一种用于基因组步移的差异退火介导的茎环PCR技术

摘要

本发明涉及PCR步移技术领域，具体涉及一种用于基因组步移的差异退火介导的茎环PCR技术。本发明利用长度与退火温度适中的引物介导茎环形成，构成特异性扩增目标分子的结构基础,这些茎环形成引物还具有如下特点：或与已知序列一致，或额外在其3’端引入1‑3个自由碱基。上述特点确保在有限的已知区域设计多条引物用于平行反应,利用高退火温度的特异性引物和退火温度适中的茎环形成引物进行第一轮PCR，用于介导茎环形成；第二轮使用一对特异性引物：茎引物和环引物对目标分子进行指数富集，非特异性分子因为没有茎特异性引物或者环特异性引物的结合位点而被消除。

说明书

技术领域

本发明涉及PCR步移技术领域，具体涉及一种用于基因组步移的差异退火介导的茎环PCR技术。

背景技术

基于聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)的步移技术已取代基于基因组文库的步移方法，被广泛应用于获取已知DNA区域的未知侧翼序列。当前已报道的PCR基染色体步移技术达数十种。但根据原理不同可以将这些方法分为三类：(1)反向PCR；(2)连接介导PCR；(3)随机引发PCR。

反向PCR首先利用限制性内切酶对DNA模板进行切割，然后利用连接酶将切割的片段连接成环，其中同时包含了已知和未知区域；然后采用一对依据已知区域设计的、扩增方向相反的特异性引物进行扩增，实现未知侧翼分子的富集。连接介导PCR采用限制性内切酶对DNA进行处理，然后在其两端连接人工合成的双链DNA接头，利用接头引物和特异性引物进行2-3轮巢式PCR，达到扩增目的片段的目的。反向PCR和连接介导PCR均需要酶切和连接处理，对模板质量要求较高，同时增加了实验复杂性和成本，减低了效率。

随机引发PCR则通过随机引物(即步移引物)在未知区段发生延伸方向指向已知序列的随机退火，该随机引物即可与特异性引物配对，对目标分子进行扩增；然后在接下来的PCR中，通过(1)不对称退火、(2)随机引物部分退火或(3)茎环PCR等原理富集目标产物。随机引发PCR是一种不依赖任何前处理的方法，操作简单。其中基于茎环的技术在第二轮及以后的PCR中使用特异性引物，因而能降低非特异性扩增。然而，现有的茎环PCR需使用很长的随机简并引物介导茎环形成，在有限的已知区域内只能设计一条随机引物，引物设计的可选择性较低；同时介导茎环形成的引物仅发生一次退火，因而失败的概率较高。

发明内容

本发明提供了一种新的茎环PCR策略，可以同时利用多条较短的特异性引物(还能在其3’端引入自由碱基)介导茎环形成，其原理与操作过程如图1所示。首先，利用高退火温度的特异性引物(Specific primer,SP)和退火温度适中的茎环形成引物(Stem-loopforming primer，SLFP)进行第一轮PCR，用于介导茎环形成；随后使用一对特异性引物：茎引物(Stem primer,StP)和环引物(Loop primer,LoP)对目标分子进行指数富集。非特异性分子因为没有茎特异性引物或者环特异性引物的结合位点而被消除。

为实现上述目的，本发明提供一种用于基因组步移的步移引物设计策略，所述基因组步移反应的引物别为SP、SLFP、StP、LoP，引物根据已知序列进行设计，设计的引物对基因的未知侧翼进行获取，引物SP和引物SLFP用于第一轮PCR，用于介导茎环形成，引物StP和引物LoP用于第二轮PCR，对目标分子进行指数富集。

优选的，所述引物SLFP长度为15-20bp，退火温度45—55℃，特异性引物长度为20-25bp，退火温度60—65℃，引物SP、SLFP、StP与LoP的延伸方向一致，且按照依次排列在已知区域。

优选的，所述SLFP长度及退火温度适中且明显低于配对使用的SP，SLFP或与已知序列一致或额外在其3’端引入1-3个自由碱基，SLFP在有限的已知区域内设计多条进行平行试验。

优选的，所述引物SP的序列如序列表中SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2所示，引物SLFP的序列如序列表中SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:15所示，引物StP的序列如序列表中SEQID NO:16～SEQ ID NO:18所示，引物LoP的序列如序列表中SEQ ID NO:19～SEQ ID NO:21所示。

优选的，所述差异退火介导的茎环PCR方法包括以下步骤：

第一轮PCR反应:①94℃变性2min；②5个高严谨(60℃)循环，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min；③一个低严谨循环：94℃变性30s，25℃退火30s，72℃延伸2min；④15个适中温度退火循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min；⑤25个高严谨循环：94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸2min；⑥72℃延伸10min。

第二轮PCR反应:①94℃变性2min，②35个高严谨循环：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min；③72℃延伸10min。

优选的，所述第一轮PCR反应体系为：0.4mM dNTP Mixture，1×Mg

优选的，所述第二轮PCR反应体系为：0.4mM dNTP Mixture，1×Mg

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明涉及的SLFP引物较短，能有限的已知区设计多条SLFP；同时可在SLFP的3’末端可以任意添加错配碱基，进一步增加了茎环形成引物设计的可选择性与灵活性。因此，借助于有限的已知区可以进行多次平行茎环反应。本策略一方面增加了步移的成功率；另外，不同的SLFP可以在未知区域的不同位点退火，通过平行PCR，可以获得不同长度的产物，即通过一次平行反应，可能获得大片段DNA，提高了步移效率。在第一轮PCR中生成的所有非特异性产物，因不存在任何引物的退火位点，在第二轮PCR中不能得到扩增。

附图说明

图1为差异退火介导茎环PCR原理图；

图2为短乳杆菌CD0817源基因组谷氨酸脱羧酶基因位点和水稻潮霉素基因侧翼序列上游引物步移结果；

图3为水稻潮霉素基因侧翼序列下游引物步移结果。

具体实施方式

下面结合实例对本发明进行进一步的说明。

实施例1

引物设计

SLFP引物或与已知序列一致或在3’末端存在1-3个错配碱基(表1)，引物长度在15-20bp，退火温度45—55℃。SP引物根据短乳杆菌CD0817的谷氨酸脱羧酶基因(gadA)位点和插入水稻基因组中的潮霉素基因(hyg)列设计，特异性引物长度为20-25bp，退火温度60—65℃。SP、StP、SLFP与LoP引物的延伸方向一致，且按照依次排列在已知区域(图1)。

实施例2

实验方法

每次基因组步移包括两轮PCR反应，第一轮的产物作为下一轮反应的模板。第一轮反应体系为：dNTP Mixture，0.4mM；1×LA PCR bufferⅡ(Mg

第一轮PCR反应:①94℃变性2min；②5个高严谨(60℃)循环，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min；③一个低严谨循环：94℃变性30s，25℃退火30s，72℃延伸2min；④15个适中温度退火循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min；⑤25个高严谨循环：94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸2min；⑥72℃延伸10min。第二轮PCR反应:①94℃变性2min，②35个高严谨循环：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min；③72℃延伸10min。

本发明的原理如图1所示，该方法设计了一组退火温度适中的SLFP引物，或与已知序列完全一致或3’末端额外存在1-3个错配碱基，而与之配对的特异性引物具有高退火温度。后者在PCR过程中的退火效率高于前者，导致形成5’末端为SP引物、3’末端为与SLFP互补的单链，由于在靠近单链5’端的区域存在SLFP位点，3’末端可与SLFP位点发生链内退火并延伸，形成茎环结构，在茎和环部分均存在已知序列；在下一轮PCR中，利用茎、环特异性引物实现目标分子的指数扩增。

在第一轮PCR中，开始的5个高退火循环只允许SP退火，扩增得到一系列目标单链；随后一个低退火循环使SLFP发生随机退火，其中包含发生在未知区域且延伸方向指向SP的退火，SLFP延伸后得到一条3’末端与SP互补的新生单链；在接下来的15个适度严谨循环中，该新生单链被SLFP与SP指数扩增，得到大量目标双链DNA；利用高退火循环中SP的退火效率高于SLFP，因而在接下来的高退火循环中形成大量5’端为SP且3’端与SLFP互补的单链，这些单链的3’端能与靠近5’端的互补区发生链内退火，并延伸形成茎环结构。第二轮PCR反应中，以首轮PCR反应的“茎环”产物为模板，通过使用StP和LoP，实现目标分子的指数扩增；非特异性分子因没有茎或者环特异性引物的结合位点而被稀释。

为了验证此PCR方法的可行性，我们利用该方法分别对CD0817的gadA基因、水稻潮霉素基因的侧翼进行了多组步移试验，每组反应平行使用三个或以上的SLFP进行反应，结果如图2所示。经第二轮PCR扩增后，均有出现一条或多条明亮清晰的条带，大小介于1.5-5.0kb。测序结果表明，扩增的条带均为目的条带，即为已知序列的未知侧翼区域。某些情况下，我们扩增出的目标DNA条带不止一条，这是由于第一轮PCR反应的步移引物在基因组上有多个随机退火位点造成的。