一种青海大黄下胚轴组培与快繁方法

摘要

本发明公开了一种青海大黄下胚轴组培与快繁方法，包括如下步骤：(1)外植体灭菌处理；(2)初代培养基筛选；(3)下胚轴愈伤组织诱导；(4)下胚轴愈伤组织增殖培养；(5)下胚轴愈伤组织芽分化；(6)生根培养；(7)组培苗移栽；本发明以优质青海大黄种子为外植体，通过灭菌处理、初代培养、愈伤组织诱导、愈伤组织增殖培养、愈伤组织芽分化、生根培养和组培苗移栽，使得下胚轴愈伤组织诱导率可达90％，愈伤组织增殖系数可达4.3，组培苗移栽成活率可达95％，本发明能够缩短繁殖周期，提高繁殖效率，可为后续转基因与遗传改良研究提供理论基础与技术支持，另外，还可为以后对青海大黄系统研究、种苗商业化生产及药用价值挖掘提供依据。

说明书

技术领域

本发明涉及植物组培技术领域，尤其涉及一种青海大黄下胚轴组培与快繁方法。

背景技术

大黄(Rheum palmatum L.)是蓼科大黄属的多年生草本植物，是我国传统的中草药，具有极高的药用价值。大黄干燥根和根茎，性味苦、寒，药效广泛，《中国药典》2015年版描述其功效“泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、利湿退黄”。古代，大黄常以贴膏外用或水煎液内服，当今，大黄方剂在治疗儿科、外科、妇科等临床常见病以及急、危、重症及疑难病方面都具有显著功效，主要包括大便秘结、胃肠积滞、湿热泻痢、目赤、痈肿疔疮、水火烫伤、活血化淤、湿热黄疸、急性胰腺炎等。

青海大黄是唐古特大黄的优质变种，由于其生长在海拔高的青海、西藏地区，地域局限性大，加之传统播种繁殖方式具有周期长、繁殖系数低等局限性。近年来，随着青海大黄需求量的日益增长，传统的播种育苗手段已不能满足市场的需求。因此，急需开发一种青海大黄下胚轴组培与快繁方法以解决上述技术问题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种青海大黄下胚轴组培与快繁方法，以优质青海大黄种子为外植体，通过灭菌处理、初代培养、愈伤组织诱导、愈伤组织增殖培养、愈伤组织芽分化、生根培养和组培苗移栽，采用不同激素培养基配比，使得青海大黄下胚轴愈伤组织诱导率可达90％，愈伤组织增殖系数可达4.3，组培苗移栽成活率可达95％，通过对青海大黄组培快繁体系的建立，能够缩短繁殖周期，提高繁殖效率，可用于青海大黄的商业化生产，更好地发挥其药用价值，同时也为后续青海大黄系统研究及遗传改良工作提供了基础。

为了实现上述目的，本发明提供的一种青海大黄下胚轴组培与快繁方法，包括以下步骤：

(1)外植体灭菌处理：选取饱满的青海大黄种子作为外植体，先采用蒸馏水浸泡3h，并在操作台剥壳去翅，用无菌滤纸滤干后置于50ml离心管内，用75％乙醇充分浸泡20s，用ddH

(2)初代培养基筛选：将步骤(1)的待用无菌外植体接种到初代培养基中，种子胚轴朝下，1/3种子浸没在培养基中，光照培养箱温度为20±1℃，光照培养16h/d，暗培养8h/d，光强阈值为4800～6000lx，培养30d后萌发生长成苗；

(3)下胚轴愈伤组织诱导：将步骤(2)获得的无菌苗放入无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干表面水分，使用无菌手术刀切分，取下胚轴接种到诱导培养基中，光照培养箱温度为20±1℃，暗培养7d，光照培养8d，光强阈值为4800～60001x，培养15d后诱导出愈伤组织；

(4)下胚轴愈伤组织增殖培养：将步骤(3)诱导出的下胚轴愈伤组织移栽到增殖培养基中培养20d；

(5)下胚轴愈伤组织芽分化：将步骤(4)的下胚轴愈伤组织移栽到芽分化培养基中，培养15d后诱导出芽；

(6)生根培养：将步骤(5)的无菌芽切分为单株，每株为2～3片叶片，移栽到生根培养基中，光照培养箱温度为20±1℃，光照培养16h/d，暗培养8h/d，光强阈值为4800～6000lx，培养14d后得到长势良好的青海大黄组培苗；

(7)组培苗移栽：将步骤(6)得到的生根苗去除根部培养基后移栽至装有营养基质土的花盆中，室温25℃，光照12h/d，湿度55％-65％，每周喷施一次花多多1号，2000倍稀释。

优选地，所述步骤(2)中，初代培养基为：MS4.43g/L+6-BA(6-苄基氨基嘌呤)1.0mg/L+NAA(萘乙酸)0.1mg/L+琼脂3g/L+蔗糖30g/L，PH值为5.8。

优选地，所述步骤(3)中，诱导培养基为：MS4.43g/L+6-BA1.5mg/L+NAA1.5mg/L+琼脂3g/L+蔗糖30g/L，PH值为5.8。

优选地，所述步骤(4)中，增殖培养基为：MS4.43g/L+KT(6-糠基氨基嘌呤)2.0mg/L+6-BA1.0mg/L+NAA1.5g/L+琼脂3g/L+蔗糖30g/L，PH值为5.8。

优选地，所述步骤(5)中，芽分化培养基为：MS4.43g/L+6-BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+琼脂3g/L+蔗糖30g/L，PH值为5.8。

优选地，所述步骤(6)中，生根培养基为：MS2.215g/L+琼脂5g/L+蔗糖15g/L，PH值为5.8。

优选地，所述步骤(7)中，营养基质土的组分配比为基质土∶蛭石∶珍珠岩＝3∶1∶1，PH值为6.5-7.0。

优选地，所述步骤(2)-(6)中，在各培养基中添加溶剂ddH

本发明提供的一种青海大黄下胚轴组培与快繁方法，具有如下有益效果。

本发明建立了青海大黄离体培养无菌繁殖体系，以优质青海大黄种子为外植体，通过灭菌处理、初代培养、愈伤组织诱导、愈伤组织增殖培养、愈伤组织芽分化、生根培养和组培苗移栽，采用不同激素培养基配比，使得青海大黄下胚轴愈伤组织诱导率可达90％，愈伤组织增殖系数可达4.3，组培苗移栽成活率可达95％，本发明能够缩短青海大黄的繁殖周期，提高青海大黄的繁殖效率，可为后续转基因与遗传改良研究提供理论基础与技术支持，另外，还可为以后对青海大黄系统研究、种苗商业化生产及药用价值挖掘提供依据。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，以助于理解本发明的内容。

实施例1

本发明提供的一种青海大黄下胚轴组培与快繁方法，包括以下步骤：

(1)外植体灭菌处理：选取饱满的青海大黄种子作为外植体，平均长7.1mm，宽5.5mm，先采用蒸馏水浸泡3h，并在操作台剥壳去翅，用无菌滤纸滤干后置于50ml离心管内，用75％乙醇充分浸泡20s，用ddH

(2)初代培养基筛选：将步骤(1)的待用无菌外植体接种到初代培养基中，种子胚轴朝下，1/3种子浸没在培养基中，光照培养箱温度为20±1℃，光照培养16h/d，暗培养8h/d，光强阈值为4800～60001x，培养30d后种子萌发生长成苗，下胚轴稍膨大，所述初代培养基为：MS4.43g/L+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+琼脂3g/L+蔗糖30g/L，PH值为5.8；

(3)下胚轴愈伤组织诱导：将步骤(2)获得的无菌苗放入无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干表面水分，使用无菌手术刀切分，取下胚轴接种到诱导培养基中，光照培养箱温度为20±1℃，暗培养7d，光照培养8d，光强阈值为4800～60001x，培养15d后下胚轴呈翠绿色愈伤组织，愈伤组织诱导率为90％，所述诱导培养基为：MS4.43g/L+6-BA1.5mg/L+NAA1.5mg/L+琼脂3g/L+蔗糖30g/L，PH值为5.8；

(4)下胚轴愈伤组织增殖培养：将步骤(3)诱导出的下胚轴愈伤组织移栽到增殖培养基中，培养20d后下胚轴呈深绿色愈伤组织，愈伤组织增殖系数为4.3，所述增殖培养基为：MS4.43g/L+KT2.0mg/L+6-BA1.0mg/L+NAA1.5g/L+琼脂3g/L+蔗糖30g/L，PH值为5.8；

(5)下胚轴愈伤组织芽分化：将步骤(4)的下胚轴愈伤组织移栽到芽分化培养基中，培养15d后诱导出多个嫩绿色芽，所述芽分化培养基为MS4.43g/L+6-BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+琼脂3g/L+蔗糖30g/L，PH值为5.8；

(6)生根培养：将步骤(5)的无菌芽切分为单株，每株为2～3片叶片，移栽到生根培养基中，光照培养箱温度为20±1℃，光照培养16h/d，暗培养8h/d，光强阈值为4800～60001x，培养14d后生根得到叶色翠绿、长势良好的青海大黄组培苗，所述生根培养基为：MS2.215g/L+琼脂5g/L+蔗糖15g/L，PH值为5.8；

(7)组培苗移栽：将步骤(6)得到的生根苗去除根部培养基后移栽至装有营养基质土的花盆中，室温25℃，光照12h/d，湿度55-65％，每周喷施一次花多多1号，2000倍稀释，移植30d后移栽苗成活率为95％，所述营养基质土的组分配比为基质土∶蛭石∶珍珠岩＝3∶1∶1，PH值为6.5-7.0。

所述步骤(2)-(6)中，在各培养基中添加溶剂ddH

实施例2

非本发明提供的一种青海大黄下胚轴组培与快繁方法，包括以下步骤：

(1)外植体灭菌处理：选取饱满的青海大黄种子作为外植体，平均长7.1mm，宽5.5mm，先采用蒸馏水浸泡3h，并在操作台剥壳去翅，用无菌滤纸滤干后置于50ml离心管内，用75％乙醇充分浸泡20s，用ddH

(2)初代培养基筛选：将步骤(1)的待用无菌外植体接种到初代培养基中，种子胚轴朝下，1/3种子浸没在培养基中，光照培养箱温度为20±1℃，光照培养16h/d，暗培养8h/d，光强阈值为6000～72001x，培养25d后种子萌发生长成苗，下胚轴稍膨大，颜色呈黄绿色，所述初代培养基为MS4.43g/L+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+琼脂3g/L+蔗糖30g/L，PH值为5.8；

(3)下胚轴愈伤组织诱导：将步骤(2)获得的无菌苗放入无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干表面水分，使用无菌手术刀切分，取下胚轴接种到诱导培养基中，光照培养箱温度为20±1℃，暗培养7d，光照培养8d，光强阈值为6000～72001x，培养15d后下胚轴呈黄绿色愈伤组织，愈伤组织诱导率为87％，所述诱导培养基为：MS4.43g/L+6-BA1.5mg/L+NAA1.0mg/L+琼脂3g/L+蔗糖30g/L，PH值为5.8；

(4)下胚轴愈伤组织增殖培养：将步骤(3)诱导出的下胚轴愈伤组织移栽到增殖培养基中，培养20d后下胚轴呈深绿色愈伤组织，愈伤组织增殖系数为4.0，所述增殖培养基为：MS4.43g/L+KT0.5mg/L+6-BA0.5mg/L+NAA1.5g/L+琼脂3g/L+蔗糖30g/L，PH值为5.8；

(5)下胚轴愈伤组织芽分化：将步骤(4)的下胚轴愈伤组织移栽到芽分化培养基中，培养15d后诱导出多个黄绿色芽，所述芽分化培养基为：MS4.43g/L+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+琼脂3g/L+蔗糖30g/L，PH值为5.8；

(6)生根培养：将步骤(5)的无菌芽切分为单株，每株为2～3片叶片，移栽到生根培养基中，光照培养箱温度为20±1℃，光照培养16h/d，暗培养8h/d，光强阈值为6000～72001x，培养14d后生根得到叶色翠绿、长势良好的青海大黄组培苗，所述生根培养基为：MS4.43g/L+琼脂5g/L+蔗糖15g/L，PH值为5.8；

(7)组培苗移栽：将步骤(6)得到的生根苗去除根部培养基后移栽至装有营养基质土的花盆中，室温25℃，光照12h/d，湿度55-65％，每周喷施一次花多多1号，2000倍稀释，移植30d后移栽苗成活率为90％。所述营养基质土的组分配比为基质土∶蛭石∶珍珠岩＝2∶1∶1，PH值为6.5-7.0。

所述步骤(2)-(6)中，在各培养基中添加溶剂ddH

实施例3

非本发明提供的一种青海大黄下胚轴组培与快繁方法，包括以下步骤：

(1)外植体灭菌处理：选取饱满的青海大黄种子作为外植体，平均长7.1mm，宽5.5mm，先采用蒸馏水浸泡3h，并在操作台剥壳去翅，用无菌滤纸滤干后置于50ml离心管中，用75％乙醇充分浸泡20s，用ddH

(2)初代培养基筛选：将步骤(1)的待用无菌外植体接种到初代培养基中，种子胚轴朝下，1/3种子浸没在培养基中，光照培养箱温度为20±1℃，光照培养16h/d，暗培养8h/d，光强阈值为3600～48001x，培养40d后种子萌发生长成苗，下胚轴稍膨大。所述初代培养基为：MS4.43g/L+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+琼脂3g/L+蔗糖30g/L，PH值为5.8；

(3)下胚轴愈伤组织诱导：将步骤(2)获得的无菌苗放入无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干表面水分，使用无菌手术刀切分，取下胚轴接种到诱导培养基中，光照培养箱温度为20±1℃，暗培养7d，光照培养8d，光强阈值为3600～48001x，培养15d后下胚轴呈黄绿色愈伤组织，愈伤组织诱导率为80％。所述诱导培养基为：MS4.43g/L+6-BA1.5mg/L+NAA0.5mg/L+琼脂3g/L+蔗糖30g/L，PH值为5.8；

(4)下胚轴愈伤组织增殖培养：将步骤(3)诱导出的下胚轴愈伤组织移栽到增殖培养基中，培养20d后下胚轴呈深绿色愈伤组织，愈伤组织增殖系数为3.5。所述增殖培养基为：MS4.43g/L+6-BA 0.5mg/L+NAA 1.5g/L+琼脂3g/L+蔗糖30g/L，PH值为5.8；

(5)下胚轴愈伤组织芽分化：将步骤(4)的下胚轴愈伤组织移栽到芽分化培养基中，培养15d后诱导出多个嫩绿色芽，所述芽分化培养基为：MS4.43g/L+6-BA1.5mg/L+NAA0.5mg/L+琼脂3g/L+蔗糖30g/L，PH值为5.8；

(6)生根培养：将步骤(5)的无菌芽切分为单株，每株为2～3片叶片，移栽到生根培养基中，光照培养箱温度为20±1℃，光照培养16h/d，暗培养8h/d，光强阈值为3600～48001x，14d后生根得到叶色翠绿、长势良好的青海大黄组培苗。所述生根培养基为：MS3.32g/L+琼脂5g/L+蔗糖15g/L，PH值为5.8；

(7)组培苗移栽：将步骤(6)得到的生根苗移去除根部培养基后移栽至装有营养基质土的花盆中，室温25℃，光照12h/d，湿度55-65％，每周喷施一次花多多1号，2000倍稀释，移植30d后移栽苗成活率为85％。所述营养基质土的组分配比为基质土∶蛭石∶珍珠岩＝1∶1∶1，PH值为6.5-7.0。

所述步骤(2)-(6)中，在各培养基中添加溶剂ddH

以上三组实施例的青海大黄生长情况如表1所示，通过愈伤组织诱导率、愈伤组织增殖系数和组培苗移栽成活率三个方面来综合评判青海大黄的生长情况。

表1实施例1-3中青海大黄的生长情况

通过对比可知，采用本发明提供的一种青海大黄下胚轴组培与快繁方法，青海大黄下胚轴愈伤组织诱导率可达90％，愈伤组织增殖系数可达4.3，组培苗移栽成活率可达95％，其生长情况远远优于采用其他组培与快繁方法的青海大黄生长情况。因此，本发明能够显著缩短青海大黄的繁殖周期，大幅提高青海大黄的繁殖效率。

本发明建立的青海大黄离体培养无菌繁殖体系，以优质青海大黄种子为外植体，通过灭菌处理、初代培养、愈伤组织诱导、愈伤组织增殖培养、愈伤组织芽分化、生根培养和组培苗移栽，采用不同激素培养基配比，使得青海大黄下胚轴愈伤组织诱导率可达90％，愈伤组织增殖系数可达4.3，组培苗移栽成活率可达95％，本发明能够缩短青海大黄的繁殖周期，提高青海大黄的繁殖效率，可为后续转基因与遗传改良研究提供理论基础与技术支持，另外，还可为以后对青海大黄系统研究、种苗商业化生产及药用价值挖掘提供依据。

本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。