一种单项上皮组织肿瘤细胞渗液游离血红素显色液及制备方法

摘要

本发明公开了一种单项上皮组织肿瘤细胞渗液游离血红素显色液及制备方法，游离血红素以下简称FH，试剂由A液与B液组成。A液由过氧化脲、过氧化氢组成；B液由3，3’，5，5’‑四甲基联苯胺、二甲基亚砜、羟丙基‑β‑环糊精、6‑氧甲基喹啉、聚乙烯吡咯烷酮、吡啶、氢氧化钠、乙二胺四乙酸钠、乙醇组成。A液与B液均由磷酸二氢钠‑磷酸氢二钠缓冲液配制。A液和B液按体积比1:1混合而成，经过滤获得均一稳定的单一组分FH显色液。本发明为特殊单项FH显色试剂具有灵敏度高、特异性强、微量检测、便捷快速的特点，是国内唯一的常温下保存18个月的单项上皮组织肿瘤细胞游离血红素显色试剂，检测线性范围为6.1～150μg/L,最低检测限为6.1μg/L。

说明书

技术领域

本发明涉及生物体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种单项上皮组织肿瘤细胞渗液游离血红素显色液及制备方法。

背景技术

抑癌基因P53发生突变或缺失的肿瘤细胞中，在线粒体上“瓦博格效应”产生大量还原性辅酶Ⅱ(NADPH)，NADPH作为谷胱甘肽还原酶的辅酶，它可以使氧化型谷胱甘肽(GSSG)还原成为还原型谷胱甘肽(GSH),GSH作为供氢体在谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)催化下分解H2O2，再生成氧化型谷胱甘肽(GSSG)，同时发生芬顿反应(Fenton)产生以羟自由基为主活性氧族(reactive oxygen species,ROS)，使线粒体处的血红素蛋白(HP)受到攻击，HP蛋白亚基之间的作用力减弱，离子键、氢键、疏水键断裂，使多肽链的β折叠伸展、断裂，血红素口袋被打开，使那些原来包藏在蛋白疏水核内部的HP蛋白的活性基——血红素释放，成为游离血红素。游离血红素或亚铁血红素(free ferrous protopor-phyrin,FH)是上皮组织肿瘤在病理过程的“超早期“阶段，由其细胞内线粒体基膜上所产生的特异性肿瘤生物标志因子(Tumor Biomarker)，可因上皮肿瘤细胞性炎症渗出至上皮细胞性管腔的组织渗液(直肠渗液、宫颈渗液)中。上皮组织渗液包含脱落上皮细胞(正常细胞与肿瘤细胞)、游离血红素(FH)、活性氧族(ROS)等成分。因此，通过生理腔隙与管道(如肛管、直肠、阴道、宫颈管)，采用一次性无菌组织渗液拭子或组织细胞收集刷，即可实现对上皮细胞及渗液样本的有效采集，并满足FH微量检测对所需样本采集的要求。正常上皮细胞内及渗液中上皮细胞内游离血红素含量极低。当上皮细胞稳定性发生“超早期”恶性变化时，而其细胞学形态特征尚未出现明显异常改变之前，上皮细胞内游离血红素含量会明显增加，且与上皮细胞稳定性恶性变化程度呈正相关。因此，通过对上皮细胞内游离血红素(FH)检测即可克服目前基于细胞形态学检测技术，如巴氏涂片法、薄层液基细胞学检测技术(TCT)等容易发生早期筛查漏诊及误诊的“痛点”，实现对上皮细胞恶性肿瘤及癌前病变的超早期筛查。故检测上皮细胞内游离血红素含量可作为评估上皮细胞稳定性早期恶性变化(恶性肿瘤)风险程度的重要依据。目前虽有同类组织细胞渗液单组份游离血红素(FH)检测显色液报道，但仍存在诸多难以克服质量技术与临床应用的局限性：(1)由于缺乏亚铁血红素检测线性范围、最低检测限等关键定量检测技术指标，因此，属于简单的、灵敏度较低的“定性检测”技术；(2)传统FH显色液配方中不含有络合剂成分，其特征吸收峰值及波长数据不明确，因此其检测特异性与灵敏性均受质疑；(3)由于配方中存在稳定性与氧化性成分配比、3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)溶解性与稳定性难题，导致FH显色液难以实现常温下长期保存。鉴于上述诸多配方与技术缺陷原因，传统单一组份FH显色液的检测灵敏度、准确性、稳定性均存在明显“致命”缺陷，因此目前上皮组织细胞单组份游离血红素检测技术在临床上指导恶性肿瘤早期筛查的价值是极为有限。

检测原理：

检测上皮组织肿瘤细胞内及渗液中游离血红素原理是利用亚铁原扑啉具有类似过氧化物酶催化活性。在有供氧体(H

氧化还原反应原理如下：

DH2为供氢体(TMB)

H

D为显色反应产物

FH为游离血红素，具有类似过氧化物酶活性

TMB具有极强脂溶性，透过细胞膜到达细胞内线粒体，通过FH催化过氧化氢或过氧化脲，发生氧化还原反应，使TMB氧化形成蓝色发光物质。在染色过程中涉及游离血红素α、游离血红素β、游离血红素γ、Fe

发明内容

针对上述现有FH显色技术的不足，本发明所要解决的技术问题是：如何提供一种能够更好的检测上皮细胞稳定性的单项上皮组织肿瘤细胞滲液游离血红素显色液及制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：

一种单项上皮组织肿瘤细胞渗液游离血红素显色液及制备方法，由A液和B液等体积混合得到；所述A液各组分及浓度：过氧化脲摩尔浓度为4～20mmol/L，过氧化氢为21.2～50mmol/L；所述B液各组分及浓度：3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)的质量体积比为0.04～0.1％，二甲基亚砜(DMSO)体积比为1～1.5％，羟丙基-β-环糊精质量体积为0.2～0.9％，6-甲氧基喹啉在B液中体积比为0.6～1％，吡啶质量体积比为2～4％，氢氧化钠质量体积比0.012～0.018％，乙二胺四乙酸(EDTA)的质量体积比为0.091～0.105％，聚乙烯吡咯烷酮K30的质量体积比为0.06～2.4％，乙醇的体积比为0.4～0.5％，磷酸缓盐冲液摩尔浓度为0.01～0.1mol/L，pH为3.2～6.8。

进一步，制备步骤如下：

S1:制备缓冲液：取去离子水、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠制备磷酸盐缓冲液。

S2:制备A液：在磷酸缓冲液中加入过氧化脲，过氧化氢搅拌使所述过氧化物充分溶解，然后用磷酸缓冲液定容，避光密封暂存。

S3:制备B液：先称取聚乙烯吡咯烷酮，边搅拌边将聚乙烯吡咯烷酮加入磷酸缓冲液中，使所述聚乙烯吡咯烷酮充分溶解；然后加入6-甲氧基喹啉，搅拌混合；在室温下加入二甲基亚砜，充分搅拌；然后加入3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，搅拌使3，3’，5，5’-四甲基联苯胺充分溶解混合；加入羟丙基-β-环糊精，混合搅拌，直至溶液中不再有微小颗粒；加入吡啶混合搅拌，直至不再有微小颗粒，在加入氢氧化钠混合搅拌，再加入乙二胺四乙酸搅拌混合；再加入乙醇搅拌混合；最后，以磷酸缓冲液定容。

S4:A液与B液按照1:1混合。

S5:过滤获得均一稳定的溶液，所述溶液为单项游离血红素显色液。

S6:采用棕色玻璃瓶或者塑料瓶密封且避光保存在2～37℃的环境中。

进一步，所述磷酸缓冲液的浓度为0.01～0.1mol/L，由摩尔浓度为0.03mol/L的磷酸二氢钠和0.05mol/L的磷酸氢二钠溶于去离子水制备而成。

进一步，所述A液各组分及浓度：过氧化脲摩尔浓度为4mmol/L，过氧化氢为31.80mmol/L。

进一步，所述B液各组分及浓度：3，3’，5，5’-四甲基联苯胺的质量体积比为0.04％，所述二甲基亚砜体积比为1％，所述羟丙基-β-环糊精质量体积为0.20％，所述6-甲氧基喹啉在B液中体积比为0.60％，所述吡啶质量体积比为2％，所述氢氧化钠质量体积比0.018％，所述乙二胺四乙酸的质量浓度为0.09％，所述聚乙烯吡咯烷酮K30的质量体积比为1.20％，所述乙醇在体积比为0.4％。

进一步，所述过滤采用20～60um的滤纸过滤。

进一步，所述浓度均为化学纯或是分析纯。

进一步，所述单项上皮组织肿瘤细胞渗液游离血红素显色液与亚铁血红素标准样品进行反应，所述亚铁血红素标准样品在波长为659.24nm处，出现特征性吸收峰值，绘制亚铁血红素含量-吸光度标准曲线，检测线性范围为6.1～150μg/L，亚铁血红素最低检测限为6.1μg/L。

进一步，制备样本保存液，取去离子水、制备柠檬酸-柠檬酸钠样本保存缓冲液,其摩尔浓度为0.14mmol/L，由摩尔浓度为0.094mmol/L柠檬酸和摩尔浓度0.094mmol/L柠檬酸钠加去离子水而成。

有益效果：

1.提高检测特异性：B液中创造性地添加吡啶作为络合剂，与亚铁血红素标准品(FH)形成吡啶-血色原络合物，在波长为550～580nm处，出现明显的特征性吸收峰值，可以明显提升检测特异性。

2.提高检测灵敏度：B液中添加EDTA作为络合剂增加显色底物TMB反应性、6-甲氧基喹啉作为显色剂TMB的特殊增敏剂，增加FH与TMB反应性，显著提高本FH检测技术的灵敏度。通过采集病理确诊的直肠癌与宫颈癌滲液样本进行本单项FH显色液灵敏度及特异性试验表明：灵敏度为100％，特异性100％。

3.提高稳定性：(1)B液中添加DMSO、羟丙基-β-环糊精均作为特殊TMB促溶剂，同时羟丙基-β-环糊精有1个“内疏水、外亲水”的特殊立体环状结构，能够对脂溶性的TMB进行包合，从而提高TMB分子的水溶性、稳定性和抗氧化、抗光解能力，配合其他组份，可显著增加TMB水溶性，形成稳定显色溶液体系，配合其他成分，延长本单项FH显色液保存期。

(2)B液配方中添加稳定剂聚乙烯吡咯烷酮K30，显色液B配方中采用双过氧化物，并优化过氧化氢与过氧化脲配比，与其他成分配合，显著增加FH显色液稳定性，并通过37℃加速稳定性试验进一步证明：本单项FH显色液是目前国内唯一可在常温干燥下保存18个月的单项FH检测试剂。

4.提高检测准确性：国内首次绘制亚铁血红素标准品含量-TMB蓝色物质吸收光度标准曲线，并检测到在波长为652～659.24nm，其特征性吸收峰值为0.1240，证明本发明检测线性范围为6.1～150μg/L，最低检测限为6.1μg/L。由于本单项FH显色液的蓝色反应深浅度与标准品中亚铁血红素含量呈正比关系，因此通过目测观察蓝色深浅度即可推断样本中游离血红素区间含量；同时由于本单项FH显色液的蓝色反应物质吸光度(Abs λ/nm＝652)与样本中FH含量呈线性关系(图2)，因此，通过紫外分光光度计检测反应液中TMB蓝色物质的吸光度，即可计算出待测样本中的FH含量，计算公式为Y(吸光度值)＝-0.0061+0.00135X(待测样本中FH含量)(R

综上所述，本发明具有灵敏、精准、便捷和快速等特点，适合于各级医院，特别是中小型医院的病理科、检验科、临床科室、体检中心等科室恶性肿瘤早期筛查。

附图说明

图1为本发明具体实施方式所述的亚铁血红素紫外光谱特征吸收峰值、最大吸收波长。

图2为亚铁血红素标准品含量-吸收光度标准曲线。

其中，标号13为还原前-高铁血红素，标号12为还原后-亚铁血红素。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的详细说明。

具体实施时，如图1-2，一种单项上皮组织肿瘤细胞渗液游离血红素显色液及制备方法，所述由A液和B液等体积混合得到；所述A液各组分及浓度：过氧化脲摩尔为4～20mmol/L，过氧化氢为21.2～50mmol/L；所述B液各组分及浓度：3，3’，5，5’-四甲基联苯胺的质量体积比为0.04～0.1％，所述二甲基亚砜体积比为1～1.5％，所述羟丙基-β-环糊精质量体积比为0.2～0.9％，所述6-甲氧基喹啉在B液中体积比为0.6～1％，所述吡啶质量体积比为2～4％，所述氢氧化钠质量体积比0.012～0.018％，所述乙二胺四乙酸的质量体积比为0.091～0.105％，所述聚乙烯吡咯烷酮K30的质量体积比为0.06～2.40％，所述乙醇在体积比为0.4～0.5％，所述磷酸缓冲液摩尔浓度为0.01～0.1mol/L，调整pH为3.2～6.8，A液与B液按照1∶1混合，过滤采用20～60um的滤纸过获得均一稳定的溶液。

具体实施例一：标准曲线及检测灵敏度试验，见附表1和附表6。

附表1：FH显色液显色反应与亚铁血红素标准曲线

FH含量计算公式：Y＝-0.0061+0.00135x

Y＝吸光度(λ＝652nm)；x＝FH计算含量(μg/L)

检测线性范围：6.1～150μg/L

最低检测限：6.1μg/L

附表6：实施例一的FH显色液及样品缓冲液配方

FH显色液及样本缓冲液配方一

一种单项上皮组织肿瘤细胞渗液游离血红素显色液及制备方法：由A液和B液等体积混合得到，所述A液各组成分及浓度为过氧化脲4mmol/L，过氧化氢31.8mmol/L；所述B液各组份及浓度：所述3，3’，5，5’-四甲基联苯胺的质量体积比为0.06％，所述二甲基亚砜体积比为1％，所述羟丙基-β-环糊精质量体积比0.5％，所述6-甲氧基喹啉在B液中体积比为0.8％，所述乙二胺四乙酸的质量体积比为0.10％，所述吡啶质量体积比为2.20％，所述氢氧化钠质量体积比0.0179％，所述聚乙烯吡咯烷酮K30的质量体积比为1.2％，所述乙醇体积比为0.4％，所述磷酸缓冲液摩尔浓度为0.01mol/L，其pH为4。

制备样本保存液，取去离子水、制备柠檬酸-柠檬酸钠样本保存缓冲液，其摩尔浓度为0.14～0.22mmol/L，由摩尔浓度为0.094mmol/L柠檬酸和摩尔浓度0.094mmol/L柠檬酸钠加去离子水而成，pH为4。

灵敏度试验具体方法：亚铁血红素标准品分8组，其含量分别为：含量分别为：0μg/L，6.1μg/L，12.2μg/L,24.4μg/L,48.8μg/L,97.5μg/L,120μg/L,150μg/L。按标准样品与显色液体积比：2∶1比例加样，在反应150秒后，用紫外分光光度计每组读取10次，取得每组FH显色反应液平均吸光度值，绘制标准曲线，观测每组单项FH显色液颜色变化与标准含量对应关系，判断标准为：无色为阴性(-)；浅蓝色为可疑(+/-)；蓝色为弱阳性(+)；中度蓝色为阳性(++)；深蓝色为强阳性(+++)。

本试验证明：本FH显色液检测灵敏度为100％，检测线性范围：6.1μg/L～150μg/L,最低检测限为6.1μg/L，显色反应为浅蓝色～深蓝色(+/-～+++)。显色反应判定标准：FH检测值小于6.1μg/L，为无色；FH检测值≥6.1μg/L，出现浅蓝色反应(+/-)；FH检测值≥12.20μg/L，出现蓝色反应(+)；FH检测值≥24.40μg/L，出现中度蓝色反应(++)；FH检测值≥48.80～150μg/L，出现深蓝色反应(+++)。本显色反应深浅与标准品中FH含量呈正相关。由于本线性公式计算FH含量值与标准品FH实际含量几乎一致，因此本显色反应深浅与线性计算FH含量值可反映样本中实际FH含量水平。故本单项FH显色技术可作为一种灵敏、可靠、精准、便捷的FH定性或定量检测技术。

具体实施例二：标准曲线及检测灵敏度试验，见附表2。

附表2 FH显色液显色反应与亚铁血红素标准曲线

FH含重计算公式：Y＝-0.0061+0.00135x

Y＝吸光度(λ＝652nm)；x＝FH计算含量(μg/L)

检测线性范围：6.1～150μg/L

最低检测限：6.1μg/L

实施例二的FH显色液配方及制备方法：由A液和B液等体积混合得到，所述A液各组成分及浓度为过氧化脲20mmol/L，过氧化氢42.40mmol/L，所述B液包括3，3’，5，5’-四甲基联苯胺、二甲基亚砜、羟丙基-β-环糊精，6-甲氧基喹啉、乙二胺四乙酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、乙醇组成，所述3，3’，5，5’-四甲基联苯胺的质量体积比为0.1％，所述二甲基亚砜体积比为1.5％，所述羟丙基-β-环糊精质量体积比0.5％，所述6-甲氧基喹啉在B液中体积比为1％，所述乙二胺四乙酸的质量体积为0.105％，所述吡啶质量体积比为2％，所述氢氧化钠质量体积比0.0179％所述聚乙烯吡咯烷酮K30的质量体积比为2.4％，所述乙醇在B液中体积比为0.5％，磷酸缓冲液为0.1mol/L，pH为4。

样本保存液制备方法、检测灵敏度试验方法、显色判断标准同实施例一，本FH显色液检测线性范围：6.1μg/L～150μg/L，最低检测限为6.1μg/L，显色反应为浅蓝色～深蓝色。本显色反应判断标准：FH检测值小于6.1μg/L，为无色；FH检测值≥6.1μg/L，出现浅蓝色反应(+/-)；FH检测值≥12.20μg/L，出现蓝色反应(+)；FH检测值≥24.40μg/L，出现中度蓝色反应(++)；FH检测值≥48.80～150μg/L，出现深蓝色反应(+++)。本显色反应深浅与标准品中FH含量呈正相关。由于本线性计算公式计算的FH含量值与标准品FH实际含量几乎一致，因此本显色反应深浅与线性公式计算FH含量值可反映样本中实际FH含量水平。故本单项FH显色技术可作为一种灵敏、可靠、稳定、精准的FH定性或定量检测方法。

具体实施例三：上皮组织细胞渗液样本FH检测灵敏度及含量检测试验，见附表3。

附表3：上皮组织和肿瘤细胞渗液样本FH检测灵敏度及含量检测试验

FH含量计算公式：Y＝-0.0061+0.00135x

Y＝吸光度(λ＝652nm)；x＝FH计算含量(μg/L)

检测线性范围：6.1～150μg/L

最低检测限：6.1μg/L

CINI～III：宫颈上皮内瘤变I～III

本实施例中，通过一次性无菌直肠细胞渗液采样拭子或一次性无菌宫颈渗液细胞刷无创性地采集经临床和病理检查确诊的宫颈病变渗液样本(宫颈癌、CINI～III、正常宫颈渗液)及直肠病变渗液(正常直肠、直肠息肉、直肠癌细胞渗液)样本各十例。按实施例一显色剂配方进行试验。首先，将采集的上皮细胞及肿瘤细胞渗液样本保存在柠檬酸缓冲液样本保存瓶中，然后取出一份2ml且含有上皮组织细胞及肿瘤细胞渗液的柠檬酸缓冲液，将其加入到两份1ml单项游离血红素显色液试剂瓶中，反应150秒钟后，观察FH试剂瓶中显色液的显色情况，判断标准、FH显色液配方及制备方法与具体实施例一相同。

本临床检测试验结果表明：上皮组织恶性肿瘤及癌前病变FH检测灵敏度为100％，显色反应为阳性(+～+++)。本试验结果提示：当FH检测值≥6.1μg/L，出现浅蓝色反应时(+/-)，属于极低风险，不定期随访或筛查；当FH检测值≥12.20μg/L，出现蓝色反应时(+)，属于低度风险，应定期随访与筛查；当FH检测值≥24.40μg/L，出现中度蓝色反应时(++)，属于中度风险；当FH检测值≥48.80～150μg/L，出现深蓝色反应时(+++)，属于高度风险；一般认为，当FH检测值≥24.40μg/L，出现中度蓝色反应时(++)，建议临床医生采取进一步检测，如TCT、阴道镜、宫颈活检，以明确早期诊断，及时早期治疗。

由于其显色深浅以及线性计算FH检测值可反映上皮细胞及肿瘤细胞内实际FH含量水平高低，且与上皮组织肿瘤风险程度呈正相关，因此显色深浅以及线性计算FH检测值可作为临床上评估超早期上皮组织恶性肿瘤风险的客观指标，并对指导临床进一步早期筛查、早期诊断与早期治疗具有重要价值。故本单项FH显色技术可作为一种灵敏、精准、无创、快速的超早期上皮组织恶性肿瘤常规筛查技术。

具体实施例四：上皮组织及肿瘤细胞渗液样本FH检测特异性试验，见附表4。

附表4：上皮组织及肿瘤细胞渗液样本FH检测特异性试验

试管中分别加入人血白蛋白、人血红细胞稀释液标准品(1ml红细胞/4ml生理盐水稀释)、经病理检查排除上皮组织恶性肿瘤的正常宫颈渗液、经病理检查排除上皮组织恶性肿瘤的正常直肠渗液标本各十份，每管按2ml，再加入本发明实施例一制得本FH显色试剂1ml，在反应150秒后，观察FH试剂瓶中显色液的显色情况，FH显色液配方与制备方法、判断标准与具体实施例一相同。本FH检测特异性试验结果表明：人血白蛋白、正常宫颈渗液、正常直肠渗液试管均为阴性，证明本发明FH显色液检测特异性为100％。

观察到人血红细胞稀释液标准品试管分别呈浅蓝色(+/-，可疑)、蓝色(弱阳性，+)、中度蓝色(中阳性，++)或深蓝色(强阳性，+++)、深黄色或深棕色(假阳性，++++)。在试管中按编号分别加入人血红细胞稀释液标准品十份，加入血红细胞稀释液体积量分别为：0μl、2μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl、40μl、50μl。人血红细胞干扰试验结果表明：由于人血红细胞含有大量血红蛋白，血红蛋白分子中含有亚铁原扑啉，当人血红细胞稀释液体积量超过5μl，出现深蓝色，对FH显色反应产生干扰；当人血红细稀释液体积量超过20μl，当出现黄绿色、深黄色或深棕色时，表明上皮组织细胞渗液样本中混有红细胞成分、炎性分泌物或样本出现红色时，检测结果视为假阳性，采样时应避免局部出血或更换采样部位，重新采集样本进行检测。

具体实施例五：FH显色液稳定性试验，见附表5。

附表5：37℃放置不同时间单项FH显色液加速稳定性试验

在37℃环境中，分别本FH显色液放置当天、30天、60天、100天后，取7组不同含量的亚铁血红素标准品2ml，按组分别加入至1ml，按实施例一显色液配方所制备的FH显色液中，每组重复检测灵敏度，获取吸收光度平均值，并观察颜色变化，判断标准与具体实施例一相同。试验结果表明：显色液配制后，在37℃环境下放置100天，其平均吸光度仍可保持98.70％，各组显色反应结果仍为：浅蓝色～深蓝色(+/-～+++)。除此以外，对本FH显色液特异性、准确度进行试验，其检测结果与新配制试剂几乎一致，表明本发明FH显色液可在常温下实现稳定保存18个月。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解；其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。