技术领域
本发明属于医学领域,尤其是涉及一种基于单样本学习的细胞分布模型构建及细胞计数方法。
背景技术
在细胞培养中,细胞数量的统计对细胞培养至关重要。不同细胞需要的细胞密度是不一致的,需要通过细胞计数来完成细胞密度的估算,从而得到最适合细胞培养的条件。
现有的细胞计数主要有两种方式:
一、全自动细胞计数仪器
一般的自动细胞计数仪带有可重复使用计数板和荧光检测功能(明场和两个荧光通道,波长可换),能够进行细胞计数。但是每次细胞计数时,需要进行“加样”-“插入计数仪”-“读取结果”,得到最终的细胞计数值。
上述方式主要有几个缺点:1.仪器昂贵,均需要上万元;2.每次均需要进行不少的人工操作;3.作为耗材的细胞计数板较贵;4.每次细胞计数均需要使用正在培养的细胞,会造成一定影响;一般需要穿插在细胞培养中进行。
二、人工细胞计数
人工细胞计数,主要使用细胞计数板进行均匀分样给多孔板。具体的步骤大致如下:
10CM培养皿里的细胞长到85%左右将它们消化下来吹匀,用移液管将混匀的细胞移入15ml离心管,1000转离心5min钟,再加入3ml左右培养基混匀,取出100ul稀释4倍混匀,充入细胞计数板内并计数,再从15ml离心管里取混匀细胞液100ul,稀释4倍混匀充池计数,再重复取稀重池计数俩次,最后取6次计数的平均值。
上述方式的缺点为:1.人工操作量极大,且极为复杂;2.存在分样不均匀,容易导致最后细胞计数不准确;3.每次细胞计数均需要使用正在培养的细胞,会造成一定影响;一般需要穿插在细胞培养中进行。
因此,急需要提供一种能够简单、经济的细胞计数方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单、经济的细胞计数方法。包括细胞分布模型的构建,及基于该模型的细胞技术方法。
一种基于单样本学习的细胞分布模型的构建方法,其特征在于,
1-1.对细胞培养进行显微镜照射,得到显微图片;
1-2.在显微图片上人工标记一个完整细胞边界,其边界的最长距离为L,定义为细胞截取长度;
1-3.以图片中心点为坐标原点(0,0),得到该人工标记的完整细胞边界内像素点(x,y)的坐标数组[x,y],其中,x,y分别为像素点在以坐标原点(0,0)为坐标系内的横纵坐标;
1-4.建立细胞分布模型F(x,y):
其中,其中, 为二维正态分布函数,σ
1-5.利用损失函数学习,所述损失函数Loss为:
其中,
求Loss的最小值,得到参数θ、r、σ、σ
进一步地,图片的预处理包括:对显微图片进行白化处理,使得背景色像素为0,像素点(x,y)的浮点数
其中,A是像素点(x,y)的像素值。
一种基于单样本学习的细胞计数方法,其特征在于,包括以下步骤:
3-1. 对细胞培养进行显微镜照射,得到显微图片;
3-2. 采用前述的构建方法得到细胞分布适配模型F'(x,y),并将步骤1-5学习得到的参数θ、r、σ、σ
3-3. 对显微图片中的每个像素点进行遍历,找到适合的截取大小及训练超参数;
3-3-1. 以像素点A为中心,以L_A1为细胞截取长度截取新的一张图片(以L_A1为边长的方形图片),并以该新的图片中心为坐标原点(0,0),得到该新的图片内的像素点的坐标数组[x
重复以上步骤,分别得到细胞截取长度为L_A2、L_A3、L_A4、L_A5、……、L_An的图片的超参数F_pa_in_L_A_A2、F_pa_in_L_A_A3、F_pa_in_L_A_A4、……、F_pa_in_L_A_An;其中,n为大于等于1的自然数;
3-3-2. 计算步骤3-3-1中截取的各个图片的最大似然函数值Log_L_A_An,以及各个图片的单位面积似然函数值Log_L_An/(L_An)
3-3-3. 比较以上步骤3-3-1中截取的图片的单位面积似然函数值Log_L_An/(L_An)
3-4. 以像素点A为中心,L'_A为截取长度截取细胞并进行计数;
3-5.重复以上步骤,对显微图片中的每个像素点进行遍历。
进一步地,在所述步骤3-3-3中,还包括:当同一个像素点同时被多个截取细胞截取时,比较各截取细胞对应的实际单位面积似然函数值,将该像素点截取到具有最大的实际单位面积似然函数值对应的细胞中,其余的截取细胞不计数。
进一步地,在所述步骤3-4中,还包括设定阈值,将所有实际单位面积似然函数值与所述阈值比较,选取实际单位面积似然函数值大于阈值的细胞进行计数;所述阈值为所有实际单位面积似然函数值的平均值。
进一步地,所述阈值人为设定。
进一步地,所述的似然函数值为像素点的值乘以该像素点符合F(x,y)分布的概率值。
采用本发明的细胞计数方法,相对于现有技术,至少具有以下有益效果:
(1)本发明的计数方法只需要利用显微镜进行拍照,无需额外过多操作;
(2)本发明的计数方法,人工只需要标注出单个细胞,就可以根据细胞相似性进行自动标注;
(3)本发明的计数方法最后能够根据阈值进行调控,人工可以通过调整阈值找到更好的结果;
(4)本发明的计数方法无需耗材,仅需少量人工,从而大大降低了实验和测量成本。
具体实施方式
以下的说明提供了许多不同的实施例、或是例子,用来实施本发明的不同特征。以下特定例子所描述的元件和排列方式,仅用来精简的表达本发明,其仅作为例子,而并非用以限制本发明。
一种基于单样本学习的细胞分布模型的构建方法,包括:
1-1.对细胞培养进行显微镜照射,得到显微图片;
1-2.在显微图片上人工标记一个完整细胞边界,其边界的最长距离为L,定义为细胞截取长度;
1-3.以图片中心点为坐标原点(0,0),得到完整细胞内像素点(x,y)的坐标数组[x,y]:(x
此时,通常需要先对图片进行白化处理,保证背景色(即无细胞处)为黑色,即对应的像素值为0;
1-4.建立细胞分布模型:
其中, 为二维正态分布函数,σ
1-5. 利用损失函数学习,所述损失函数为:
其中,
将上述的坐标数组(x
进一步地,图片的预处理包括:图片的预处理包括:对显微图片进行白化处理,使得背景色像素为0,像素点(x,y)的浮点数
其中,A是像素点(x,y)的像素值。
进一步地,将步骤1-5学习得到的参数θ、r、σ
需要说明的是,不同类型的细胞具有不同的适用模型,并且计算出的超参数值均不同,梭形的细胞、球形的细胞、饼状细胞,其计算出的超参数明显不同。
本发明还提供一种基于单样本学习的细胞计数方法,运用前述构建的细胞分布模型,包括:
3-1. 对细胞培养进行显微镜照射,得到显微图片;
3-2. 采用上述细胞模型构建方法得到细胞分布模型F'(x,y),并将步骤1-5学习得到的参数θ、r、σ、σ
3-3. 对显微图片中的每个像素点进行遍历,找到适合的截取大小及训练超参数;
3-3-1. 以像素点A为中心,以L_A1为细胞截取长度截取新的一张图片,并得到该新的图片内的像素点的坐标数组[x
重复以上步骤,分别得到细胞截取长度为L_A2、L_A3、L_A4、L_A5、……、L_An的图片的超参数F_pa_in_L_A_A2、F_pa_in_L_A_A3、F_pa_in_L_A_A4、……、F_pa_in_L_A_An;其中,n为大于等于1的自然数;
例如,A点的坐标为(x
本领域技术人员可以理解,可以根据计算的实际情况选取具体的截取长度,此处所列举的截取长度仅作为解释说明之用。
3-3-2. 计算步骤3-3-1中截取的各个图片的最大似然函数值Log_L_A_An,以及各个图片的单位面积似然函数值Log_L_An/(L_An)
其中,似然函数为像素点的浮点数值乘以该像素点符合F(x,y)分布的概率值;
即分别得到以0.5L、0.6L、0.7L、……、1.5L为细胞截取长度截取图片的最大似然函数值Log_L_A_0.5L、Log_L_A_0.6L、Log_L_A_0.7L、……、Log_L_A_1.5L;以及各个图片的单位面积似然函数值Log_L_A_0.5L/(L_A_0.5L)
3-3-3. 比较以上各图片的单位面积似然函数值Log_L_An/(L_An)
比较Log_L_A_0.5L/(L_A_0.5L)
3-4. 以像素点A为中心,L'_A=0.6L为截取长度截取细胞并进行计数;
3-5.重复以上步骤,对显微图片中的每个像素点进行遍历。
对显微图片中的像素点B(x
为保证每个像素点的中心点不被多个截取细胞覆盖(当同一个点被多个细胞覆盖,则说明存在细胞重复截取的情况),当(x
例如,当(x
Log_L_B_0.8L/(L_B_0.8L)
同理,Log_L_B_0.8L/(L_B_0.8L)
同时也可能会存在一个像素点仅被一个截取细胞截取,但是该截取出来的其实不是一个细胞的情况。
为解决该问题,通过设定阈值,当截取的细胞的实际单位面积似然函数值小于阈值时,该截取的细胞不计数,即舍弃掉不是细胞的细胞截取情况。
所述阈值的计算为:所有实际单位面积似然函数值的平均值;
例如,所截取的细胞1的实际单位面积似然函数值为Log_L_A_0.6L/(L_A_0.6L)
a=(1/4)*(Log_L_A_0.6L/(L_A_0.6L)
当细胞1,2,3,4中任一实际单位面积似然函数值小于a时,则舍弃掉,不进行计数。
本领域技术人员可以理解,本实施例只是作为一种举例说明,实际应用中,会有m个截取细胞,其中,m为大于等于1的自然数。
当然,所述阈值也可以通过经验设定,通过人工控制该阈值,选出最适合的阈值,得到最后的细胞截取结果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
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机译: 通过同源重组和稳定转染重组DNA构建体的同源基因细胞,改变哺乳动物细胞内源g-csf基因表达并整合到细胞基因组中的DNA构建体,一种改变表达的方法
机译: 分离出的Polipeptu,polinucleot,构建重组核酸表达载体,宿主细胞,重组方法以产生Polipept,从前体细胞产生突变体,产生蛋白,并产生polinucleot。降解或转化纤维素材料。产生一种物质并抑制细胞,细胞突变体,转基因植物,植物的部分或细胞以及RNA双丝分子在细胞中表达