龙眼SNP分子标记及其在遗传图谱构建、单果重性状定位中的应用

摘要

本发明属于植物分子标记制备与应用技术领域，具体涉及一种龙眼SNP分子标记及在遗传图谱构建、单果重性状定位中的应用。本发明利用RAD‑seq技术对200份‘凤梨朵’(母本)ב大乌圆’(父本)杂交F1代及父母本植株进行测序并开发SNP标记，构建了龙眼高密度遗传图谱，所述分子标记共计8014个，分布于15个连锁群上，总长度为2873.39 cM，平均遗传距离为0.36 cM。结合连续2年数据进行连锁定位分析，共筛选出12个与单果重性状关联的稳定QTL位点。这些QTL位点在大果型龙眼新品种分子标记辅助育种中具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于植物分子标记制备与应用技术领域，具体涉及一种龙眼SNP分子标记及在遗传图谱构建、单果重性状定位中的应用。

背景技术

龙眼(Dimocarpus longana Lour.)(2n＝2x＝30)属于无患子科(Sapindaceae)龙眼属(Dimocarpus)植物，是我国南方地区重要的经济林木。广泛的种植于我国的广东、福建、广西、海南、云南、四川和重庆等地。中国龙眼的栽培面积和果实产量常年位居世界首位。据国家荔枝龙眼产业技术体系统计，2018年，中国大陆龙眼栽培面积约413.97万亩，果实产量约157.21万吨，约占世界总产量一半左右。但由于我国龙眼主栽品种‘石硖’和‘储良’果实偏小(‘石硖’单果重7.0-10.0g，‘储良’单果重12-14g)，严重削弱了我国龙眼与东盟国家特别是与泰国龙眼(单果重在14g以上)在国内外贸易中的竞争力，制约我国龙眼产业的发展(齐文娥,陈厚彬,彭朵芬,晏发发.中国龙眼产业发展现状、问题与对策建议[J].广东农业科学,2016,43(8):169-174)。大果型优质龙眼品种短缺是我国龙眼产业发展的瓶颈之一，如何加速培育大果型优质龙眼新品种，是当前龙眼育种迫切需要解决的问题。自20世纪80年代末以来，我国育种工作者就已通过实生选种、芽变选种和杂交育种等手段选育出了许多优异的龙眼新品种，比如‘立冬本’、‘冬宝9号’、‘储良’和‘涪陵黄壳’等(张永福,陈泽斌,黄鹤平,任禛,韩丽.龙眼育种研究进展[J].昆明学院学报,2014(3):43-47.)。但由于龙眼是多年生木本植物，童期长、基因型高度杂合，需要6-7年才能观察到果实的表型特征。这些传统的育种方法周期长，效率低，导致我国龙眼育种工作滞后，缺少多样化的优良品种，特别是优质大果型龙眼新品种。同时对龙眼单果重性状的遗传机制认识的缺失也从科学理论上限制了大果优质龙眼新品种的快速、定向育种，导致了育种的盲目性。因此，深入解析龙眼单果重的遗传机制，加速培育大果型优质龙眼新品种是当今龙眼育种中面临的一个重要课题，对于我国龙眼产业的“提质增效”及可持续发展意义重大。对于我国南方贫困地区的脱贫攻坚和“乡村振兴”也具有重要意义。

作为一个复杂的数量性状，龙眼单果重易受到遗传背景和环境的影响，表型与基因型之间没有明确的对应关系(卢博彬.龙眼微卫星标记的开发、育种应用及优异杂种株系的选育[D].华南农业大学，2014)。因此基于遗传图谱的QTL分析是解析龙眼单果重性状的有效途径。在龙眼连锁作图方面，我国走在了世界前列，目前报道的龙眼连锁作图都是我国构建的(黄天林.荔枝两个重要性状的分子标记分析及龙眼分子遗传图谱初步构建[D].华南农业大学硕士学位论文,2006；任鹏荣.龙眼遗传图谱构建及部分品种遗传杂合度的分析[D].华南农业大学硕士学位论文,2007；郭印山等，2009；卢博彬.龙眼微卫星标记的开发、育种应用及优异杂种株系的选育[D].华南农业大学，2014)。Guo等(Guo Y S,Zhao Y H,LiuC M.QTLs analysis of aeveral traits in longan[J].Biotechnology&Biotechnological Equipment,2011,25(1):2203-2209)构建了‘大乌圆’和‘凤梨朵’杂交F1代94个群体的遗传图谱，得到7个控制单果重的QTLs。利用同一群体，卢博彬(卢博彬.龙眼微卫星标记的开发、育种应用及优异杂种株系的选育[D].华南农业大学，2014)对10个龙眼重要果实品质性状进行了QTL定位，共得到68个QTLs，其中控制单果重的QTL为6个，分别位于连锁群FD1、FD2、FD3、FD6和FD8上，解释表型变异为19.0～41.1％。但是，由于上述研究所用的作图群体较小以及选用的标记本身存在的缺陷(如AFLP的缺陷在于它是显性标记，无法用于区分纯合子和杂合子，会降低统计功效(戎俊,杨小强,耿宇鹏,宋志平,卢宝荣.分子生态学[M].北京:高等教育出版社,2015:151-165)，导致图谱精度不高，提供的信息有限，且连锁群与实际染色体数目不对应(2n＝30)，无法准确、高效的鉴定QTL区段的候选基因。因此，构建高密度分子遗传图谱对于解析龙眼单果重性状关联基因尤为重要。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明目的之一在于提供一种龙眼SNP分子标记，利用获得的带有基因序列的SNP分子标记，从而构建获得龙眼高密度分子遗传图谱，实现对龙眼单果重性状进行定位，且定位位点稳定性好，适用范围广，本发明在龙眼单果重性状分子标记辅助育种中具有良好的应用前景。

本发明第二目的在于提供上述龙眼SNP分子标记在龙眼遗传图谱构建、单果重性状定位中的应用。

本发明第三目的在于提供龙眼单果重性状定位的遗传图谱。

本发明目的按如下技术方案实现：

一种龙眼SNP分子标记，其特征在于：所述分子标记共计8014个，分布于15个连锁群上，如图1所示的SNP分子标记分布位点。

进一步具体地，上述龙眼SNP分子标记，它还具有如下所示的多态性标签及连锁群上的分布：

。

一种龙眼SNP分子标记，其特征在于：所述分子标记共计8014个，分布于15个连锁群上，所述SNP分子标记是按照以下方法获得的：以小果型龙眼凤梨朵为母本，与大果型龙眼大乌圆为父本杂交产生F1代杂交群体，提取各样品的基因组DNA；利用RAD-seq技术对母本小果型龙眼凤梨朵、父本大果型龙眼大乌圆以及F1代真杂交群体进行基因分型，并对SNP标记过滤和质量评估，将其中比对到参考基因组上唯一位置的reads挑出来，同时为了减少测序错误造成的假阳性SNP，要求亲代本每个SNP的碱基支持数不少于4，子代每个SNP的碱基支持数不少于2，基因型质量值GQ(Genotype Quality)≥20，共获得698615个多态性SNP位点；接着对分型后的hk×hk、nn×np、lm×ll 3种子代标记类型分别进行筛选过滤，过滤掉含有异常碱基及覆盖所有子代小于85％的SNP位点，最终获得用于构建遗传图谱的8014个SNP标记；

所述真杂交群体是以小果型龙眼凤梨朵为母本，与大果型龙眼大乌圆为父本杂交产生F1代杂交群体，利用SSR标记对杂交F1代进行真假杂种鉴定，最终得到真杂种群体。

上述龙眼SNP分子标记在构建龙眼遗传图谱和龙眼单果重性状定位中的应用。

一种龙眼SNP分子标记构建的用于龙眼单果重性状定位的遗传图谱，其特征在于：它采用与单果重性状相关的QTL位点分布在由上述龙眼SNP分子标记构建的龙眼遗传图谱上，所述QTL位点分布具体为：其中有一个位于第1号连锁群上，命名为qSFW-1-2；三个位于第四号连锁群上，分别命名为qSFW-4-1、qSFW-4-2和qSFW-4-3；一个位于第5号连锁群上，命名为qSFW-5-1；一个位于第8号连锁群上，命名为qSFW-8-1；五个位于第10号连锁群上，命名为qSFW-10-1、qSFW-10-2、qSFW-10-3、qSFW-10-4和qSFW-10-5；一个位于第14号连锁群上，命名为qSFW-14-2；各位点的区间见下表：

一种龙眼SNP分子标记在构建用于单果重性状定位的遗传图谱的方法，其特征在于：

以小果型龙眼凤梨朵为母本，与大果型龙眼大乌圆为父本杂交产生F1代杂交群体，提取各样品的基因组DNA；利用RAD-seq技术对母本凤梨朵、父本大乌圆以及200份F1代真杂交群体进行基因分型，并对SNP标记过滤和质量评估，将其中比对到参考基因组上唯一位置的reads挑出来，同时为了减少测序错误造成的假阳性SNP，要求亲代本每个SNP的碱基支持数不少于4，子代每个SNP的碱基支持数不少于2，基因型质量值GQ(Genotype Quality)≥20，共获得698615个多态性SNP位点；接着对分型后的hk×hk、nn×np、lm×ll 3种子代标记类型分别进行筛选过滤，过滤掉含有异常碱基及覆盖所有子代小于85％的SNP位点，最终获得8014个SNP标记用于构建遗传图谱。

更具体地，龙眼SNP分子标记在构建用于单果重性状定位的遗传图谱的方法，包括以下步骤：

S1，以小果型龙眼凤梨朵为母本，与大果型龙眼大乌圆为父本杂交产生F1代杂交群体，提取各样品的基因组DNA；

S2，利用RAD-seq技术对母本凤梨朵、父本大乌圆以及200份F1代真杂交群体进行基因分型，并对SNP标记过滤和质量评估，将其中比对到参考基因组上唯一位置的reads挑出来，同时为了减少测序错误造成的假阳性SNP，要求亲代本每个SNP的碱基支持数不少于4，子代每个SNP的碱基支持数不少于2，基因型质量值GQ(Genotype Quality)≥20，共获得698615个多态性SNP位点；接着对分型后的hk×hk、nn×np、lm×ll 3种子代标记类型分别进行筛选过滤，过滤掉含有异常碱基及覆盖所有子代小于85％的SNP位点，最终获得8014个SNP标记用于构建整合遗传图谱；

S3，利用S2的8014个筛选出来的SNP标记构建遗传图谱；

S4，对S1的父母本及F1代杂交群体进行单果重性状表型鉴定；

S5，分析S3构建的遗传图谱和S4的单果重性状表型鉴定结果，采用MapQTL6.0进行QTL分析，得到与单果重性状相关的QTL位点；共得出12个与单果重性状相关的QTL位点，其中有一个位于第1号连锁群上，命名为qSFW-1-2；三个位于第四号连锁群上，分别命名为qSFW-4-1、qSFW-4-2和qSFW-4-3；一个位于第5号连锁群上，命名为qSFW-5-1；一个位于第8号连锁群上，命名为qSFW-8-1；五个位于第10号连锁群上，命名为qSFW-10-1、qSFW-10-2、qSFW-10-3、qSFW-10-4和qSFW-10-5；一个位于第14号连锁群上，命名为qSFW-14-2。

本发明还提供了一种上述的龙眼SNP分子标记在龙眼单果重性状分子标记辅助育种中的应用。

本发明具有以下有益效果：

龙眼童期长、需要6-7年才能观察到果实表型特征，本发明以小果型龙眼凤梨朵为母本，与大果型龙眼大乌圆为父本杂交产生F1代杂交群体，利用SSR标记对杂交F1代进行真假杂种鉴定，最终得到真杂种群体。同时，本发明基于RAD-seq技术筛选获得大量带有基因序列的SNP标记，利用这些标记位点构建了龙眼高密度分子遗传图谱，并对龙眼单果重性状进行定位研究，获得了与龙眼单果重性状关联的功能标记，且定位位点稳定性好，适用范围广，该发明在龙眼单果重性状分子标记辅助育种中具有良好的应用前景。

附图说明

图1为实施例1中构建的龙眼高密度SNP分子遗传连锁图谱。

图2为实施例1中与龙眼单果重性状关联的QTL位点在构建的遗传图谱上的分布图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

S1，以凤梨朵龙眼为母本，大乌圆龙眼为父本杂交产生F1代杂交群体，提取基因组DNA。

试验在潮州果树研究所进行。以小果型龙眼凤梨朵为母本，与大果型龙眼大乌圆为父本杂交产生F1代杂交群体。2002年进行杂交，7月-8月份采收杂交种子，2003年1月份在温室中对杂交种子进行催芽和播种，9月至10月分批次进行移栽、定植。同时利用SSR标记对杂交F1代进行真假杂种鉴定，最终得到230株真正杂种。2009年至2010年杂交后代大部分都已开花、结果。选取200株真杂交后代连同父母本植株用于构建遗传图谱。2016年春季采集选取的200株F1代植株及双亲幼叶，提取基因组DNA。用NanoDrop 2000型分光光度计检测DNA的浓度。

S2，利用RAD-seq技术对S1的父母本及F1代杂交群体进行基因分型，并对SNP标记过滤和质量评估，将其中比对到参考基因组上唯一位置的reads挑出来，同时为了减少测序错误造成的假阳性SNP，要求亲代本每个SNP的碱基支持数不少于4，子代每个SNP的碱基支持数不少于2，基因型质量值GQ(Genotype Quality)≥20，共获得698615个多态性SNP位点；接着对分型后的hk×hk、nn×np、lm×ll 3种子代标记类型分别进行筛选过滤，过滤掉含有异常碱基及覆盖所有子代小于85％的SNP位点，最终获得8014个SNP标记用于构建整合遗传图谱。具体操作如下：

利用RAD-seq技术共测序两个亲本和200个后代，测序采用的方法参考Baird N A等(Baird N A,Etter P D,Atwood T S,et al.Rapid SNP discovery and geneticmapping using sequenced RAD markers[J].PloS one,2008,3(10):e3376.)。首先向所有检测合格的0.1-1μgDNA中加入EcoRI进行酶切，以得到适合的marker密度；接着加入P1接头引物和T4连接酶在37℃反应1小时。DNA片段pooling，随机打断到一定的片段，电泳回收200bp-400bp的DNA，末端平化后加A；然后向产物中加入P2接头在20℃下反应15分钟，用Qubit 2.0kit检测文库的质量。利用qRT-PCR检测文库(>2nM)的有效浓度以确定插入片段的正确性。然后所有的样品都均一到10nM用Illumina HiSeq

检测合格的DNA文库进行HiSeq测序，产出原始数据(即Raw data或Raw reads)，结果以FASTQ文件格式存储(文件名：*.fq)。原始测序数据中会包含接头信息，低质量碱基，未测出的碱基(以N表示)，为保证信息分析质量，这些信息会对后续的信息分析造成很大的干扰，分析前需将这些干扰信息去除掉，最终得到的数据即为有效数据，我们称之为Cleandata或Clean reads。原始数据过滤方法如下：

(1)需要过滤掉含有接头序列的reads pair；

(2)当单端测序read中含有的N的含量超过该条read长度比例的10％时，需要去除此对paired reads；

(3)当单端测序read中含有的低质量(质量值Q<＝5)碱基数超过该条read长度比例的50％时，需要去除此对paired reads。

经过对测序数据的严格过滤，得到高质量的Clean data，将Clean data与NCBI的核苷酸数据库进行比对，无其他来源的DNA污染。统计结果显示，202个样本品中平均每个个体的Raw data为1.15G，总测序量为232.3G，reads长度为150bp，测序质量高(Q20≥93.7％，Q30％≥86.36％)，样本GC分布正常(平均34.70％)。杂交后代共产生109.73G的高质量clean data，平均含有1.10G。将测序数据与参考基因组进行比对。样本比对率可以反映样本测序数据与参考基因组的相似性，覆盖深度和覆盖度能够直接反应测序数据的均一性及与参考序列的同源性。比对结果显示，所有clean data与参考龙眼基因组SRA315202的平均比对率为91.01％，对参考基因组(排除N区)的平均覆盖深度6.87X，4X覆盖度(至少有四个碱基的覆盖)平均在10.39％以上。可用于后续的变异检测及相关分析。

接着，对SNP进行群体检测。具体步骤如下：对BWA比对结果进行过滤：将比对到参考基因组上唯一位置的reads挑选出来，进行后续分析--SNP检测:采用GATK(UG模型)对过滤后的bam文件进行群体SNP检测--SNP过滤：为减少测序错误造成的假阳性SNP，要求亲本每个SNP的碱基支持数不少于4，子代每个SNP的碱基支持数不少于2，基因型质量值GQ(Genotype Quality)≥20。最终该项目共获得多态性位点698615个，包含301235个lm×llmarkers(43.12％),184735个nn×np markers(26.44％)和123178hk×hk markers(17.63％)。对分型后的hk×hk、nn×np、lm×ll 3种子代标记类型分别进行筛选过滤，主要包括异常碱基检查(少数亲本中没有出现的碱基型)和完整度(筛选基因型至少覆盖所有子代85％以上个体标记)。使用Joinmap4.1划分连锁群，最终8014个SNP标记用于构建整合遗传图谱，包含4722个lm×ll markers,3095个nn×np markers和197个hk×hk markers。

S3，利用S2的8014个筛选出来的SNP标记构建遗传图谱。所述分子标记共计8014个，分布于15个连锁群上，总长度为2873.39cM，平均遗传距离为0.36cM(表1)。使用Joinmap4.1划分连锁群，对划分好的连锁群采用最大释然法进行排序，对排序后的结果进行校正，然后再使用回归算法进行排序，父本与母本图完成后，使用mergemap进行整合获得整合图谱(图1)。

表1 SNP多态性标签及连锁群上的分布

S4，对S1的父母本及F1代杂交群体进行单果重性状表型鉴定：收集‘凤梨朵’(母本)ב大乌圆’(父本)的后代群体单株及亲本在2010年和2011年的单果重数据，利用MapQTL 6.0的interval mapping(IM)模式对性状和基因型进行分析计算，估算出基因位点对性状表型的贡献率等参数。以LOD值≥3.0作为QTL入选的标准。得到与单果重性状相关的QTL位点在遗传连锁图谱上的分布图，如图2所示。这些与单果重性状相关的QTL位点，在双亲整合的遗传图谱上共检测到12个与单果重性状关联的稳定QTL位点，如图2所示，图2为实施例1中与单果重性状相关的QTL位点在构建的遗传图谱上的分布图。其中有一个位于第1号连锁群上，命名为qSFW-1-2；三个位于第四号连锁群上，分别命名为qSFW-4-1、qSFW-4-2和qSFW-4-3；一个位于第5号连锁群上，命名为qSFW-5-1；一个位于第8号连锁群上，命名为qSFW-8-1；五个位于第10号连锁群上，命名为qSFW-10-1、qSFW-10-2、qSFW-10-3、qSFW-10-4和qSFW-10-5；一个位于第14号连锁群上，命名为qSFW-14-2。各位点的区间及解释的贡献率见表2。

表2稳定单果重性状QTL相关信息

本发明基于RAD-seq技术筛选获得大量带有基因序列的SNP标记，利用这些标记位点构建了龙眼高密度分子遗传图谱，并对龙眼单果重性状进行定位研究，获得了与龙眼单果重性状相关的功能标记，该发明在龙眼单果重性状分子标记辅助育种中具有良好的应用前景。

显然，本领域的技术人员可利用本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。