一种通用的猪支原体抗原含量快速检测试剂盒及其应用

摘要

本发明提供一种通用的猪支原体抗原含量快速检测试剂盒及其应用，属于生物工程技术领域。该试剂盒包括采用猪支原体抗原包被的酶标板和兔抗EF‑Tu血清；所述兔抗EF‑Tu血清是采用重组EF‑Tu蛋白免疫新西兰兔，采血分离血清后所得，所述重组EF‑Tu蛋白的序列如SEQ ID NO:4所示。本发明试剂盒，该方法耗时短、准确性高、能检测灭活疫苗中猪支原体抗原含量。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种通用的猪支原体抗原含量快速检测试剂盒及其应用。

背景技术

支原体是能够在自然界独立生存的最小原核生物，迄今分离出的支原体达190余种，遍布于世界各地，种类多，影响面广，危害很大。其中猪支原体在兽医学上是一类重要的病原微生物，支原体病一般发病进程缓慢，发病率及死亡率较低，但能给生产造成巨大的经济损失。如由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)引起的猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS)，广泛发生于世界各地，临床症状主要为咳嗽和气喘，一般患猪死亡率不高，但严重降低饲料转化率，长期生长发育不良，造成巨大的经济损失。其他可危害猪只健康的还有猪鼻支原体(可引起多发性浆膜炎、关节炎等临床症状，导致猪生长性能下降)、猪絮状支原体(可引起支气管发生轻微病变)、猪滑液支原体(可引起10周龄以上小猪关节炎)等。

目前，疫苗接种是预防控制猪支原体感染的关键措施，在疫苗研制过程中，抗原含量是重要的质量控制指标，与疫苗的实际效力密切相关。对于猪支原体抗原含量的测定，通常采用标准的颜色变化单位(CCU)计数法，但这种方法检测的是培养收获时活的支原体的量，因此只适合于活疫苗产品的质量评价，不适合用于灭活疫苗生产及成品疫苗的有效抗原含量检测，同时该方法测定周期长，还会受到检测血清、检测容器、平行数测定、采样时间等影响。

现有技术中缺乏能够用于灭活疫苗的高效、准确检测猪支原体抗原含量的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术之缺陷，提供一种通用的猪支原体抗原含量快速检测试剂盒，以解决支原体传统定量检测方法费时长、准确性低、不能检测灭活疫苗中猪支原体抗原含量的弊端。

本发明的另一目的是提供以非诊断为目的采用所述试剂盒检测猪支原体抗原含量的方法，该方法耗时短、准确性高、能检测灭活疫苗中猪支原体抗原含量。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

一种通用的猪支原体抗原含量快速检测试剂盒，包括采用猪支原体抗原包被的酶标板和兔抗EF-Tu血清；所述兔抗EF-Tu血清是采用重组EF-Tu蛋白免疫新西兰兔，采血分离血清后所得，所述重组EF-Tu蛋白的序列如SEQ ID NO:4所示。

在本发明中，所述酶标板采用猪支原体裂解液进行包被。

在本发明中，所述重组EF-Tu蛋白是通过诱导表达携带EF-Tu蛋白编码基因的重组菌所得。

在本发明中，所述酶标板采用猪支原体裂解液进行包被后采用含有明胶的PBS缓冲液封闭。

在本发明中，所述试剂盒还包括猪支原体抗原菌液标准品、PBST溶液和羊抗兔HRP-IgG、显色液和终止液。

在本发明中，PBST溶液是含体积百分浓度为0.05％Tween-20的PBS缓冲液；所述羊抗兔HRP-IgG购自武汉博士德生物公司，产品编号是BA1054。

在本发明中，所述猪支原体包括猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪絮状支原体、猪滑液支原体。

本发明还提供以非诊断为目的采用所述试剂盒检测的猪支原体抗原含量的方法，包括如下步骤：

(1)在猪支原体抗原包被的酶标板中，设置待检样品孔和空白对照样品孔，在待检样品孔中加入待检样品，在空白对照样品孔中加入PBS缓冲液，然后每孔加入兔抗EF-Tu血清，孵育后PBST溶液洗涤；

(2)每孔加入羊抗兔HRP-IgG，孵育；

(2)PBST溶液洗涤后，加入TMB底物显色液；

(3)加入终止液终止反应，在450nm处读取吸光值；

(4)根据标准曲线计算猪支原体抗原含量。

本发明还提供所述试剂盒在检测猪支原体培养物或者猪支原体疫苗产品中抗原含量的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明通用的猪支原体抗原含量快速检测方法实现了对不同支原体含量的测定，检测时间仅需2-4小时，与常用的CCU计数法相比，大大缩短了生产周期，提高了生产效率。

(2)本发明不仅可检测培养菌液或活疫苗中猪支原体抗原含量，同时可检测浓缩抗原和灭活疫苗中的抗原含量。

(3)本发明操作简单，重复性好，准确性高，结果判定计算简单。

附图说明

图1.兔抗EF-Tu血清的鉴定，1：Mhp 168全菌蛋白的SDS-PAGE电泳；2：兔抗EF-Tu血清与Mhp 168全菌蛋白的Western Blot鉴定。

图2.标准品的标准曲线，横坐标为稀释倍数的对数值(底数为2)，纵坐标为B/B0。

图3RP值与CCU测定结果相关性分析，横坐标为CCU的对数值(底数为10)，纵坐标为RP值。

图4是不同猪支原体的标准曲线，其中A为猪鼻支原体标准曲线，B为猪絮状支原体标准曲线，C为猪滑液支原体标准曲线，横坐标为稀释倍数的对数值(底数为2)，纵坐标为B/B0。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例中所用的试剂及来源：大肠杆菌DH5a购自Takara公司；弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂、IPTG、Tween20均购自美国Sigma-Aldrich公司；96孔可拆卸酶标板购自Solarbio公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、TMB显色液(产品编号为P0209)购自碧云天生物科技有限公司；羊抗兔HRP-IgG购自武汉博士德生物公司(产品编号为BA1054)、其他所用化学试剂均为分析纯。

实施例1制备兔抗EF-Tu血清。

从NCBI网站分别下载猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪絮状支原体、猪滑液支原体的EF-Tu序列，使用DNAMAN软件进行氨基酸序列的同源性分析，结果显示四种支原体的EF-Tu序列相对保守，同源性91.58％。根据Gen Bank上公布的猪肺炎支原体(Mhp)168株基因组信息(Gen Bank登录号CP002274)，设计各EF-Tu同源区域的原核表达引物P1和P2，以扩增EF-Tu序列中猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪絮状支原体、猪滑液支原体同源性较高的片段。

P1的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)如下：5’-CGCGGATCCTTTGATCGTTCCAAAGAACAT-3’。

P2的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)如下：5’-CCGCTCGAGAATAATTTCGGTAACTGTTCC-3’。

以Mhp 168株基因组DNA作为模板，以P1和P2为引物，PCR扩增1170bp的目的基因，经双酶切、连接后转化大肠杆菌XL10感受态细胞。提取重组质粒进行测序，目的基因的序列如SEQ ID NO:3所示，所编码的重组EF-Tu蛋白的序列如SEQ ID NO:4所示。将目的基因插入pET-32a载体中，将测序正确的重组质粒转化入BL21感受态细胞，经IPTG诱导后进行原核表达。采用镍柱按照常规方法对重组EF-Tu蛋白进行纯化，纯化后的蛋白超滤换液后，使用BCA法测定浓度，调整终浓度为2mg/mL，分装后-70℃以下保存备用。

选择2-2.5kg健康新西兰大白兔5只，将2mg/mL的重组EF-Tu蛋白与弗氏完全佐剂按照体积比为1:1混合，乳化后对上述5只新西兰大白兔进行首免，每只免疫1mL(含抗原量1mg)，背部皮下多点注射。将2mg/mL的重组EF-Tu蛋白与弗氏不完全佐剂按照体积比为1:1混合，乳化后用于二免、三免和四免，每次免疫剂量均为每只免疫1mL(含抗原量1mg)。相邻两次免疫之间间隔14天。四免后一周，无菌心脏采血，无菌条件下分离血清，得到兔抗EF-Tu血清。以猪肺炎支原体全菌蛋白作为检测抗原采用Western Blot检测所得兔抗EF-Tu血清的抗体特异性。结果如图1所示，兔抗EF-Tu血清与猪肺炎支原体全菌蛋白发生了特异性反应，证明兔抗EF-Tu血清的特异性良好。将兔抗EF-Tu血清小量分装，-70℃以下低温保存备用。

实施例2竞争ELISA定量检测方法建立

待检样品为猪肺炎支原体NJ株菌液，批号：191025，应用标准的颜色变化单位(CCU)计数法(D.Calus,D.Maes,K.Vranckx,et al.Validation of ATP luminometry forrapid and accurate titration of Mycoplasma hyopneumoniae in Friis medium anda comparison with the color changing units assay[J].Journal ofMicrobiological Methods,2010,83:335–340.)进行测定，含量为10

(1)采用竞争ELISA定量检测方法检测猪肺炎支原体NJ株，具体包括如下步骤：

a.包被：用包被缓冲液(pH 9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液)将猪肺炎支原体NJ株抗原稀释至10μg/ml作为包被液，然后按照100μl/孔加入到96孔酶标板的各孔中，4℃包被过夜。猪肺炎支原体NJ株抗原制备方法如下：猪肺炎支原体NJ株菌液按1:10的比例(体积比)接种于KM2液体培养基，37℃静置培养48-72h，收获培养物，离心20分钟，将沉淀用PBS缓冲液洗2次，第2次清洗后，沉淀用少量的PBS缓冲液再次悬浮。超声裂解，得到裂解液，即为猪肺炎支原体NJ株抗原，用BCA试剂盒进行蛋白质的含量测定，作为竞争ELISA定量检测方法中的包被抗原，-70℃保存。

b.封闭：弃去包被液，用PBST溶液洗涤3次，加入含1％(质量百分浓度)明胶的PBS缓冲液作为封闭液，200μl/孔，37℃作用2h。

c.加样：弃去封闭液，用PBST溶液洗涤3次后，在空白对照样品孔中加入PBS缓冲液，在待测样品孔中加入待检样品，50μl/孔，各样品做2个重复，然后每孔加入50μl的兔抗EF-Tu血清(实施例1制备)，37℃孵育2h；

d.加酶标抗体：弃去加样，用PBST溶液洗涤3次后，加入采用PBST溶液按照稀释度为1:10000稀释的羊抗兔HRP-IgG(购自武汉博士德生物公司，产品编号为BA1054)，100μl/孔，37℃孵育1h；

e.显色：弃去酶标抗体，用PBST溶液洗涤3次后加入TMB底物显色液(购自碧云天生物科技有限公司，产品编号为P0209)，100μl/孔，室温避光反应10min；

f.终止：用2M的硫酸水溶液(终止液)终止反应，50μl/孔，450nm处读取吸光值；

g.结果判定：根据y＝B/B0计算出y，其中B0为空白对照样品孔的吸光值，B为待测样品孔的吸光值，然后根据标准曲线图y＝0.0963x+0.1676计算出x，根据相对效力RP值＝1/2

上述竞争ELISA定量检测方法中，包被缓冲液是含有1.59g/L的Na

(2)竞争ELISA定量检测方法中标准曲线图的制作

制作标准曲线：将采用CCU计数法检测的浓度为10

实施例3竞争ELISA定量检测方法检测猪肺炎支原体NJ株的重复性评价

采用实施例2中竞争ELISA定量检测方法，以同一批次ELISA反应板(实施例2标题(1)中步骤b所得)对5批次猪肺炎支原体NJ株抗原样品(猪肺炎支原体NJ株采用KM2培养基培养所得菌液)进行检测，每批次抗原样品同时采用同一批次中3块不同ELISA反应板分别检测一次，计算抗原含量，计算板内变异系数。

另外，采用实施例2中竞争ELISA定量检测方法，以3批次ELISA反应板，检测5批次猪肺炎支原体NJ株抗原样品(猪肺炎支原体NJ株采用KM2培养基培养所得菌液)，每批次抗原样品同时采用3块不同批次的ELISA反应板检测，计算5批次抗原每组变异系数。

结果(表1)显示该方法的板内和板间的重复变异系数平均值分别为3.74％和4.79％，重复性好。

表1竞争ELISA定量检测方法的重复性分析

实施例4竞争ELISA定量检测方法用于检测活疫苗支原体抗原的含量

运用实施例2中竞争ELISA定量检测方法，检测10批次猪肺炎支原体NJ株抗原样品(猪肺炎支原体NJ株采用KM2培养基培养所得菌液)，同时使用CCU计数法进行测定，采用相关分析对比测定结果。结果如表2和图3，RP值与CCU计数法检测结果成正相关关系，相关系数R

表2多批次猪肺炎支原体NJ株抗原样品中抗原含量测定结果

实施例5竞争ELISA定量检测方法用于疫苗成品检测

将复苏的猪肺炎支原体NJ株菌液按体积比为1:9接种至1500mL的KM2培养基，进行扩大培养，待菌液生长至对数期时，取部分菌液利用CCU计数法测定抗原含量。在其余菌液中，加入终浓度(质量百分浓度)为0.005％的硫柳汞，37℃灭活24h。将灭活后的菌液在12000r/min、4℃离心30min，收集菌体沉淀。将菌体沉淀用无菌PBS缓冲液洗涤2次，离心弃上清。向沉淀内加入30mL的PBS缓冲液混匀，得到的悬浮液即Mhp抗原。

按照上述方法制备3批次Mhp抗原，分别按照以下方法制备猪肺炎支原体灭活疫苗：(1)油相：将白油(埃索白矿油52，即MARCOL52)和司本80按照体积比为94：6混合均匀，高压灭菌，得到油相。(2)吐温-80：高压灭菌。(3)水相：将96体积份的Mhp抗原，置37℃放置约20min，使抗原温度达到37℃左右，加入4体积份的吐温80，充分振荡(10000r/min搅拌)使吐温溶解，如未完全溶解可继续37℃放置约20min，置4℃消除泡沫，得到水相。(4)乳化：将油相倒入乳化容器中，10000r/min搅拌，边搅拌边将水相以水相：油相(体积比)＝1：2.5比例缓慢加入，最后20000r/min乳化1.5-2min，得到猪肺炎支原体灭活疫苗。

对3批次的灭活疫苗进行滴水试验，结果不破乳。具体方法如下：取10ml猪肺炎支原体灭活疫苗于3000r/min离心10min，析出水相低于0.5ml，说明制备的猪肺炎支原体灭活疫苗质量合格。

采用实施例2中竞争ELISA定量检测方法检测本实施例制备的3批次猪肺炎支原体灭活疫苗。首先，将灭活疫苗和丙酮按体积比为1:9混合，室温放置10分钟，然后在4℃、15000g离心15min，吸弃液相，沉淀以丙酮洗涤2次，室温干燥约15min，加适当体积的去离子水复溶，得到破乳后的疫苗抗原。运用实施例2中竞争ELISA定量检测方法检测破乳后疫苗抗原中的抗原含量，RP值分别为1.05、1.13、1.11，分别是制苗前抗原含量的90.23％、93.2％、94.1％，提示3批次疫苗抗原含量合格。因此，实施例2中竞争ELISA定量检测方法实现了对猪支原体肺炎灭活疫苗抗原含量的定量测定，填补了现有CCU计数法无法定量检测灭活疫苗中抗原的缺陷，使疫苗质量得以保证。

实施例6本发明方法与其他ELISA测定方法的比较

比较实施例2中竞争ELISA定量检测方法与现有报道的其他ELISA检测方法的检测效果。

采用KM2液体培养基培养2批次猪肺炎支原体NJ株菌液样品，采用离心法将总体积浓缩至原体积的1/50，然后离心，取上清和沉淀分别测定抗原含量。抗原含量测定分别运用本发明实施例2中竞争ELISA定量检测方法(记为本发明方法)、对照方法1(申请号为201610620237.9的发明专利申请中公开的猪肺炎支原体活菌滴度测定方法)以及对照方法2(申请号为201910370182.4的发明专利申请中公开的猪肺炎支原体固相竞争ELISA试剂盒)对样品进行检测，同时以KM2培养基为培养基对照样品进行同步检测，考察培养基是否会对猪肺炎支原体含量检测有影响。同一待检品采用上述3种方法检测时，以相同的标准品为参考，换算相对效力RP值。结果如表3所示，对照方法1在上清中可检测到大量抗原，当猪肺炎支原体NJ株菌液进行离心浓缩时仅浓缩菌体，上清液并不会被浓缩，因此浓缩后的沉淀测定值无法正确反映抗原浓缩的倍数，使用具有局限性；对照方法2在2批次KM2培养基中有1批次也能测定到，说明该方法可能存在一定的非特异性影响，培养基的品质不同可能会影响检测的准确性；本发明方法只有沉淀检测为阳性，浓缩抗原离心后的上清和KM2培养基对照几乎检测不到，因此本发明方法可准确反应菌体抗原的实际含量，且不受培养基品质的影响。

表3各方法检测猪肺炎支原体抗原含量的结果比较

实施例5采用本发明方法检测其他支原体的效果评价

分别采用KM2培养基培养猪鼻支原体HUB-1株(NCBI基因组登录号为CP002170)、猪絮状支原体(ATCC27716)，采用ATCC243培养基培养猪滑液支原体(ATCC 27095)，待培养物生长好可收获。(1)将各支原体培养物按照如下方法制备相应的包被原：将支原体样品以10000g离心20分钟，沉淀用PBS缓冲液洗2次，第2次清洗后，沉淀用少量的PBS缓冲液再次悬浮，采用超声破碎，得到支原体裂解液,作为包被抗原，用BCA试剂盒测定支原体裂解液中蛋白质的含量，分装后-70℃保存。(2)将各支原体培养物按照如下方法制备标准品：将采用CCU计数法检测的浓度为10

另外分别培养猪鼻支原体(HUB-1株，NCBI基因组登录号为CP002170)、猪絮状支原体(ATCC27716)、猪滑液支原体(ATCC 27095)，待培养物生长好后，收获待检测样品。

将本发明方法中的猪肺炎支原体NJ株抗原分别替换为猪鼻支原体HUB-1株、猪絮状支原体(ATCC27716)或猪滑液支原体(ATCC 27095)的包被抗原，其他不变，即可用于检测相应的支原体待测样品的抗原含量，例如包被抗原如果是猪鼻支原体HUB-1株，那么就用于检测猪鼻支原体。首先，按照本发明方法，采用各支原体的标准品制作各支原体的标准曲线(图4)。然后将每种猪支原体待测样品运用本发明方法分别检测抗原含量。结果显示，检测到的猪鼻支原体待测样品中抗原含量RP值为2.953、猪絮状支原体待测样品中抗原含量RP值为1.842、猪滑液支原体待测样品中抗原含量RP值为1.057。上述结果说明本发明检测方法不仅可用于猪肺炎支原体抗原含量的检测，也可用于猪鼻支原体、猪絮状支原体、猪滑液支原体抗原含量的检测，通用性好。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种通用的猪支原体抗原含量快速检测试剂盒及其应用

<130> 20201116

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> artificial

<220>

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<400> 1

cgcggatcct ttgatcgttc caaagaacat 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> P2

<400> 2

ccgctcgaga ataatttcgg taactgttcc 30

<210> 3

<211> 1170

<212> DNA

<213> 猪支原体

<400> 3

tttgatcgtt ccaaagaaca tattaatatt ggaacaattg gtcatgttga ccatggaaaa 60

acaacactaa cagcagcaat ttcaactgtt ttggcaaaaa gaggactcgc ggaggcaaag 120

gattatgcct caattgatgc agctcctgaa gaaaaagcac gaggaattac aattaatacc 180

gcccatattg aatatagcac tgacaaacgg cactatgccc atgttgattg cccaggtcat 240

gccgattata taaaaaatat gatcaccgga gcggcccaaa tggatggagc aattttagtg 300

gttgcagcaa ccgatggccc aatgcctcaa actcgtgaac acattttatt atcaaaacaa 360

gttggtgtcc caaaaatggt tgttttcctt aataaaattg acttacttga aggcgaagaa 420

gaaatggttg atttagttga ggtcgaaatt cgcgaacttc tttcttctta tgattttgat 480

ggcgataata ctccaattat tcggggatct gctcgtgggg cccttgaagg aaaacctgaa 540

tgggaggcaa aagtacttga attgatggac gcagttgatt cttatattga ctcacctgtt 600

cgggaaatgg ataaaccctt tttgatggcc gttgaggatg tttttacaat tacaggacgt 660

ggaaccgtag caacgggaaa agttgaaaga ggtcaagtta aactaaacga agaagtggaa 720

attgtgggtt atcgcgaaga acctaaaaag accgtaatca ccggaattga aatgtttaat 780

aaaaatcttc aaactgcgat ggctggggat aatgccggtg ttctcctacg tggagtagat 840

cgaaaagata tcgaacgtgg tcaggttatt gcaaaaccaa aaacaattat accgcataca 900

aaatttaaag ctgcaattta tgcccttaaa aaagaagaag gtggaaggca tacaccattt 960

ttcaaaaatt ataaaccaca attttatttt cgaactaccg atgtaacagg cggaatcgag 1020

tttgaaccag gtcgcgagat ggtaattccg ggggataatg ttgatcttac cgttgaatta 1080

attgccccaa ttgccgttga gcagggaacc aaattctcga tccgagaagg tggcagaacc 1140

gtgggtgccg gaacagttac cgaaattatt 1170

<210> 4

<211> 390

<212> PRT

<213> 猪支原体

<400> 4

Phe Asp Arg Ser Lys Glu His Ile Asn Ile Gly Thr Ile Gly His Val

1 5 10 15

Asp His Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Ala Ile Ser Thr Val Leu Ala

20 25 30

Lys Arg Gly Leu Ala Glu Ala Lys Asp Tyr Ala Ser Ile Asp Ala Ala

35 40 45

Pro Glu Glu Lys Ala Arg Gly Ile Thr Ile Asn Thr Ala His Ile Glu

50 55 60

Tyr Ser Thr Asp Lys Arg His Tyr Ala His Val Asp Cys Pro Gly His

65 70 75 80

Ala Asp Tyr Ile Lys Asn Met Ile Thr Gly Ala Ala Gln Met Asp Gly

85 90 95

Ala Ile Leu Val Val Ala Ala Thr Asp Gly Pro Met Pro Gln Thr Arg

100 105 110

Glu His Ile Leu Leu Ser Lys Gln Val Gly Val Pro Lys Met Val Val

115 120 125

Phe Leu Asn Lys Ile Asp Leu Leu Glu Gly Glu Glu Glu Met Val Asp

130 135 140

Leu Val Glu Val Glu Ile Arg Glu Leu Leu Ser Ser Tyr Asp Phe Asp

145 150 155 160

Gly Asp Asn Thr Pro Ile Ile Arg Gly Ser Ala Arg Gly Ala Leu Glu

165 170 175

Gly Lys Pro Glu Trp Glu Ala Lys Val Leu Glu Leu Met Asp Ala Val

180 185 190

Asp Ser Tyr Ile Asp Ser Pro Val Arg Glu Met Asp Lys Pro Phe Leu

195 200 205

Met Ala Val Glu Asp Val Phe Thr Ile Thr Gly Arg Gly Thr Val Ala

210 215 220

Thr Gly Lys Val Glu Arg Gly Gln Val Lys Leu Asn Glu Glu Val Glu

225 230 235 240

Ile Val Gly Tyr Arg Glu Glu Pro Lys Lys Thr Val Ile Thr Gly Ile

245 250 255

Glu Met Phe Asn Lys Asn Leu Gln Thr Ala Met Ala Gly Asp Asn Ala

260 265 270

Gly Val Leu Leu Arg Gly Val Asp Arg Lys Asp Ile Glu Arg Gly Gln

275 280 285

Val Ile Ala Lys Pro Lys Thr Ile Ile Pro His Thr Lys Phe Lys Ala

290 295 300

Ala Ile Tyr Ala Leu Lys Lys Glu Glu Gly Gly Arg His Thr Pro Phe

305 310 315 320

Phe Lys Asn Tyr Lys Pro Gln Phe Tyr Phe Arg Thr Thr Asp Val Thr

325 330 335

Gly Gly Ile Glu Phe Glu Pro Gly Arg Glu Met Val Ile Pro Gly Asp

340 345 350

Asn Val Asp Leu Thr Val Glu Leu Ile Ala Pro Ile Ala Val Glu Gln

355 360 365

Gly Thr Lys Phe Ser Ile Arg Glu Gly Gly Arg Thr Val Gly Ala Gly

370 375 380

Thr Val Thr Glu Ile Ile

385 390