（FGFs）是1973年在脑垂体和下丘脑的提取物中发现的能够促进纤维细胞增殖的一种活性物质，其能够参与机体内组织和器官的生长发育，通过内分泌、旁分泌的方式调控一些病理生理过程，如内分泌调控、胚胎发育和创伤修复等。FGF2是FGFs家族中的旁分泌亚家族的重要成员，在体内分布广泛，具有促进细胞分裂增殖的生物学活性，是一种多功能、作用广泛的细胞因子，在受损、缺血或动脉粥样硬化时可促进血管内皮细胞的增殖。肝素（HP）和硫酸乙酰肝素（HS）等动物多糖可以结合并调节FGFs。HP和HS等动物多糖通过选择性与FGFs结合形成复合体，调控生长因子FGFs浓度及其信号传递，不仅能提高热稳定性和对蛋白酶解的抵抗性，也能起到富集和释放FGFs等作用。

但HP和HS属于动物多糖，主要来源于家畜肠道粘膜，受到污染的风险较高，进入血液可刺激组织细胞释放组胺。2008年初，80多名患者死于受多硫酸软骨素污染的肝素之后，对更为纯净和安全的替代品的需求日益增加。因此肝素的安全问题是其使用的重要障碍，如何获得安全性较好且能够与FGF结合的药物，是本领域需要解决的技术问题。而植物源通常认为是具有安全性的食物来源。

因此，本领域需要开发一种多糖，其能够模拟HS，通过与FGF2结合发挥功能调节作用，但同时具有植物源的原料。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明目的之一是提供一种多糖SPS-F2，所述多糖SPS-F2由鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖连接而成，且其中，按照摩尔百分比，鼠李糖的含量高于半乳糖醛酸，鼠李糖的含量≥30%，鼠李糖的分支度为30%~40%；

所述多糖SPS-F2在二维核磁异核多键相关谱中具有α-(1-2)-鼠李糖和α-(1-4)-半乳糖醛酸交替连接的信号峰，以及鼠李聚糖α-(1-2)-糖苷键的信号峰，半乳聚糖β-(1-4)-糖苷键的信号峰，阿拉伯聚糖α-(1-5)-糖苷键的信号峰，所述半乳聚糖和阿拉伯聚糖通过分支鼠李糖链接到交替连接的α-(1-2)-鼠李糖和α-(1-4)-半乳糖醛酸的主链上。

本发明的目的之二是提供一种多糖SPS-F3，所述多糖SPS-F3由鼠李糖、半乳糖和阿拉伯糖连接而成，且其中鼠李糖的含量≥35%，鼠李糖的分支度为20%~25%；

所述多糖SPS-F3在二维核磁异核多键相关谱中具有鼠李糖之间α-(1-2)-糖苷键的信号峰，以及半乳聚糖β-(1-4)-糖苷键的信号峰，阿拉伯聚糖α-(1-5)-糖苷键的信号峰，所述半乳聚糖和阿拉伯聚糖通过分支鼠李糖链接到鼠李聚糖的主链上。

本发明提供了两种有别于现有多糖的多糖结构（多糖SPS-F2和/或多糖SPS-F3），其表现出了较强的与成纤维细胞生长因子FGF2的结合强度。换言之，本发明提供的两种多糖结构（多糖SPS-F2和/或多糖SPS-F3）能够与成纤维细胞生长因子FGF2结合并调节FGF信号通路，在细胞周围或者临近的细胞外基质发挥生理作用。同时本发明提供的两种有别于现有多糖的多糖结构（多糖SPS-F2和/或多糖SPS-F3）来源于植物，安全性高，更有利于制备食用的产品或药物。

需要说明的是，本发明分离出的多糖SPS-F2由鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖连接而成，且在二维核磁异核多键相关谱中具有α-(1-2)-鼠李糖和α-(1-4)-半乳糖醛酸交替连接的信号峰，以及鼠李聚糖α-(1-2)-糖苷键的信号峰，半乳聚糖β-(1-4)-糖苷键的信号峰，阿拉伯聚糖α-(1-5)-糖苷键的信号峰。基于上述单糖组成和二维核磁异核多键相关谱信号，鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖的连接方式可以进行如下推断：

①具有α-(1-2)-鼠李糖和α-(1-4)-半乳糖醛酸的交替连接；

②具有α-(1-2)-糖苷键连接的鼠李聚糖；

③具有β-(1-4)-糖苷键连接的半乳聚糖；

④具有α-(1-5)-糖苷键连接的阿拉伯聚糖。

作为示例性的，本发明提供的多糖SPS-F2具有交替连接的α-(1-2)-鼠李糖和α-(1-4)-半乳糖醛酸主链，且支链上连接有α-(1-2)-糖苷键连接的鼠李聚糖、β-(1-4)-糖苷键连接的半乳聚糖和α-(1-5)-糖苷键连接的阿拉伯聚糖，且所有支链连接在主链的分支鼠李糖上；或者，本发明提供的多糖SPS-F2具有交替连接的α-(1-2)-鼠李糖和α-(1-4)-半乳糖醛酸主链，且主链上嵌段有α-(1-2)-糖苷键连接的鼠李聚糖，此外，支链上连接有β-(1-4)-糖苷键连接的半乳聚糖和α-(1-5)-糖苷键连接的阿拉伯聚糖，且所有支链连接在主链的分支鼠李糖上。当然，本发明提供的多糖SPS-F2还可以存在除上述推断结构以外的满足多糖SPS-F2的信号要求的结构。

另一方面，需要说明的是，本发明分离出的的多糖SPS-F3具有α-(1-2)-糖苷键连接的鼠李聚糖主链，且支链上有β-(1-4)-糖苷键连接的半乳聚糖和α-(1-5)-糖苷键连接的阿拉伯聚糖。基于上述单糖组成和二维核磁异核多键相关谱信号，鼠李糖、半乳糖和阿拉伯糖的连接方式可以进行如下推断：

①具有α-(1-2)-鼠李糖的连接；

②具有β-(1-4)-糖苷键连接的半乳聚糖；

③具有α-(1-5)-糖苷键连接的阿拉伯聚糖。

作为示例性的，本发明提供的多糖SPS-F3具有α-(1-2)-糖苷键连接的鼠李聚糖主链，且支链上连接有β-(1-4)-糖苷键连接的半乳聚糖和α-(1-5)-糖苷键连接的阿拉伯聚糖。

优选地，在所述的多糖SPS-F2中，鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖的摩尔比为(30~35):(10~13):(23~28):(16~20)，优选33.9:12.2:26.8:18.9。典型但非限制性地，在所述的多糖SPS-F2中，鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖的摩尔比可以为31:12:24:19、30:10:23:16、35:10:23:20、35:13:28:16等。

优选地，所述多糖SPS-F2的分子量为18~22kDa。典型但非限制性地，所述多糖SPS-F2的分子量为19kDa、20kDa、21kDa等。

优选地，所述多糖SPS-F2能够与成纤维细胞生长因子FGF2结合。

优选地，在所述多糖SPS-F3中，鼠李糖、半乳糖和阿拉伯糖的摩尔比为(36~41) :(33~39) : (15~18)，优选39.0:36.6:16.6。典型但非限制性地，在所述多糖SPS-F3中，鼠李糖、半乳糖和阿拉伯糖的摩尔比为36:35:15、38:34:18

优选地，所述多糖SPS-F2的分子量为250~280kDa。典型但非限制性地，所述多糖SPS-F3的分子量为255kDa、260kDa、265kDa、270kDa、275kDa等。

优选地，所述多糖SPS-F3能够与成纤维细胞生长因子FGF2结合。

本发明目的之三是提供一种南瓜多糖，所述南瓜多糖包括目的之一所述的多糖SPS-F2和/或目的之二所述的多糖SPS-F3。

本发明目的之四是提供一种南瓜多糖的制备方法，所述方法包括如下步骤：

（1）用耐高温α-淀粉酶在90℃温度下，对南瓜进行酶解，离心并浓缩后，去除上清液的蛋白，得到提取物；

（2）将所述提取物与乙醇搅拌混合后，离心收集多糖沉淀，然后将多糖沉淀复溶于去离子水中，去除小分子杂质后，经过浓缩和冻干，得到南瓜多糖粗品；

（3）将所述南瓜多糖粗品溶于水中后，经过离子交换柱吸附后，洗脱、离心、冻干得到如目的之三所述的南瓜多糖；

（4）将所述南瓜多糖进行纯化，收集18~22kDa的多糖为目的之一所述的多糖SPS-F2，收集250~280kDa的多糖为目的之二所述的多糖SPS-F3；

优选地，所述南瓜包括蜜本南瓜。

优选地，所述酶解时间为2~4小时（例如2.5h、3h、3.5h等）。

作为可选，步骤（1）所述酶解过程中，耐高温α-淀粉酶的添加量为每100g南瓜添加13mg~19mg耐高温α-淀粉酶，例如每100g南瓜添加耐高温α-淀粉酶的质量为14mg、15mg、16mg、17mg、18mg等。

作为可选，步骤（1）所述酶解过程中，南瓜加入至去离子水中分散，所述南瓜与去离子水的添加比例为1:2~1:4（w/w）。

需要说明的是，本发明提供的南瓜多糖的制备方法并不是目的之一、目的之二或目的之三所述的多糖的唯一的制备方法，本领域技术人员可以根据任何现有的或者新的技术去制备目的之一、目的之二或目的之三所述的多糖。

本发明目的之五是提供一种多糖的用途，所述多糖包括目的之一所述的多糖SPS-F2、目的之二所述的多糖SPS-F3或目的之三所述的南瓜多糖中的任意一种；

所述多糖用于制作缓解二型糖尿病的药物或功能性食品；

所述多糖用于制作改善肥胖的药物或功能性食品；

所述多糖用于制作治疗心脑血管疾病和纤维化的药物或功能性食品。

不良的饮食和生活习惯导致以2型糖尿病（T2DM）、肥胖和心脑血管疾病和纤维化为代表的代谢性疾病在全球范围内发病率升高，严重影响患病人群的生活质量。除了药物治疗，饮食是干预代谢性疾病的一种重要手段。本发明提供的目的之一所述的多糖SPS-F2、目的之二所述的多糖SPS-F3或目的之三所述的南瓜多糖具有血糖和血脂的调节作用。因此，本发明提供的目的之一所述的多糖SPS-F2、目的之二所述的多糖SPS-F3或目的之三所述的南瓜多糖可用于制作缓解二型糖尿病的药物、改善肥胖的药物或治疗心脑血管疾病和纤维化的药物。

本发明目的之六是提供一种可食用产品组合物，所述可食用产品包括目的之一所述的多糖SPS-F2、目的之二所述的多糖SPS-F3或目的之三所述的南瓜多糖中的任意一种。

本发明目的之七是提供一种药物组合物，所述药物组合物包括目的之一所述的多糖SPS-F2、目的之二所述的多糖SPS-F3或目的之三所述的南瓜多糖中的任意一种。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

（1）本发明提供的多糖SPS-F2，体现了较强的与成纤维细胞生长因子FGF2的结合能力，为开发基于成纤维细胞生长因子FGF2功能调节相关的食品和药物提供了开发方向；

（2）本发明提供的多糖SPS-F3，体现了较强的与成纤维细胞生长因子FGF2的结合能力，为开发基于成纤维细胞生长因子FGF2功能调节相关的食品和药物提供了开发方向。

（3）本发明提供的多糖SPS-F2和多糖SPS-F3不仅表现出了与成纤维细胞生长因子FGF2的结合能力，同时还表现出了与半乳凝集素GAL-3蛋白的结合能力，为开发基于半乳凝集素GAL-3蛋白功能调节相关，或同时基于成纤维细胞生长因子FGF2和半乳凝集素GAL-3蛋白功能调节相关的食品和药物提供了开发方向。

附图说明

图1为制备例1制备得到的南瓜多糖的HPGPC图；

图2为多糖SPS-F2和多糖SPS-F3与FGF2的结合信号图；

图3为梯度浓度的多糖SPS-F2-1与FGF2的结合信号及Langumair模型拟合曲线图；由上到下依次为浓度为2.5mg/mL、1.3mg/mL、0.6mg/mL、0.3mg/mL和0.2mg/mL的多糖SPS-F2-1的响应曲线；

图4为梯度浓度的多糖SPS-F3-1与FGF2的结合信号及Langumair模型拟合曲线图；由上到下依次为浓度为2.5mg/mL、1.3mg/mL、0.6mg/mL、0.3mg/mL和0.2mg/mL的多糖SPS-F3-1的响应曲线；

图5为多糖SPS-F2和多糖SPS-F3与Gal-3的结合信号图；

图6为梯度浓度的多糖SPS-F2-1与Gal-3的结合信号及Langumair模型拟合曲线图；由上到下依次为浓度为10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1.3mg/mL和0.6mg/mL的多糖SPS-F2-1的响应曲线；

图7为梯度浓度的多糖SPS-F3-1与Gal-3的结合信号及Langumair模型拟合曲线图；由上到下依次为浓度为10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1.3mg/mL和0.6mg/mL的多糖SPS-F3-1的响应曲线；。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

制备例1

一种南瓜多糖的制备方法，包括如下步骤：

（1）将100 g清洗去皮的蜜本南瓜的果肉按照1:3（w/w）的比例加入去离子水中，并搅拌破碎，加入15mg的耐高温

（2）将提取物按1:3（v/v）的比例与95%乙醇缓慢混合，磁力搅拌30min，于4℃下保存12h，然后在8000 rpm/min下离心20min，收集多糖沉淀；然后将多糖沉淀复溶于去离子水中，通过截留分子量为3000Da的超滤膜进行透析去除小分子杂质；最后对截留物进行浓缩和冻干，得到南瓜多糖粗品（SPS粗品）。SPS粗品的提取率（干重）约为4.6%；

（3）将100mg提取的SPS粗品溶于15mL蒸馏水中，通过DEAE-Sepharose Fast FLow凝胶柱（2.5×12cm），依次用0mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L和0.5mol/L的NaCl溶液（3BV）进洗脱，收集0.3mol/L NaCl洗脱的洗脱液，然后在得到的洗脱液中添加乙醇至浓度为50%，搅拌混匀后于4 ̊C存放12h得到多糖沉淀，10000rpm/min离心20min收集沉淀，然后在截留分子量1000Da透析后冻干，得到南瓜多糖（包括多糖SPS-F2和多糖SPS-F3的混合物）；

（4）将步骤（3）的南瓜多糖继续使用半制备型高效凝胶渗透色谱（HPGPC）进行纯化；纯化条件为：高效液相色谱系统由岛津LC-10Ai泵、岛津CBM-20A控制器和岛津RID-10A折射率检测器组成；色谱柱为Superdex 200 Increase 10/300 GL；流动相为0.1mol/L乙酸铵和0.02%（w/v）叠氮化钠；柱温保持在38℃；进样量为20μL（浓度为5~10mg/mL），流速为0.6mL/min；然后根据分子量分布的出峰时间，对不同分子量的南瓜多糖组分进行收集，冻干后得到纯化后的SPS主要组分样品。以葡聚糖分子量标准品计算各组分分子量；19~23min出峰为多糖SPS-F2-1，分子量为19.4kDa；28~38min出峰为多糖SPS-F3-1，分子量为270.4kDa。图1为南瓜多糖的HPGPC图，从图1可以看出，南瓜多糖中含有多糖SPS-F2和多糖SPS-F3两种物质。

制备例2

与制备例1的区别仅在于，步骤（1）的南瓜果肉与去离子水比例为1：4（w/w），加入19mg的耐高温

步骤（2）的提取物按1:4（v/v）的比例与95%乙醇混合，收集多糖沉淀并复溶后，通过截留分子量为5000Da的超滤膜进行透析；

步骤（3）的不同浓度NaCl溶液洗脱体积为2BV。

制备例2在HPGPC中，19~23min出峰为多糖SPS-F2-2，分子量为18.3kDa；28~38min出峰为多糖SPS-F3-2，分子量为252kDa。

制备例3

与制备例1的区别仅在于，步骤（1）的南瓜果肉与去离子水比例为1：2（w/w），加入15mg的耐高温

制备例3在HPGPC中，19~23min出峰为多糖SPS-F2-3，分子量为21.8kDa；28~38min出峰为多糖SPS-F3-3，分子量为275.8kDa。

检测例：

（1）单糖组成：

分别将多糖SPS-F2水解成单糖混合物SPS-F2单糖组和多糖SPS-F3水解成单糖混合物SPS-F3单糖组，具体操作为：

2mg样品（多糖SPS-F2或多糖SPS-F3）用2mol/L三氟乙酸（TFA）在110℃下密闭水解8h，水解完成后，样品转移至EP管中加入甲醇共蒸馏（4次）除去多余的TFA。

然后将所述单糖混合组进行柱前衍生化，干燥的样品水解物以及单糖的混合标准品溶解在200μL的氢氧化钠溶液（0.3mol/L）中，然后在70℃下加入240μL PMP甲醇溶液（0.5mol/L）中反应1h，冷却后加入240μL HCl溶液（0.3mol/L）对反应体系进行中和，而后加入1mL二氯甲烷萃取3次以去除多余的PMP；最后在8000rpm/min下离心5min，上清液经0.22μm尼龙滤膜膜过滤，得到衍生后的单糖混合组（SPS-F2单糖组或SPS-F3单糖组）。

采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）对经过衍生化的样品进行单糖组成分析，分析条件为：安捷伦XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm）和紫外检测器进行分析。将磷酸盐缓冲液（pH 6.7）和乙腈混合（83:17，V:V）后作为流动相，流速为1.0mL/min，进样20μL，柱温35℃，吸光度设为245nm。采用LC solution Software（Shimadzu Scientific Instruments）进行数据分析。

测试结果如下：

制备例1的多糖SPS-F2-1中，鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖的摩尔比为33.9:12.2:26.8:18.9；多糖SPS-F3-1中，鼠李糖、半乳糖和阿拉伯糖的摩尔比为39.0:36.6:16.6；

制备例2的多糖SPS-F2-2中，鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖的摩尔比为31.2:11.6:24.2:16.9；多糖SPS-F3-2中，鼠李糖、半乳糖和阿拉伯糖的摩尔比为36.4:34.2:16.1；

制备例3的多糖SPS-F2-3中，鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖的摩尔比为34.3:12.8:22.5:18.3；多糖SPS-F3-3中，鼠李糖、半乳糖和阿拉伯糖的摩尔比为39.3:36.7:17.6；

（2）多糖分子结构

分别将制备例1提供的多糖SPS-F2-1和多糖SPS-F3-1以10mg溶解于500 μL D

表1 SPS-F2糖环的化学位移归属

从表1可以得出如下信息：

①SPS-F2-1具有半乳糖醛酸和鼠李糖的交替连接的信号峰：→4)-α-Gal

②SPS-F2-1的半乳聚糖侧链的β-1,4- Gal

③SPS-F2-1的阿拉伯聚糖侧链的α-1,5-Ara

④SPS-F2-1的鼠李糖之间的α-1,2-Rha

可以看出，多糖SPS-F2-1具有α-(1-2)-鼠李糖和α-(1-4)-半乳糖醛酸交替连接的信号峰，以及鼠李聚糖α-(1-2)-糖苷键的信号峰，半乳聚糖β-(1-4)-糖苷键的信号峰，阿拉伯聚糖α-(1-5)-糖苷键的信号峰，所述半乳聚糖和阿拉伯聚糖通过分支鼠李糖链接到交替连接的α-(1-2)-鼠李糖和α-(1-4)-半乳糖醛酸的主链上。

从表2（见下页）可以得出如下信息：

① SPS-F3-1具有通过α-1,2-Rha

② SPS-F3-1具有半乳聚糖侧链的β-1,4- Gal

③ SPS-F3-1的半乳聚糖侧链连接在分支鼠李糖的C-4位上：由交叉峰δ3.718/104.32ppm(鼠李糖的H-4和半乳糖的C-1)。

④ SPS-F3-1的阿拉伯聚糖侧链的α-1,5-Ara

可以看出，多糖SPS-F3-1具有鼠李糖之间α-(1-2)-糖苷键的信号峰，以及半乳聚糖β-(1-4)-糖苷键的信号峰，阿拉伯聚糖α-(1-5)-糖苷键的信号峰，所述半乳聚糖和阿拉伯聚糖通过分支鼠李糖链接到鼠李聚糖的主链上。

表2 SPS-F3糖环的化学位移归属

分别将制备例2提供的多糖SPS-F2-2和多糖SPS-F3-2以10 mg溶解于500 μL D

分别将制备例3提供的多糖SPS-F2-3和多糖SPS-F3-3以10 mg溶解于500 μL D

（3）FGF2结合力测试

根据氨基偶联法将FGF2蛋白固定在CM5芯片上：使用35μL（5μL/min）的EDC/NHS溶液（0.4mol/L的EDC溶液和0.1mol/L的NHS溶液1:1混合）活化CM5芯片上的2、3、4通道表面的羧基；羧基活化后，迅速进样20μLFGF2溶液（pH 4.5的醋酸/醋酸钠缓冲液稀释至100μg/mL），响应值增加8000~10000 RU；然后使用35μL（5μL/min）的乙醇胺/HCl溶液（1mol/L），使通道表面多余的活化羧基失活；此外，芯片上的1通道作为对照，其表面羧基活化后迅速用乙醇胺/HCl溶液进行封闭。

将制备例1、制备例2和制备例3得到的多糖SPS-F2-1、SPS-F2-2和SPS-F2-3混合得到多糖SPS-F2；将制备例1、制备例2和制备例3得到的多糖SPS-F3-1、SPS-F3-2和SPS-F3-3混合得到多糖SPS-F3；采用直接结合的方法，将多糖SPS-F2和多糖SPS-F3以相同浓度（2mg/mL）通过FGF2蛋白芯片，用生物分子相互作用分析仪Biacore3000检测多糖SPS-F2和多糖SPS-F3与FGF2的亲和强度，图2给出了多糖SPS-F2和多糖SPS-F3与FGF2的结合信号图。从图2可以看出，多糖SPS-F2和多糖SPS-F3具有明显的FGF2结合信号，即多糖SPS-F2和多糖SPS-F3能够显著的与FGF2发生结合作用，且多糖SPS-F3的信号强度显著高于多糖SPS-F2。

然后，用生物分子相互作用分析仪Biacore3000进行不同浓度的多糖样品的结合解离测试，进行动力学分析，其中检测的流动相为HBS-EP缓冲液（0.01mol/L的HEPES，0.15mol/L的NaCl，3mmol/L EDTA，0.005%表面活性剂 P20，pH 7.4）；然后将制备例制备的多糖SPS-F2-1、多糖SPS-F2-2、多糖SPS-F2-3、多糖SPS-F3-1、多糖SPS-F3-2和多糖SPS-F3-3分别溶于HBS-EP缓冲液，并稀释为梯度浓度（2.5mg/mL、1.3mg/mL、0.6mg/mL、0.3mg/mL和0.2mg/mL）；流速为30μL/min，进样不同稀释度的多糖样品（多糖SPS-F2-1、多糖SPS-F2-2、多糖SPS-F2-3、多糖SPS-F3-1、多糖SPS-F3-2和多糖SPS-F3-3）90μL，经过3min的离解，进样30μL NaCl溶液（2mol/L）对芯片表面进行再生，然后在25℃下采集结合曲线，进行动力学分析并计算结合强度。示例性地，图3给出了梯度浓度的多糖SPS-F2-1与FGF2的结合信号及Langumair模型拟合曲线图；从图3可以看出，拟合曲线符合1:1 Langmuir模型，计算得到

示例性地，图4给出了梯度浓度的多糖SPS-F3-1与FGF2的结合信号及Langumair模型拟合曲线图；从图4可以看出，拟合曲线符合1:1 Langmuir模型，计算得到

此外，对于多糖SPS-F2-2、多糖SPS-F2-3、多糖SPS-F3-2和多糖SPS-F3-3，也同样获得了与信号实际曲线重合度较高的拟合曲线，并计算得到了具有较高可信度的

表3 SPS各组分与FGF2蛋白相互作用的动力学参数

从表3可以看出，结合常数

（4）Gal-3结合力测试

根据氨基偶联法将Gal-3蛋白固定在CM5芯片上；固定方法与（2）FGF2结合力测试中，FGF2的固定方法相同，区别仅在于Gal-3芯片再生采用进样30μL的150mmol/L的乳糖溶液。

同样地，将制备例1、制备例2和制备例3得到的多糖SPS-F2-1、SPS-F2-2和SPS-F2-3混合得到多糖SPS-F2；将制备例1、制备例2和制备例3得到的多糖SPS-F3-1、SPS-F3-2和SPS-F3-3混合得到多糖SPS-F3；采用直接结合的方法，将多糖SPS-F2和多糖SPS-F3以相同浓度（2mg/mL）通过Gal-3蛋白芯片，用生物分子相互作用分析仪Biacore3000检测多糖SPS-F2和多糖SPS-F3与Gal-3的亲和强度，图5给出了多糖SPS-F2和多糖SPS-F3与Gal-3的结合信号图。从图5可以看出，多糖SPS-F2和多糖SPS-F3具有明显的Gal-3结合信号，即多糖SPS-F2和多糖SPS-F3能够显著的与Gal-3发生结合作用。

然后，用生物分子相互作用分析仪Biacore3000进行不同浓度的多糖样品的结合解离测试，进行动力学分析，其中检测的流动相为HBS-EP缓冲液（0.01mol/L的HEPES，0.15mol/L的NaCl，3mmol/L EDTA，0.005%表面活性剂 P20，pH 7.4）；然后将制备例制备的多糖SPS-F2-1、多糖SPS-F2-2、多糖SPS-F2-3、多糖SPS-F3-1、多糖SPS-F3-2和多糖SPS-F3-3分别溶于HBS-EP缓冲液，并稀释为梯度浓度（10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1.3mg/mL和0.6mg/mL）；流速为30μL/min，进样不同稀释度的多糖样品（多糖SPS-F2-1、多糖SPS-F2-2、多糖SPS-F2-3、多糖SPS-F3-1、多糖SPS-F3-2和多糖SPS-F3-3）90μL，经过3min的离解，进样30μL乳糖溶液（150mmol/L）对芯片表面进行再生，然后在25℃下采集结合曲线，进行动力学分析并计算结合强度。示例性地，图6给出了梯度浓度的多糖SPS-F2-1与Gal-3的结合信号及Langumair模型拟合曲线图；从图6可以看出，拟合曲线符合1:1 Langmuir模型，计算得到

示例性地，图7给出了梯度浓度的多糖SPS-F3-1与Gal-3的结合信号及Langumair模型拟合曲线图；从图7可以看出，拟合曲线符合1:1 Langmuir模型，计算得到

此外，对于多糖SPS-F2-2、多糖SPS-F2-3、多糖SPS-F3-2和多糖SPS-F3-3，也同样获得了与信号实际曲线重合度较高的拟合曲线，并计算得到了具有较高可信度的

表4 SPS各组分与Gal-3蛋白相互作用的动力学参数

从表4可以看出，多糖SPS-F2和多糖SPS-F3与Gal3的相互作用均为慢结合、快解离。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。