一种检测RNA依赖性RNA聚合酶活性的酶偶联法

摘要

本发明提供了一种检测RNA依赖性RNA聚合酶活性的酶偶联法，具体包括以下内容：将有活力的RdRp置于冰上解冻，并使用RNA聚合酶缓冲液配制活性RdRp样品溶液；在透明底部的黑色半区96孔板中，加入底物混合液，RdRp酶溶液和焦磷酸酶溶液；再用平板密封膜封住实验孔，置于37℃孵育60分钟；将孔板平衡到环境温度，移除密封膜；每个实验孔中加入100μlGREEN Reagent，在摇床上混合1分钟，然后至于室温孵育30分钟；在紫外分光光度计上读取微孔板在630nm的吸光值；利用焦磷酸标准曲线，确定焦磷酸的产量并计算酶比活力。本发明显著提高的检测灵敏度，带来的更广的分析窗口。

说明书

技术领域

本发明涉及酶活性检测技术领域，具体为一种检测RNA依赖性RNA聚合酶活性的酶偶联法。

背景技术

现已知的检测RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)活性的方法很多是采用检测放射性标记的合成的RNA产物延长链。这些方法大多数通过凝胶电泳直观的显示放射性的RNA链，但也有变更过的亲近闪烁法。在亲近闪烁检测法(SPA)中，生物素标记的引物在退火时与模板RNA结合形成双链，在放射性标记的核苷酸存在下，该双链被聚合酶催化延伸。终止反应后，核酸产物获得生物素以及放射性标记，从而被链霉亲和素磁珠捕获并得到检测。尽管放射性产物易检测和定量，但是这些实验中需要合成有放射性标记的分子，这个过程很慢而且昂贵。不仅如此，放射性材料的使用和处理都可能对人体和环境带来巨大的危害。SPA的方法还需要通过额外步骤去分离原料，会增加很多的工作量，可能在实验中引入各种未知变量。

发明内容

本发明所解决的技术问题在于提供一种检测RNA依赖性RNA聚合酶活性的酶偶联法，以解决上述背景技术中的存在的问题。

本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：一种检测RNA依赖性RNA聚合酶活性的酶偶联法，具体包括以下内容：

(1)将有活力的RdRp置于冰上解冻，并使用RNA聚合酶缓冲液配制2.5倍终浓度的活性RdRp样品溶液；

(2)使用RNA聚合酶缓冲液配制2.5倍终浓度的底物混合液和5倍终浓度无机焦磷酸酶溶液，所述底物混合液为0.5mMrGTP，20μg/ml聚胞苷酸(poly-rC)以及2μg/ml低聚G

(3)在透明底部的黑色半区96孔板中，加入10μl的2.5倍终浓度的底物混合液，10μl的2.5倍RdRp酶溶液和5μl的5倍焦磷酸酶溶液，使初始反应体积达到25μl；

(4)简单的离心，以确保试剂充分混合并聚集在孔板的底部；再用平板密封膜封住实验孔，置于37℃孵育60分钟；

(5)将孔板平衡到环境温度，移除密封膜；

(6)在每个实验孔中加入100μl

(7)在紫外分光光度计上读取微孔板在630nm的吸光值；

(8)利用焦磷酸(PPi)标准曲线，确定焦磷酸的产量并计算酶比活力。

优选的，所述RNA聚合酶缓冲液为：50mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、PH8.0，2.5mMMgCl2混合液，且在使用前加4mMDTT和0.4unit/μlRNA酶抑制剂。

优选的，所述内容(8)中的酶比活力的计算公式为：酶比活力(SA)(nmol/min/mg)＝PPi的产量(nmol)/(反应时间(min)*酶量(mg))。

与已公开技术相比，本发明存在以下优点：显著提高的检测灵敏度，带来的更广的分析窗口；简单的混合和读数，不需要分离反应产物，适用于RdRp抑制剂的高通量筛选；必需的反应成分，如NTPs，是酶的天然底物，因此在生理上更相关；所有反应组分都是实验室常用试剂，很容易获取；试剂无放射性，无毒，易于管理和处理；利用商业上可得到的测定标准，如无机焦磷酸盐，发明的测定系统是完全定量的，可以用于测定任意给定RdRp样品的酶比活力。

附图说明

图1为本发明的实验原理；

图2为焦磷酸标准曲线；

图3为本发明生成的新冠病毒RdRp滴定曲线。

具体实施方式

为了使本发明的技术手段、创作特征、工作流程、使用方法达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

一种检测RNA依赖性RNA聚合酶活性的酶偶联法，具体包括以下内容：

(1)将有活力的RdRp置于冰上解冻，并使用RNA聚合酶缓冲液配制2.5倍终浓度的活性RdRp样品溶液，所述RNA聚合酶缓冲液为：50mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、PH8.0，2.5mMMgCl2混合液，且在使用前加4mMDTT和0.4unit/μlRNA酶抑制剂；

(2)使用RNA聚合酶缓冲液配制2.5倍终浓度的底物混合液和5倍终浓度无机焦磷酸酶溶液，所述底物混合液为0.5mMrGTP，20μg/ml聚胞苷酸(poly-rC)以及2μg/ml低聚G

(3)在透明底部的黑色半区96孔板中，加入10μl的2.5倍终浓度的底物混合液，10μl的2.5倍RdRp酶溶液和5μl的5倍焦磷酸酶溶液，使初始反应体积达到25μl；

(4)简单的离心，以确保试剂充分混合并聚集在孔板的底部；再用平板密封膜封住实验孔，置于37℃孵育60分钟；

(5)将孔板平衡到环境温度，移除密封膜；

(6)在每个实验孔中加入100μl

(7)在紫外分光光度计上读取微孔板在630nm的吸光值；

(8)利用焦磷酸(PPi)标准曲线，如图2所示，确定焦磷酸的产量并计算酶比活力，所述酶比活力的计算公式为：酶比活力(SA)(nmol/min/mg)＝PPi的产量(nmol)/(反应时间(min)*酶量(mg))。

本发明的工作原理为：RdRp聚合酶反应产生的焦磷酸(PPi)随后被无机焦磷酸酶(iPPase)分解，产生两分子的单磷酸盐，单磷酸盐可以与

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明的要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。