一种分离神经母细胞瘤CTC的微流体芯片及其捕获方法

摘要

一种分离神经母细胞瘤CTC的微流体芯片及其捕获方法，本发明涉及一种分离循环肿瘤细胞（CTC）的微流体芯片，为使CTC细胞在芯片内部快速富集和捕获，本发明提供的方法基于物理学中流体力学临界分选尺寸和生物化学中抗原‑抗体亲和效应，实现从全血中一步分离捕获神经母细胞瘤CTC，减少了操作步骤，提高了神经母细胞瘤CTC的捕获效率和细胞活性。本发明的有益效果在于：1.一步操作，无需复杂的前处理；2.两级分离提高CTC的捕获效率和纯度；3.双重捕获作用最终得到高效率和高活性的CTC细胞；4.即可置于显微镜下观察检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种分离循环肿瘤细胞（CTC）的微流体芯片，具体来说涉及一种分离神经母细胞瘤CTC的微流体芯片及其捕获方法。

背景技术

神经母细胞瘤（neuroblastoma，NB）是婴幼儿最常见的颅外实体肿瘤，占儿童恶性肿瘤的8%～10%。神经母细胞瘤是一组临床表现及预后差异很大的疾病，从肿瘤播散、转移、患儿死亡，到肿瘤发展成熟为良性的节细胞神经瘤或自发消退等不同临床转归。肾上腺是最常见的原发部位，其次是腹部交感神经节、胸部交感神经节、颈部交感神经节和盆腔交感神经节，约1%的病人未能发现原发肿瘤。神经母细胞瘤可转移至淋巴结、骨髓、骨骼、硬脑膜、眼眶、肝脏和皮肤，少数情况下也会转移至肺部和颅内。不同年龄、肿瘤发生部位及不同的组织分化程度使其生物特性及临床表现有很大差异，部分可自然消退或转化为良性肿瘤，但另一部分人却又十分难治且预后不良。近半数的神经母细胞瘤患儿，是在癌症扩散并被认定为高危后才被诊断出来。国际上经过30余年的多中心协作，使得神经母细胞瘤的5年生存率从1974年至1989年的46%上升到1999年至2004年的71%。相对于国际先进水平，我国神经母细胞瘤的诊断、治疗还存在差距。鉴于如果医生在初步诊断时知道肿瘤可能具有多大的侵袭性，那么这将对他们非常有帮助。目前对神经母细胞瘤的检测主要包括：

1.病理组织学检查：肿块切除、切开活检或穿刺活检病理检查。

2.生物学检查：主要是尿儿茶酚胺及其代谢产物（VMA/HVA），最常见的是 VMA 增高，少数病例 HVA 增高，或两者均增高。尿 VMA 可协助诊断神经母细胞瘤，并用以检测对治疗的反应。

3.骨髓检查：骨髓穿刺可见瘤细胞集结成团，形似菊花环。

4.影像学检查：原发肿瘤及转移瘤灶的 B超、CT 或 MR 平扫或增强检查，确定肿瘤的位置、周围组织受累程度，以及肿瘤转移的情况。

研究表明，当肿瘤细胞发生转移的时候，从肿瘤原发灶或转移灶脱落，通过血管或淋巴系统进入血液中，这称为循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells，CTCs），来源于原发或转移灶的CTCs不仅能够间接体现肿瘤特征，也能够实时反映肿瘤的发展状况。CTCs检测提供了丰富的信息，使其在临床和基础研究中都有价值，然而检测CTC的最大挑战是它们的稀缺性，1×10

发明内容

本发明提供了一种分离神经母细胞瘤CTC的微流体芯片及其捕获方法，使CTC细胞在芯片内部快速富集和捕获，其原理是基于物理学中流体力学临界分选尺寸和生物化学中抗原-抗体亲和效应，实现从全血中一步分离捕获神经母细胞瘤CTC，减少了操作步骤，提高了神经母细胞瘤CTC的捕获效率和细胞活性。此外，本发明提供的装置只需要简单的稀释血液样本就能进行上样分离。

本发明的目的之一在于提供一种分离神经母细胞瘤的CTC的微流体芯片的制作方法，该制作方法包括有如下的步骤：

1）使用光刻技术，在硅衬底上制作微柱阵列图案的模板，然后在图案化的硅衬底模板上倒入聚合物，加热固化后形成带有微柱阵列图案的聚合物层，脱模后再在入口和出口处打孔；

固化温度优选为80-85 ℃，固化时间优选为0.5-1小时；

2）取一清洁玻璃片作为基底，与步骤1制作的聚合物盖片经氧等离子体表面活化处理后进行表面贴合粘连，形成微流体捕获芯片的原型；

3)对芯片捕获区先后用3-巯基丙基三甲氧基硅烷（用4％v / v的乙醇于室温下修饰30min）和N-马来酰亚胺基丁酰氧基琥珀酰亚胺酯（GMBS，0.1mM的二甲基亚砜（DMSO）室温下反应30分钟）进行修饰；

4）再将基底表面用抗生蛋白链菌素（10μg/ ml的PBS）预处理1小时）；

5）最后在使用前，将修饰的底物与GD2抗体结合（10μg/ mL的PBS和1.0％（w / v）BSA和0.1％（w/v）叠氮化钠处理30min）。

本发明提供的分离神经母细胞瘤的CTC的微流体芯片，所述的微流体芯片包括对样品内的大尺寸细胞（肿瘤细胞和小部分尺寸较大的白细胞）进行富集的细胞富集区（用以除去绝大部分红细胞和尺寸较小的白细胞），以及和所述的细胞富集区相连通的用于对神经母细胞瘤CTC进行特异性捕获的细胞捕获区；所述的细胞富集区内设有一通道，所述的通道两侧设有沿着通道方向呈一定偏移角度排列的微柱阵列，微柱阵列的末端各设有第一级废血出口；所述的细胞捕获区内设有按临界尺寸（7-10微米）错位排列的微柱阵列；细胞捕获区的基底上修饰有对神经母细胞瘤CTC进行特异性捕获的GD2抗体。

细胞富集区的通道可以是位于细胞富集区的中间位置，其将细胞富集区对称性的一分为二，也可以是非中间位置。样品从血液入口流入，首先进入细胞富集区，在该区中，绝大部分的小尺寸细胞（红细胞和绝大部分的白细胞）小于阵列的临界尺寸，不受阵列偏移方向的影响，始终沿着流体方向前进，并从第一级废血出口流出；大于临界尺寸的大尺寸细胞（肿瘤细胞和小部分尺寸较大的白细胞）由于被阵列阻挡，不能直着通行，而顺着阵列偏移的方向呈一定角度通行，并最终汇集于中间的通道内，流向细胞捕获区。经此过程，绝大部分的废血细胞已进行去除，只剩下少量的大尺寸细胞（包含肿瘤细胞）进入下一级细胞捕获区继续分离捕获，从而提高CTC的捕获效率及纯度。

在细胞捕获区中，由于大部分流体已从之前的第一级废血出口流出，此时流体速度大大降低，神经母细胞瘤CTC受到按临界分选尺寸（7-10微米）错位排列的微柱阵列阻挡及基底表面修饰的GD2抗体亲和效应双重捕获作用的影响，最终被原位捕获于捕获区的微柱阵列间，而其余血细胞则不受临界尺寸和抗体亲和作用的影响，从而从捕获区末端的第二级废血出口流出。

所述的聚合物盖片由聚二甲基硅氧烷（PDMS）、聚碳酸酯、硅树脂、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚醚醚酮中的一种或多种制成，基底为玻璃材质。

作为优选的，细胞富集区的微柱阵列为圆形，细胞捕获区的微柱阵列为长方形、正方形或棱形结构。细胞富集区圆形微柱的直径在10-30微米之间，两个相邻微柱之间的行间距为20-30微米，列间距为30-50微米，高度为30微米，偏移角度为1-30度；细胞捕获区微柱的边长为20-30微米，横向间隔为20-30微米，纵向间隔为7-15微米，优选的横向间隔为20-25微米，纵向间隔为8-12微米，微柱高度为30微米。

本发明的第三个目的在于提供一种分离神经母细胞瘤CTC的捕获方法，所述的捕获方法如下：将外周血以小于18ml/h的流速，更优选的是6-18ml/h的流速从血液入口孔通入芯片，外周血首先在细胞富集区内对大尺寸细胞进行富集，排除掉绝大部分的小尺寸废血细胞，而后在细胞捕获区内对神经母细胞瘤CTC进行特异性捕获，废血从两级的废血出口流出；血液中的神经母细胞瘤CTC因尺寸较大，在细胞富集区中被汇集于通道的中间，在细胞捕获区中，受微柱阵列的拦截及与基底上修饰的GD2抗体发生的细胞表面特异性抗原-抗体结合，被捕获在微流体芯片的细胞捕获区内，而其他血细胞则不受阵列偏移或拦截作用，也不与GD2抗体发生结合，沿着流体流动的方向被冲出芯片。

本发明采用的是利用细胞临界尺寸和神经母细胞瘤CTC对GD2抗体的特异性结合的原理，基于微流控阵列技术和抗体亲和技术分离捕获神经母细胞瘤CTC。基本原理是首先设计按一定尺寸分布的微流控微柱阵列，玻璃基片表面经过一系列化学处理，将特异性抗体连接在其表面，当血液细胞流过微柱阵时，只有含有特异性抗原的神经母细胞瘤CTC会被GD2抗体捕获，其他的红细胞和白细胞则会随着流体冲走，然后再将捕获的CTC细胞经染色处理后在荧光显微镜下观测鉴定。

本发明的有益效果在于：

1.一步操作，无需复杂的前处理，只需加以稀释即可上样分离，在芯片中同时完成对神经母细胞瘤CTC的分离和捕获；减少了人工操作步骤和试剂耗材使用，显著提高了分离效率，降低了检测成本。另外，该方法分离得到的神经母细胞瘤CTC活性高，细胞没有被污染、损伤，可以进一步进行细胞培养或下游表型和基因型分析。

2.按临界分选尺寸分布的微柱阵列用于分离富集神经母细胞瘤CTC，使富集液细胞和废血细胞分别从不同通道或出口流出，富集液细胞进入下一级细胞捕获区，两级分离提高CTC的捕获效率和纯度；

3.将GD2抗体与微流控芯片阵列结合，在芯片表面特异性的原位捕获神经母细胞瘤CTC，其余废血细胞则不受阵列和抗体的影响，双重捕获作用最终得到高效率和高活性的CTC细胞；

4.本发明所述的捕获芯片由第一级细胞富集区和第二级细胞捕获区组成，设有血液入口、第一级废血出口和第二级废血出口，其中捕获区域是基于微流控芯片临界分选尺寸阵列分布技术和GD2抗原抗体亲和技术的结合。

5.本发明所述的方法能原位捕获神经母细胞瘤CTC，在芯片上可直接对细胞进行免疫荧光染色操作后，即可置于显微镜下观察检测。

附图说明

图1为神经母细胞瘤细胞的微流体芯片结构示意图；

图2为细胞富集区圆形微柱阵列示意图；

图3为细胞捕获区正方形微柱阵列示意图；

图4是微流体芯片对SK-N-SH细胞的捕获效率图。

具体实施方式

实施例 1

使用光刻技术，制造出可以捕获神经母细胞瘤CTC的微流体芯片模板。在模板上倒入聚二甲基硅氧烷(PDMS)预聚物，并在80 ℃下固化0.5h。然后将PDMS微流控芯片从模板上脱离，并打孔形成血液入口孔和废血出口孔，经氧等离子体活化处理后与玻璃基片键合。玻璃基片的表面用3-巯基丙基三甲氧基硅烷（用4％v / v的乙醇于室温下修饰30min）修饰，然后用N-马来酰亚胺基丁酰氧基琥珀酰亚胺酯（GMBS，0.1 mM的二甲基亚砜（DMSO））处理30min后，将基质表面掺入抗生蛋白链菌素（10 μg/ ml的PBS预处理1小时）。最后，在使用前，将修饰的底物与GD2抗体结合（10 μg/ mL的PBS和1.0％（w / v）BSA和0.1％（w/v）叠氮化钠处理30min）。

采用的微流体芯片如图1所示，样品从血液入口孔进入，首先经细胞富集区偏移微柱阵列的分选，在该细胞富集区中小尺寸的红细胞和绝大部分白细胞沿流体方向从第一级废血出口流出，所述的第一级废血出口可设于细胞富集区两侧；大尺寸的肿瘤细胞和小部分白细胞则富集于对称偏移微柱阵列结构的中间通道；细胞富集区的微柱阵列向着中间通道的方向成一定的角度偏移排列。图1所示，中间通道可设于细胞富集区的中间，其两侧的微柱阵列对称，样品经过细胞富集区的微柱阵列时，由于两侧对称且向着中间通道的方向成一定的角度偏移排列，使小尺寸的红细胞和绝大部分白细胞向着两侧的第一废液出口的方向流动，并最终从该出口流出；而大尺寸的肿瘤细胞和小部分白细胞则会向着中间通道方向汇集，并最终继续流向细胞捕获区。这样，在细胞富集区中，由于细胞尺寸的不同，在阵列的临界尺寸和偏移角度合理安排下，实现首次空间上的分离。

通过连接细胞富集区和细胞捕获区的中间通道，样品流入细胞捕获区，在细胞捕获区中，受到按临界分选尺寸错位排列的微柱阵列及基底表面修饰的GD2抗体双重捕获作用的影响，神经母细胞瘤CTC最终被捕获于捕获区的微柱阵列间，而其余细胞则不受临界尺寸和抗体结合的影响，最终从第二废血出口流出。

如图2所示，图1中的细胞富集区的圆形微柱的直径a为1-50微米，具体边长为30微米；两微柱的行间距b的长度为1-50微米，具体为20微米；列间距c的长度为1-50微米，具体为30微米；偏移角度β为1-30度，具体为10度，微柱结构的高度为30微米。

如图3所示，图1中的细胞捕获区的正方形的边长d为1-50微米，具体为20-30微米，两微柱的行间距e为20-25微米，两顶角之间的距离f为7-10微米，微柱高度为30微米。

实施例 2

为了测试流速如何影响捕获率，血液样本中加入用荧光标记的神经母细胞瘤SK-N-SH细胞系，细胞浓度约为200个/ml细胞，分别以6、9、12、15和18ml/h的流速通到图1的微流体芯片中，然后用荧光显微镜观察捕获的肿瘤细胞的数量。捕获效率按下式计算：捕获率= N