一种鉴定汶上芦花鸡的引物组合、试剂盒及方法

摘要

本发明涉及生物技术、遗传育种领域，具体涉及一种鉴定汶上芦花鸡的引物组合、试剂盒及方法。本发明首次提供了汶上芦花鸡的特异性遗传位点，所述特异性遗传位点包括SNPs位点和INDELs位点，选择INDELs作为特异性标记，提高了鉴定体系的稳定性，降低了检测成本；本发明提供的遗传位点特异性高，每个位点汶上芦花鸡的鉴定率均在85％以上，因此，以本发明提供的特异性遗传位点组合进行汶上芦花鸡的鉴定，准确性更高。本发明为今后汶上芦花鸡品种资源保护与鉴定、食品溯源提供支撑。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术、遗传育种领域，具体涉及一种鉴定汶上芦花鸡的引物组合、试剂盒及方法。

背景技术

汶上芦花鸡，因产地而得名，中心产区为山东省汶上县境内。2009年汶上芦花鸡被农业部列为畜禽种质资源保护项，2011年列入《中国畜禽遗传资源志：家禽志》，2015通过国家农业地理标志产品认证。汶上芦花鸡属于肉蛋兼用型地方鸡种，主要用来生产草蛋鸡、优质鸡。在推广汶上芦花鸡的过程中，时常出现以杂交或外貌近似品种冒充汶上芦花鸡的现象。因此，提供一种能够有效准确鉴定汶上芦花鸡品种的产品及方法是非常有必要的。

发明内容

本发明主要目的是提供一种鉴定汶上芦花鸡的引物组合、试剂盒及方法，为汶上芦花鸡品种的鉴定和育种提高技术支持。

本发明目的之一，提供一组汶上芦花鸡特异性遗传位点。

本发明目的之二，提供所述汶上芦花鸡特异性遗传位点在鉴定汶上芦花鸡品种的应用。

本发明目的之三，提供检测以上汶上芦花鸡特异性遗传位点的引物组合。

本发明目的之四，提供以上所述引物组合在鉴定汶上芦花鸡品种中的应用。

本发明目的之五，提供一种用于鉴定汶上芦花鸡品种的试剂盒。

本发明目的之六，提供一种汶上芦花鸡的鉴定方法。

本发明目的之七，提供一种用于汶上芦花鸡品种鉴定的芯片及其在鉴定汶上芦花鸡品种中的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

汶上芦花鸡特异性遗传位点，所述汶上芦花鸡的特异性遗传位点包括：

BAR_tag1位于鸡2号染色体34320889处，基因RFTN1的UTR3区域，汶上芦花鸡基因型为TT；

BAR_tag2位于鸡2号染色体101022217处，基因LPIN2第13内含子，汶上芦花鸡基因型为TT(突变基因型为缺失)；

BAR_tag3位于鸡3号染色体54919215处，基因IFNGR1与IL22RA2之间，汶上芦花鸡基因型为CC；

BAR_tag4位于鸡4号染色体69036406处，基因N4BP2第1内含子，汶上芦花鸡基因型为GG；

BAR_tag5位于鸡5号染色体24343440处，基因LOC776275第3内含子，汶上芦花鸡基因型为AA；

BAR_tag6位于鸡7号染色体11204481处，基因AOX1第7内含子，汶上芦花鸡基因型为GG；

BAR_tag7位于鸡9号染色体19667949处，基因PLD1第2内含子，汶上芦花鸡基因型为AA；

BAR_tag8位于鸡15号染色体5726412处，基因P2RX7的UTR3区域，汶上芦花鸡基因型为GG；

BAR_tag9位于鸡19号染色体351443处，基因MKS1第16外显子，汶上芦花鸡基因型为AA；

BAR_tag10位于鸡19号染色体2863260处，基因GTF2I的下游区域，汶上芦花鸡基因型为CC；

BAR_tag11位于鸡23号染色体1526334处，基因STX12第1内含子，汶上芦花鸡基因型为CC；

BAR_tag12位于鸡Z染色体8667166处，基因UNC13B第1内含子，汶上芦花鸡基因型为CC；

BAR_tag13位于鸡Z染色体79125215处，基因FEM1C第3外显子，汶上芦花鸡基因型为GG。

以上所述的特异性遗传位点在鉴定汶上芦花鸡品种的应用。

检测以上所述汶上芦花鸡特异性遗传位点的引物组合，所述引物组合包括：

用于检测所述标记BAR_tag1的引物为BAR_P1f和BAR_P1r所示两条单链DNA：

BAR_P1f：GACGGATGCCTAACAGAAT；

BAR_P1r：GGAACTTCAGCCTAATATGGA；

用于检测所述标记BAR_tag2的引物为BAR_P2f和BAR_P2r所示两条单链DNA：

BAR_P2f：CCGCTGCTCTGTAACTTAT；

BAR_P2r：GGATACCGAGTGAGTAATGG；

用于检测所述标记BAR_tag3的引物为BAR_P3f和BAR_P3r所示两条单链DNA：

BAR_P3f：GAGTGAACAAGCCATAAGC；

BAR_P3r：TCCTATCCTGTGCCTGAA；

用于检测所述标记BAR_tag4的引物为BAR_P4f和BAR_P4r所示两条单链DNA：

BAR_P4f：TTCCTCTGGTCTGCTTACT；

BAR_P4r：AATTGTTCGGTCTGCTCTAA；

用于检测所述标记BAR_tag5的引物为BAR_P5f和BAR_P5r所示两条单链DNA：

BAR_P5f：CCTGTGCTTCTTGGTTGT；

BAR_P5r：TATAACGGTGTCTGGATGTC；

用于检测所述标记BAR_tag6的引物为BAR_P6f和BAR_P6r所示两条单链DNA：

BAR_P6f：TTGCCTTGAGACCAGTTAC；

BAR_P6r：AACAGTCCAACAGATTCCTT；

用于检测所述标记BAR_tag7的引物为BAR_P7f和BAR_P7r所示两条单链DNA：

BAR_P7f：TCAGGATGTTCTCACTCAAT；

BAR_P7r：TGGTTGCTATCAGGACAG；

用于检测所述标记BAR_tag8的引物为BAR_P8f和BAR_P8r所示两条单链DNA：

BAR_P8f：GCATCACAACCACCTACT；

BAR_P8r：GAGAACTCCTTAACTCTACCT；

用于检测所述标记BAR_tag9的引物为BAR_P9f和BAR_P9r所示两条单链DNA：

BAR_P9f：CTGTCTGACTCTGAGCAA；

BAR_P9r：TCTGTAACAACACAACTCTG；

用于检测所述标记BAR_tag10的引物为BAR_P10f和BAR_P10r所示两条单链DNA：

BAR_P10f：GACTGACACTGACACTGAG；

BAR_P10r：TTCCACCTTGAGCACATAG；

用于检测所述标记BAR_tag11的引物为BAR_P11f和BAR_P11r所示两条单链DNA：

BAR_P11f：TTGCCTCGTTACTGATTGA；

BAR_P11r：GCTGACTTGCTGTATTCTG；

用于检测所述标记BAR_tag12的引物为BAR_P12f和BAR_P12r所示两条单链DNA：

BAR_P12f：GGAAGAAGTGGAGCATTAGA；

BAR_P12r：CACAGGCAGACAGAGTTC；

用于检测所述标记BAR_tag13的引物为BAR_P13f和BAR_P13r所示两条单链DNA：

BAR_P13f：ATTCTCTTGGTGATAGGTCTG；

BAR_P13r：GTGCTCTGTCATGTAGTAGT。

以上所述的引物组合在鉴定汶上芦花鸡品种中的应用。

一种用于鉴定汶上芦花鸡品种的试剂盒，所述试剂盒包括以上所述的引物组合中的一对或几对。

所述试剂盒还包括核酸提取试剂、PCR反应缓冲液，DNA聚合酶和dNTPs中的至少一种。

一种汶上芦花鸡的鉴定方法，包括以下步骤：

提取待测鸡的组织样本，通过基因扩增检测待测鸡是否具有以下一种或几种基因型：

BAR_tag1位于鸡2号染色体34320889处，基因RFTN1的UTR3区域，汶上芦花鸡基因型为TT；

BAR_tag2位于鸡2号染色体101022217处，基因LPIN2第13内含子，汶上芦花鸡基因型为TT(突变基因型为缺失)；

BAR_tag3位于鸡3号染色体54919215处，基因IFNGR1与IL22RA2之间，汶上芦花鸡基因型为CC；

BAR_tag4位于鸡4号染色体69036406处，基因N4BP2第1内含子，汶上芦花鸡基因型为GG；

BAR_tag5位于鸡5号染色体24343440处，基因LOC776275第3内含子，汶上芦花鸡基因型为AA；

BAR_tag6位于鸡7号染色体11204481处，基因AOX1第7内含子，汶上芦花鸡基因型为GG；

BAR_tag7位于鸡9号染色体19667949处，基因PLD1第2内含子，汶上芦花鸡基因型为AA；

BAR_tag8位于鸡15号染色体5726412处，基因P2RX7的UTR3区域，汶上芦花鸡基因型为GG；

BAR_tag9位于鸡19号染色体351443处，基因MKS1第16外显子，汶上芦花鸡基因型为AA；

BAR_tag10位于鸡19号染色体2863260处，基因GTF2I的下游区域，汶上芦花鸡基因型为CC；

BAR_tag11位于鸡23号染色体1526334处，基因STX12第1内含子，汶上芦花鸡基因型为CC；

BAR_tag12位于鸡Z染色体8667166处，基因UNC13B第1内含子，汶上芦花鸡基因型为CC；

BAR_tag13位于鸡Z染色体79125215处，基因FEM1C第3外显子，汶上芦花鸡基因型为GG；

进一步地，当待测鸡对应于所述13个位点的基因型符合汶上芦花鸡基因型，则待测鸡为汶上芦花鸡。

一种用于汶上芦花鸡品种鉴定的芯片，所述芯片检测以下一个或多个特异性遗传位点：

BAR_tag1位于鸡2号染色体34320889处，基因RFTN1的UTR3区域，汶上芦花鸡基因型为TT；

BAR_tag2位于鸡2号染色体101022217处，基因LPIN2第13内含子，汶上芦花鸡基因型为TT(突变基因型为缺失)；

BAR_tag3位于鸡3号染色体54919215处，基因IFNGR1与IL22RA2之间，汶上芦花鸡基因型为CC；

BAR_tag4位于鸡4号染色体69036406处，基因N4BP2第1内含子，汶上芦花鸡基因型为GG；

BAR_tag5位于鸡5号染色体24343440处，基因LOC776275第3内含子，汶上芦花鸡基因型为AA；

BAR_tag6位于鸡7号染色体11204481处，基因AOX1第7内含子，汶上芦花鸡基因型为GG；

BAR_tag7位于鸡9号染色体19667949处，基因PLD1第2内含子，汶上芦花鸡基因型为AA；

BAR_tag8位于鸡15号染色体5726412处，基因P2RX7的UTR3区域，汶上芦花鸡基因型为GG；

BAR_tag9位于鸡19号染色体351443处，基因MKS1第16外显子，汶上芦花鸡基因型为AA；

BAR_tag10位于鸡19号染色体2863260处，基因GTF2I的下游区域，汶上芦花鸡基因型为CC；

BAR_tag11位于鸡23号染色体1526334处，基因STX12第1内含子，汶上芦花鸡基因型为CC；

BAR_tag12位于鸡Z染色体8667166处，基因UNC13B第1内含子，汶上芦花鸡基因型为CC；

BAR_tag13位于鸡Z染色体79125215处，基因FEM1C第3外显子，汶上芦花鸡基因型为GG。

以上所述的芯片在汶上芦花鸡品种鉴定中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首次提供了汶上芦花鸡的特异性遗传位点，所述特异性遗传位点包括SNPs位点和INDELs位点，选择INDELs作为特异性标记，提高了鉴定体系的稳定性，降低了检测成本；本发明提供的遗传位点特异性高，每个位点汶上芦花鸡的鉴定率均在85％以上，因此，以本发明提供的特异性遗传位点组合进行汶上芦花鸡的鉴定，准确性更高。本发明为今后汶上芦花鸡品种资源保护与鉴定、食品溯源提供支撑。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为基于最大似然法构建的地方鸡种基因树。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1汶上芦花鸡特异性遗传位点

供试样本:包括汶上芦花鸡(20只)、济宁百日鸡(20只)、琅琊鸡(20只)、寿光鸡(20只)、如皋黄鸡(20只)、太湖鸡(20只)、鹿苑鸡(20只)、狼山鸡(20只)、溧阳鸡(20只)、徐海鸡(20只)、龙胜凤鸡(20只)、闽清毛脚鸡(20只)、淮北麻鸡(20只)，每个品种公母各半。翅静脉采血0.5-1.0ml，置入抗凝管，-70℃保存。

采用常规血液DNA提取试剂盒抽取基因组DNA。以限制性内切酶对基因组DNA进行酶切，然后加上测序接头，构建小片段文库，进行GBS简化基因组测序。

为了检查酶切的效率，便于后续序列分析，进行了染色体电子酶切评估。为了保证数据质量，对原始序列进行更严格的过滤：去除含有接头序列的读长；去除未知碱基比例大于10％的读长；去除低质量读长(Q值低于10的碱基占比高于50％以上)。龙胜凤鸡1个体因质控不合格，将其从测序数据中剔除。

以最小等位基因频率-连锁不平衡方法分析259个地方鸡简化基因组序列，筛选得到18个汶上芦花鸡品种特异性SNPs/INDELs标记。18个SNPs/INDELs位点的物理位置是基于鸡全基因组参考序列比对确定的，所述鸡全基因组标准序列的版本号为(GallusgallusGRCg6)。汶上芦花鸡品种特异性SNPs/INDELs标记具体如下:

BAR_tag1位于鸡2号染色体34320889处，基因RFTN1的UTR3区域，汶上芦花鸡基因型为TT；

BAR_tag2位于鸡2号染色体101022217处，基因LPIN2第13内含子，汶上芦花鸡基因型为TT，突变基因型为缺失；

BAR_tag3位于鸡3号染色体54919215处，基因IFNGR1与IL22RA2之间，汶上芦花鸡基因型为CC；

BAR_tag4位于鸡4号染色体69036406处，基因N4BP2第1内含子，汶上芦花鸡基因型为GG；

BAR_tag5位于鸡5号染色体24343440处，基因LOC776275第3内含子，汶上芦花鸡基因型为AA；

BAR_tag6位于鸡7号染色体11204481处，基因AOX1第7内含子，汶上芦花鸡基因型为GG；

BAR_tag7位于鸡9号染色体19667949处，基因PLD1第2内含子，汶上芦花鸡基因型为AA；

BAR_tag8位于鸡15号染色体5726412处，基因P2RX7的UTR3区域，汶上芦花鸡基因型为GG；

BAR_tag9位于鸡19号染色体351443处，基因MKS1第16外显子，汶上芦花鸡基因型为AA；

BAR_tag10位于鸡19号染色体2863260处，基因GTF2I的下游区域，汶上芦花鸡基因型为CC；

BAR_tag11位于鸡23号染色体1526334处，基因STX12第1内含子，汶上芦花鸡基因型为CC；

BAR_tag12位于鸡Z染色体8667166处，基因UNC13B第1内含子，汶上芦花鸡基因型为CC；

BAR_tag13位于鸡Z染色体79125215处，基因FEM1C第3外显子，汶上芦花鸡基因型为GG；

其中，BAR_tag2为INDELs位点，其它均为SNP位点。以上所述遗传位点特性强，可用于汶上芦花鸡品种的鉴定中。

另外还可以将上述汶上芦花鸡的特异性遗传位点用于制备成芯片，用于汶上芦花鸡品种的鉴定。

实施例2检测汶上芦花鸡的引物组合

提供检测实施例1所述汶上芦花鸡特异性遗传位点的引物组合，用于检测所述标记BAR_tag1的引物为BAR_P1f和BAR_P1r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记BAR_tag2的引物为BAR_P2f和BAR_P2r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记BAR_tag3的引物为BAR_P3f和BAR_P3r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记BAR_tag4的引物为BAR_P4f和BAR_P4r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记BAR_tag5的引物为BAR_P5f和BAR_P5r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记BAR_tag6的引物为BAR_P6f和BAR_P6r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记BAR_tag7的引物为BAR_P7f和BAR_P7r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记BAR_tag8的引物为BAR_P8f和BAR_P8r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记BAR_tag9的引物为BAR_P9f和BAR_P9r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记BAR_tag10的引物为BAR_P10f和BAR_P10r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记BAR_tag11的引物为BAR_P11f和BAR_P11r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记BAR_tag12的引物为BAR_P12f和BAR_P12r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记BAR_tag13的引物为BAR_P13f和BAR_P13r所示两条单链DNA。

以上所述引物序列、扩增片段长度以及退火温度具体如下表1所示。

表1.检测汶上芦花鸡品种特异性标记所用扩增引物

实施例3用于鉴定汶上芦花鸡的检测试剂盒

所述试剂盒包括实施例2所述引物组合：BAR_P1f和BAR_P1r；BAR_P2f和BAR_P2r；BAR_P3f和BAR_P3r；BAR_P4f和BAR_P4r；BAR_P5f和BAR_P5r；BAR_P6f和BAR_P6r；BAR_P7f和BAR_P7r；BAR_P8f和BAR_P8r；共八对引物；还包括PCR反应缓冲液、TaqDNA聚会酶和dNTPs，核酸提取试剂。

以上实施例仅给出了实施例2所述引物组合中八对引物组合，本发明还包括实施例2所述13对引物组合中其它八对引物组合。

实施例4用于鉴定汶上芦花鸡的检测试剂盒

所述试剂盒包括实施例2所述引物组合：BAR_P1f和BAR_P1r；BAR_P2f和BAR_P2r；BAR_P3f和BAR_P3r；BAR_P4f和BAR_P4r；BAR_P5f和BAR_P5r；BAR_P6f和BAR_P6r；BAR_P7f和BAR_P7r；BAR_P8f和BAR_P8r，BAR_P9f和BAR_P9r，BAR_P10f和BAR_P10r；共十对引物；还包括PCR反应缓冲液、TaqDNA聚会酶和dNTPs，核酸提取试剂。

以上实施例仅给出了实施例2所述引物组合中八对引物组合，本发明还包括实施例2所述13对引物组合中其它十对引物组合。

实施例5用于鉴定汶上芦花鸡的检测试剂盒

所述试剂盒包括实施例2所述引物组合：BAR_P1f和BAR_P1r；BAR_P2f和BAR_P2r；BAR_P3f和BAR_P3r；BAR_P4f和BAR_P4r；BAR_P5f和BAR_P5r；BAR_P6f和BAR_P6r；BAR_P7f和BAR_P7r；BAR_P8f和BAR_P8r，BAR_P9f和BAR_P9r，BAR_P10f和BAR_P10r；BAR_P11f和BAR_P11r，BAR_P12f和BAR_P12r，BAR_P13f和BAR_P13r；共十三对引物；还包括PCR反应缓冲液、TaqDNA聚会酶和dNTPs，核酸提取试剂。

实验例

通过鉴定实施例1所述特异性遗传位点，对待测鸡进行鉴定。取20份汶上芦花鸡血样和360份非汶上芦花鸡血样作为待测样品。同时还对筛选得到的其它汶上芦花鸡特异性位点进行鉴定，所述位点如下：

Candidate1_2位于1号染色体37685187处，TRHDE基因与KCNC2基因之间，汶上芦花鸡基因型为GG；

Candidate3_3位于3号染色体9906477处，EHBP1第11内含子，汶上芦花鸡基因型为TT；

Candidate7_2位于鸡7号染色体26300021处，基因IQCB1的下游区域，汶上芦花鸡基因型为AA；

Candidate23_1位于鸡23号染色体5353166处，基因LOC112530206的UTR5区域，汶上芦花鸡基因型为CC；

CandidateZ_2位于鸡Z染色体66449744处，基因UGCG与基因SUSD1之间，汶上芦花鸡基因型为TT。

具体操作步骤如下：

以CTAB法提取380份血液样品基因组DNA，经紫外分光光度计检测、琼脂糖电泳检测合格后进行PCR扩增。

PCR扩增过程：

1)反应体系:10μl体系包括鉴定材料DNA模板50ng，正、反向引物各lOng,5μL 2×power Taq MasterMix，剩余体积用超纯水补足；

2)反应程序:首先94℃变性30s,51.0-56.1℃退火30s,72℃延伸30s，共5个循环；接着94℃变性30s,49.5-56.7℃退火30s,72摄氏度延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min,4℃保存。

扩增产物送至测序公司进行序列多态性检测。对于INDELs标记，也可选择毛细管电泳检测片段扩增长度，作为基因分型依据。

以上各特异性标记位点对汶上芦花鸡的鉴定率如下表2所示。

表2.汶上芦花鸡品种特异性标记鉴定率

由表2可知，实施例1所述各特异性遗传位点对汶上芦花鸡的鉴定率均在85％，因此，以本发明提供的特异性遗传位点作为鉴定组合进行汶上芦花鸡鉴定，准确性更高。其中用于检测Candidate1_2，Candidate3_3，Candidate7_2，Candidate23_1，CandidateZ_2的引物如下表3所示。

表3

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。