一种SARS-CoV-2冠状病毒抗体轻链全长序列的扩增方法

摘要

本发明提供了一种SARS‑CoV‑2冠状病毒抗体轻链全长序列的扩增方法，根据3’端恒定区特异性引物进行反转录，获得包含完整可变区的全长转录本cDNA，然后使用5’端可变区特异性引物和恒定区引物对上述反转录制备的cDNA进行PCR扩增，即获得全长轻链序列。本发明提供了简单、快速、高效的从感染SARS‑CoV‑2冠状病毒患者血液中特异性扩增抗SARS‑CoV‑2冠状病毒抗体轻链全长序列的方法，为冠状病毒抗体的深入研究奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种SARS-CoV-2冠状病毒抗体轻链全长序列的扩增方法。

背景技术

冠状病毒是一类可感染人及多种脊椎动物的单股正链RNA病毒，是引起人普通感冒以及上呼吸道感染的重要病原体，严重威胁人类健康。2019年底流行的SARS-CoV-2冠状病毒具有传播快、疫情重、进展迅速特点。在部分患者中导致呼吸功能进行性障碍并引起死亡。目前对SARS-CoV-2冠状病毒的药物研究包括疫苗、抗体等。1年多时间内，全球对抗体的研究越来越重视，然而最新发表的研究中对抗体的研发都是基于CDR3片段进行的，这也是抗体有效性弱、研发进展缓慢的一大原因。

因此，亟需一种简单高效的扩增方法能够快速扩增出SARS-CoV-2冠状病毒抗体轻链全长序列。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速、简单、高效的SARS-CoV-2冠状病毒抗体轻链全长序列的扩增方法。

为实现上述目的，本发明提供一种SARS-CoV-2冠状病毒抗体轻链全长序列的扩增方法，包括以下步骤：

S1、提取总RNA：在SARS-CoV-2冠状病毒患者或康复患者血液中提取总RNA；

S2、反转录反应制备cDNA：在该反转录反应中，使用3’端恒定区特异性引物进行反转录，得到包含完整可变区的全长转录本cDNA，并且是抗SARS-CoV-2冠状病毒抗体轻链全长cDNA序列；

S3、SARS-CoV-2冠状病毒抗体轻链全长序列扩增：使用5’端可变区特异性上游引物和3’端恒定区特异性下游引物对上述反转录制备的cDNA进行PCR扩增，即获得全长轻链序列。

进一步地，在所述步骤S2中，反转录反应中3’端恒定区特异性引物设计模板SARS-CoV-2冠状病毒抗体轻链全长核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步地，在所述步骤S2中，反转录反应中SARS-CoV-2冠状病毒抗体轻链3’端恒定区特异性引物核苷酸序列P1为GGGTGAGGTGAAAGATGAGC。

进一步地，在所述步骤S3，SARS-CoV-2冠状病毒抗体轻链全长序列扩增过程中，使用的5’端可变区特异性上游引物核苷酸序列P2为GTCAGGACACAGCATGGACA。

进一步地，在所述步骤S3，SARS-CoV-2冠状病毒抗体轻链全长序列扩增过程中，使用的3’端恒定区特异性下游引物核苷酸序列P3为TCCCTCTAACACTCTCCCCT。

本发明在反转录过程中，使用3’端恒定区特异性引物进行反转录，获得包含完整可变区的全长转录本cDNA。然后，使用5’端可变区特异性上游引物和3’端恒定区特异性下游引物对上述反转录制备的cDNA进行PCR扩增，即获得全长轻链序列。

本发明的有益效果： 提供了快速、简单、高效的SARS-CoV-2冠状病毒抗体轻链全长序列的扩增方法，为冠状病毒抗体的深入研究奠定了基础。

附图说明

图1为全长轻链PCR产物琼脂糖电泳图。

具体实施方式

为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。

实施例1：

1、SARS-CoV-2冠状病毒患者或康复患者血液中总RNA提取。

取1.0ml全血加入红细胞裂解液，离心去除上清，加入1ml裂解液Trizol,室温放置5分钟。加入200µl氯仿震荡15秒，室温放置2分钟后4℃ 12000rpm离心5分钟。吸取上层澄清液体至一干净无RNA酶的离心管，加入等体积异丙醇混匀，室温放置5分钟，4 ℃ 12000rpm离心5分钟。丢弃上清加入1ml 75% 乙醇，上下颠倒lmin, 4℃ 12000rpm离心5分钟。丢弃上清室温干燥5分钟，加入40ul无RNA酶水充分溶解RNA, 获得RNA冻存于-80℃待用。

2、反转录反应制备cDNA。

在该反转录反应中，使用3’端恒定区特异性引物进行反转录，3’端恒定区特异性引物核苷酸序列P1为GGGTGAGGTGAAAGATGAGC，得到包含完整可变区的全长转录本cDNA，并且是抗SARS-CoV-2冠状病毒抗体轻链全长cDNA序列。反转录使用SMARTer PCR cDNASynthesis Kit（Clontech）试剂盒，反应体系按照试剂盒说明书配置，反应条件为42℃孵育90分钟，在70℃下10分钟终止反应，然后加入90μL Elution Buffer (EB)稀释。

3、SARS-CoV-2冠状病毒抗体轻链全长序列扩增。

使用5’端可变区特异性上游引物和3’端恒定区特异性下游引物对上述反转录制备的cDNA进行PCR扩增，即获得全长轻链序列。使用的5’端可变区特异性上游引物核苷酸序列P2为GTCAGGACACAGCATGGACA。使用的3’端恒定区特异性下游引物核苷酸序列P3为TCCCTCTAACACTCTCCCCT。

使用的PCR酶为PrimeSTAR GXL DNA Polymerase（Clontech），反应条件

●初始变性：

- 98°C 30秒

●在以下温度和时间下进行10次循环：

- 98°C 10秒

- 65°C，持续15秒

- 68°C，10分钟

●最终延期：

- 68°C，5分钟

如图1所示，PCR产物金1%琼脂糖电泳显示，成功扩增出全长轻链基因。

SEQ ID NO：1

ATGGGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCCGGTGCCAGATGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCGACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCACAGCGTTGATACCTGGTTGGCCTGGTATCAACACAGACCAGGGAAGGCCCCTAAGCCCCTGATCTATAAGGCATCTAAATTAGAACCTGGGGTCCCACCGAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAATATAGTACTTTTTGGACGTTCGGCCAAGGGACTAAAGTAGAAGTCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明做任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下，还有其他的变体和改型。