一种检测HLA-B*15:02等位基因的荧光PCR方法及特异性引物探针组合

摘要

本发明提供了一种检测HLA‑B*15:02等位基因的荧光PCR方法及特异性引物探针组合。本发明利用TaqMan探针技术，基于一个HLA‑B*15:02特异的SNP基因位点设计一组引物与探针，结合对应内参基因β‑Actin的另一组引物与探针，同时还设计了一组针对非HLA‑B*15:02基因的引物探针，通过荧光定量PCR反应所得到的荧光新号结果来分析DNA样本中是否含有HLA‑B*15:02基因以及杂合、纯合情况。本发明相对于以往类似的检测方法，继承了荧光PCR的高特异性、高通量、高分辨率、低成本、操作简单便捷以及过程可控性等优点，且可以检测样品为纯合子或杂合子。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测HLA-B*15:02等位基因的特异性引物探针组合以及检测方法。

背景技术

人类白细胞抗原HLA(human leukocyte antigen)为主要组织相容性复合体MHC(major histocompatibility complex)所表达的一种具有高度多态性的同种异体抗原，其化学本质为一类糖蛋白，由一条α重链(被糖基化的)和一条β轻链非共价结合而成。

HLA按其分布和功能分为Ⅰ类抗原和Ⅱ类抗原。HLAⅠ类抗原分子的本质为内源性抗原的递呈分子，在人体免疫反应中扮演了至关重要的角色。HLAⅠ类抗原的特异性取决于α重链，由HLA-A、B、C位点编码。其中，HLA-B位点常常被作为某些疾病的遗传标志，如银屑病、青少年性胰岛素依赖型糖尿病等。

卡马西平CBZ(carbamazepine)是一种三环类抗惊厥药，被广泛用于治疗癫痫等神经性疾病。而近期研究表明，HLA-B*15:02基因与卡马西平药物所诱发的史提芬强生症候群SJS(Stevens-Johnson syndrome)有很强的相关性。临床统计表明，由服用卡马西平导致的SJS患者中携带某些HLA位点相关的等位基因出现频率明显高于普通人群。美国食品药品监督管理局FDA(U.S.Food and Drug Administration)在药物标记中的药物基因组生物标记表(Table of Pharmacogenomic Biomarkers in Drug Labeling)中将HLA-B基因列为卡马西平的生物标志物，并在包装盒上加有警告与预防措施等标志。

目前主要的HLA基因型检测方法有序列特异性引导的聚合酶链式反应PCR-SSP(PCR-sequence specific primer)、基于测序分型的聚合酶链式反应PCR-SBT(PCR-sequencing based typing)和荧光定量PCR反应RT-PCR(realtime-PCR)等。其中PCR-SSP与PCR-SBT方法均有操作繁琐、流程所需时间较长、成本较大等弊端，而RT-PCR凭借高通量、快速简便、无污染、可实时监测反应进程等优点成为HLA-B*15:02检测的主要手段。

目前已有的基于RT-PCR方法的检测HLA-B*15:02的试剂盒主要采用多HLA-B基因位点同时检测的原理来鉴定样本是否为HLA-B*15:02阳性。例如，中国专利文献CN2015102365550《一种检测HLA-B*15:02等位基因的多重实时荧光PCR方法》，该方法提供了一种定性HLA-B*15:02基因的TaqMan探针检测方法，其方案主要是同时利用多个SNP位点鉴定样本是否为HLA-B*15:02阳性，存在以下不足：

1、涉及较多扩增产物，复杂度较高；

2、最终特异性限于数据库更新，有待提高。

因此，发明人考虑，如果能够使用更少且具有更高特异性的基因位点来进行HLA-B*15:02的检测，将会大大提高检测的效率与质量。

发明内容

本发明的目的是提供一种更加高效、准确的检测HLA-B*15:02基因型的方法。

为了实现以上目的，本发明提出了一种单基因位点检测HLA-B*15:02基因型的方法。研究思路如下：

首先获取所有目前已知的HLA-B基因型共1449种，并以HLA-B*15:02:01:01作为参考基因序列与其他所有等位基因进行序列比对。对比对结果进行分析，可以了解该基因共约3400余个碱基位点相对于HLA-B*15:02的特异性情况，即每个位点可以将HLA-B*15:02基因型与哪些非HLA-B*15:02基因型区别开来。分析后发现在位于第五内含子上的SNP：rs144012689(T/A)可以将HLA-B*15:02基因型与所有HLA-B等位基因中99.7％(1446/1449)的其他基因型区分开来，而用除此位点外的其他位点进行组合均不能达到更高的特异性。不能区分的三个基因型分别为：B015:438、B015:454N、B015:491，检索此三种基因的基因频率均为极低或未发现。因此，我们将该SNP位点作为本方法的特异性位点。

基于此，发明人进一步分析和实验，得出以下技术方案：

一种针对HLA-B*15:02等位基因的特异性引物探针组合，包括：

HLA-B*15:02等位基因特异性上游引物Fm:5’-CCTCATTACTGGGAAGCAGCATCAT-3’；

非HLA-B*15:02等位基因特异性上游引物Fn1:5’-CCTCATTACTGGGAAGCAGCATCAA-3’；

非HLA-B*15:02等位基因特异性上游引物Fn2:5’-CCTCATTACTGGGAAGCAGCATGAA-3’；

下游引物R:5’-CCACAACCATCAAGGCGATACATCT-3’；

探针P：5’-ROX-ACGCAGCCTGGGACCCTGTGTGCCAGCA-BHQ1-3’；

其中，ROX为荧光基团，可选择Carboxy-X-Rhodamine；BHQ1为淬灭基团，可选择Black Hole Quencher-1。

以上探针5’端修饰为荧光基团，具体也可以替换为其他荧光基团，只要与针对内参基因设计的探针修饰的荧光基团没有重叠吸收峰即可。基于公知的荧光PCR方法，这类荧光基团相应的替换方案也应视为本发明的保护范围。

可选地，该特异性引物探针组合还包括针对内参基因β-Actin所设计的特异性引物和探针，具体如下：

上游引物ACTB-F:5’-CTCTCTGACTAGGTGTCTAAGACA-3’；

下游引物ACTB-R:5’-GAGTCTGTTCAGACCTACTGTG-3’；

探针ACTB-P:5’-FAM-AGGTACTAACACTGGCTCGTGTGAC–BHQ1-3’；

其中，FAM为荧光基团，可选择6-carboxy-fluorescein，BHQ1为淬灭基团，可选择Black Hole Quencher-1。

以上探针5’端修饰为荧光基团，同理，具体也可以替换为其他荧光基团，只要与上述探针P的荧光基团没有重叠吸收峰即可。

本发明还提出上述特异性引物探针组合可用于制备基于荧光PCR反应检测HLA-B*15:02等位基因的检测工具。

上述检测工具常见的形式有试剂盒、芯片等。

例如，一种基于荧光PCR反应检测HLA-B*15:02等位基因的试剂盒，特别含有上述的特异性引物探针组合。

本发明还提供一种检测HLA-B*15:02等位基因的TaqMan探针实时荧光PCR方法，用于非疾病诊断目的，包括以下步骤：

1)获取待测样本基因组DNA；

2)在针对HLA-B*15:02等位基因阳性与针对HLA-B*15:02等位基因阴性反应体系中分别按配比加入所述待测样本基因组DNA、权利要求1或2所述的特异性引物探针组合、以及PCR相关反应试剂；

3)通过荧光PCR检测，采集ROX与FAM荧光通道的荧光信号；

4)通过荧光信号结果分析判断待测样本携带HLA-B*15:02等位基因的情况。

优选地，所述PCR相关反应试剂包括dNTP、Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液和用于补充体系的双蒸水。

优选地，以反应体系为20μL计，则包括：

管1:：5xbuffer 4μL、10xbuffer 2μL、dNTP 2μL、上游引物Fm0.4μL、下游引物R0.4μL、探针P 0.2μL、内参上游引物0.2μL、内参下游引物0.2μL、内参探针0.1μL、Taq DNA聚合酶0.2μL、待测样本基因组DNA 2μL，用双蒸水将体积补足至20μL；

管2：5xbuffer 4μL、10xbuffer 2μL、dNTP 2μL、上游引物Fn1 0.2μL、上游引物Fn20.2μL下游引物R 0.4μL、探针P 0.2μL、内参上游引物0.2μL、内参下游引物0.2μL、内参探针0.1μL、Taq DNA聚合酶0.2μL、待测样本基因组DNA 2μL，用双蒸水将体积补足至20μL；

其中，5xbuffer、10xbuffer、Taq DNA聚合酶来自菲鹏生物股份有限公司的产品Hotstart HiTaq DNA Polymerase。

优选地，PCR扩增程序为：

Hold Stage:50℃2min；95℃10min；

PCT Stage，共35个循环:95℃15sec；60℃35sec。

进一步地，判断最终检测结果的依据为：

目的基因和内参基因的特异性引物和探针在荧光PCR仪上加入双管中进行扩增，通过相应通道进行荧光的采集；内参基因作为质控，必须出现荧光扩增曲线，否则为无效结果；在内参基因成功扩增的前提下：

若针对HLA-B*15:02等位基因阳性无扩增曲线且针对HLA-B*15:02等位基因阴性有扩增曲线，则样本为HLA-B*15:02等位基因阴性纯合；

若出现针对HLA-B*15:02阳性等位基因的上游引物所对应的荧光信号，则该样本为HLA-B*15:02阳性；在HLA-B*15:02阳性基础上，若针对HLA-B*15:02等位基因阴性有扩增曲线，则该样本为HLA-B*15:02阳性杂合子，否则，该样本为HLA-B*15:02阳性纯合子。

本发明利用TaqMan探针技术，基于一个HLA-B*15:02特异的SNP基因位点设计一组引物与探针，结合对应内参基因β-Actin的另一组引物与探针，通过荧光定量PCR反应所得到的荧光新号结果来分析DNA样本中是否含有HLA-B*15:02基因。在此基础上，设计了一组针对非HLA-B*15:02基因的引物探针，可以检测样品为纯合子或杂合子。本发明相对于以往类似的检测方法，继承了荧光PCR的高特异性、高通量、高分辨率、低成本、操作简单便捷以及过程可控性等优点，还新增了对杂合子以及纯合子的检测。具体有以下有益效果：

1、高通量、高效率

利用经典的TaqMan探针荧光定量PCR技术，通过设计与目的基因特异性结合的引物与探针便可快速且准确地检测相应的目的基因，实验操作简易且只需不到两小时的PCR反应便可以得到实验结果。

2、特异性强、灵敏度高

在Taqman探针技术的基础上，利用ARMS原理人为引入额外的错配，大大降低引物、探针与DNA模板非特异性结合的概率，提高了检测的可靠性。

3、低成本、低门槛

相比于一代测序，本方法仅仅需要荧光定量PCR即可完成检测，且所需设备仅为荧光定量PCR仪，相比于传统方法更加经济实惠。

4、安全性高、无污染

反应所使用的试剂均对人体无害，反应产物也不会对环境造成较大负面影响，具有环保性与安全性。

5、可以检测样本杂合、纯合情况。

附图说明

图1为HLA-B*15:02作为参考基因与其他HLA-B等位基因进行序列比对得到的部分比对结果。

图2为采用两种聚合酶的对照实验结果。

图3为对rs144012689位点上游一个碱基引入不同的错配碱基的结果的示意图。

图4为本发明一个实施例阳性标准品稀释结果的示意图。

具体实施方式

以下先简述本发明的研发过程，再进一步通过实施例详细介绍本发明的方案。

应当认识到，以下对于本发明研发过程的介绍仅选择了部分要点予以展示，旨在表明本发明最终确定的方案并非本领域技术人员通过简单、有限的实验可得。

HLA-B等位基因序列由EMBL-EBI的Immuno Polymorphism Database(IPD)数据库获得，以HLA-B*15:02作为参考基因与其他HLA-B等位基因进行序列比对，得到比对结果，部分结果如图1所示。其中每行代表每一种HLA-B等位基因，每列代表每个等位基因在每个位点上与HLA-B:15*02基因的比对情况，其中“-”代表匹配，“.”代表空位，碱基“A”、“T”、“C”、“G”代表该基因在该点与HLA-B:15*02基因有差异且为标出的对应碱基。比如，HLA-B*07:02:01:03在-262位点的碱基为T，而HLA-B:15*02在该点为C，以此可以作为寻找特异性位点的依据。

根据经验，通过多特异性位点同时检测实现将HLA-B:15*02基因与尽可能多的其他基因同时鉴别开来。因此将数据进行处理，首先将序列比对的结果转换为一个矩阵，其中空位“.”’与相同碱基“-”使用0表示，代表该点无法鉴别HLA-B:15*02与对应等位基因；错配的结果即“A”、“T”、“C”、“G”用1表示，代表该点可以鉴别HLA-B:15*02与对应等位基因，即鉴别HLA-B:15*02与对应等位基因特异性位点。

表1

如表1所示，即在第一列代表的位点可以将HLA-B:15*02基因与第二行与第三行代表的等位基因区分开来，第三列代表的位点可以将HLA-B:15*02基因与第一行代表的等位基因区分开来，那么同时检测第一列与第三列代表的位点即可将HLA-B:15*02基因与这三种等位基因同时区分开来。按照这个思路，将比对结果转换为一个只包含“1”与“0”的矩阵，则每个列向量中非0元素的个数即为该位点可区分的等位基因数，如上表中第一列非0元素个数为2，第三列非0元素个数为1，表示第一列与第三列对应位点可区分的等位基因数为2和1。在此基础上，将多个列向量进行相加，则得到结果中的非0元素个数即为多个位点同时检测可区分的等位基因个数，如上表中[0,1,1]+[1,0,0]得到的结果为[1,1,1]，其中非0元素个数为3，表示同时检测第一列与第三列对应位点可以同时将HLA-B:15*02基因与这三种等位基因同时区分开来。

按照以上方法对整个序列进行特异性位点组合的筛选，最终得到的最优结果为rs1050388、rs151341118、rs1050692、rs41540133、rs144012689的组合。在3191个HLA-B等位基因中可区分的个数为3191个，区分度为100％。对该组合中的每个位点进行分析，其中rs144012689可区分的等位基因个数为3187个，而其余四个特异性位点可区分的等位基因个数均为1：rs1050388可区分的等位基因为HLA-B*15:13:01，rs151341118可区分的等位基因为HLA-B*15:438，rs1050692可区分的等位基因为HLA-B*15:454N，rs41540133可区分的等位基因为HLA-B*15:491。在Allele Frequency Net Database(AFND)数据库中对这四个等位基因进行调查，发现在中国地区的基因频率均为0.01％以下，因此决定仅针对rs144012689进行特异性引物探针的设计。

对rs144012689上下游序列进行分析，发现在其上游两个碱基处有另一个特异性位点rs2596496。因此可将rs144012689作为上游引物的3’端，利用多引物单探针的组合结合Amplification refractory mutation system(ARMS)方法不仅可以鉴别HLA-B:15*02基因，还可以通过rs144012689的杂合纯合情况来判断样本的HLA-B:15*02基因杂合纯合情况。

选择以往经常采用的试剂进行实验，发现以往使用的TakaraPremix Ex Taq试剂盒存在扩增效率高但特异性较差的缺点，会出现严重的非特异性扩增情况，因此结合对相关聚合酶的产品调查，最终使用了HotstartHiTaq DNA Polymerase。分别两个酶对阴性阳性样本进行对照实验，结果如图2所示。其中前两列为Takara Premix Ex Taq，后两列为HotstartHiTaq DNA Polymerase，第1、3列为阳性样本，第2、4列为阴性样本。该实验的结果为Takara Premix Ex Taq出现了假阳性，而HotstartHiTaq DNA Polymerase的结果准确。

基于Amplification refractory mutation system(ARMS)方法，对rs144012689位点上游一个碱基引入人为的错配碱基，正确匹配的碱基为C，因此设计了对应位点为A、G、T三个碱基的引物并进行实验，结果如图3所示。图中，按CT值从小到大，在ARMS位点对应的碱基为C、A、G、T。由于C\G、C\T错配力过强，使得扩增效率过度降低，可能会导致假阴性的结果，因此最终ARMS错配碱基决定为C。

以下介绍本发明的一个实施例。

1.样本制备

使用QIAamp DNA Mini Blood Kit(德国Qiagen公司)试剂盒从外周血样本中提取DNA。

2.引物设计

针对HLA-B*15:02基因的特异性引物与探针为：

上游引物Fm:5’-CCTCATTACTGGGAAGCAGCATCAT-3’；

下游引物R:5’-CCACAACCATCAAGGCGATACATCT-3’；

探针P：5’-ROX-ACGCAGCCTGGGACCCTGTGTGCCAGCA-BHQ1-3’。

针对非HLA-B*15:02基因的特异性引物与探针为：

上游引物Fn:5’-CCTCATTACTGGGAAGCAGCATCAA-3’；

上游引物Fn2:5’-CCTCATTACTGGGAAGCAGCATGAA-3’；

下游引物R:5’-CCACAACCATCAAGGCGATACATCT-3’；

探针P：5’-ROX-ACGCAGCCTGGGACCCTGTGTGCCAGCA-BHQ1-3’。

其中，ROX为Carboxy-X-Rhodamine；BHQ1为Black Hole Quencher-1。

针对内参基因ACTB的引物与探针为：

上游引物ACTB-F:5’-CTCTCTGACTAGGTGTCTAAGACA-3’；

下游引物ACTB-R:5’-GAGTCTGTTCAGACCTACTGTG-3’；

探针ACTB-P:5’-FAM-AGGTACTAACACTGGCTCGTGTGAC–BHQ1-3’

其中，FAM为6-carboxy-fluorescein，BHQ1为Black Hole Quencher-1。

3.样本检测

反应体系为20μL计，则包括：

管1:：5xbuffer 4μL、10xbuffer 2μL、dNTP 2μL、上游引物Fm0.4μL、下游引物R0.4μL、探针P 0.2μL、内参上游引物0.2μL、内参下游引物0.2μL、内参探针0.1μL、Taq DNA聚合酶0.2μL、待测样本基因组DNA 2μL，用双蒸水将体积补足至20μL；

管2：5xbuffer 4μL、10xbuffer 2μL、dNTP 2μL、上游引物Fn1 0.2μL、上游引物Fn20.2μL下游引物R 0.4μL、探针P 0.2μL、内参上游引物0.2μL、内参下游引物0.2μL、内参探针0.1μL、Taq DNA聚合酶0.2μL、待测样本基因组DNA 2μL，用双蒸水将体积补足至20μL；

PCR的程序设置为：

Hold Stage:50℃2min；95℃10min；

PCT Stage(35cycles):95℃15sec；60℃35sec。

4.结果分析

内参基因作为质控，必须出现荧光扩增曲线，否则为无效结果；在内参基因成功扩增的前提下，若针对HLA-B*15:02等位基因阳性无扩增曲线且针对HLA-B*15:02等位基因阴性有扩增曲线，则样本为HLA-B*15:02等位基因阴性纯合。若出现针对HLA-B*15:02阳性等位基因的上游引物所对应的荧光信号，则该样本为HLA-B*15:02阳性。在HLA-B*15:02阳性基础上，若针对HLA-B*15:02等位基因阴性有扩增曲线，则该样本为HLA-B*15:02阳性杂合子，否则则该样本为HLA-B*15:02阳性纯合子。

5.实验结果

阳性标准品稀释结果的ROX通道信号见图4，由此得出的推荐样本浓度为10ng/μL。

验证实验：对100个随机样本进行扩增，将结果与SBT测序结果(北京博富瑞医学检验实验室有限公司)进行对比，确定该方法的准确性与灵敏度。结果见表2，得出该方法的准确率与灵敏度均为100％。

表2与SBT测序法相比较的结果

本实施例提供的单基因位点检测HLA-B*15:02基因型的方法，更加高效、准确，具有更好的特异性与更简便的操作流程，有利于更好地在HLA-B*15:02等位基因分型基础上指导卡马西平的安全用药。

另外，基于以上特异性引物探针组合，采用现有的技术手段，可以相应制备基于荧光PCR反应检测HLA-B*15:02等位基因的检测工具，如试剂盒或芯片等。

<110>西北大学

<120>一种检测HLA-B*15:02等位基因的荧光PCR方法及特异性引物探针组合

<160>8

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213> 人（Human）

<400> 1

CCTCATTACTGGGAAGCAGCATCAT

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213> 人（Human）

<400>2

CCTCATTACTGGGAAGCAGCATCAA

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213> 人（Human）

<400>3

CCTCATTACTGGGAAGCAGCATGAA

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213> 人（Human）

<400>4

CCACAACCATCAAGGCGATACATCT

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213> 人（Human）

<400>5

ACGCAGCCTGGGACCCTGTGTGCCAGCA

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213> 人（Human）

<400>6

CTCTCTGACTAGGTGTCTAAGACA

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213> 人（Human）

<400>7

CCTCATTACTGGGAAGCAGCATCAT

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213> 人（Human）

<400>8

AGGTACTAACACTGGCTCGTGTGAC