cis-1S,5R-叶菌唑在调节小麦生长中的应用

摘要

本发明提供cis‑1S,5R‑叶菌唑在调节小麦生长中的应用。在小麦扬花期使用cis‑1S,5R‑叶菌唑能够促进小麦籽粒灌浆及成熟，增加小麦穗干重，在小麦扬花期施用cis‑1S,5R‑叶菌唑起到杀菌作用同时对籽粒灌浆、成熟以及成熟后籽粒萌发无不利影响。

说明书

技术领域

本发明属于杀菌剂应用领域，具体涉及cis-1S,5R-叶菌唑在调节小麦生长中的应用，更具体地，在小麦扬花期，施用cis-1S,5R-叶菌唑在不损害小麦籽粒灌浆、谷物品质及产量的前提下，对小麦发挥良好杀菌作用的同时，减少对作物自身生长的伤害，并且具有一定的生长调节作用，以提高作物的生长质量。

背景技术

小麦是一种在世界各地广泛种植的作物，其颖果可以制作馒头、面条，作为发酵材料可以用来制造啤酒、白酒等，是主要的粮食作物。然而小麦真菌病害，例如赤霉病，白粉病，锈病等会对小麦的品质产生不利影响，且会大程度降低小麦的产量。

叶菌唑是一种新的、广谱内吸性杀菌剂。其作用机理是抑制病原菌的麦角甾醇的生物合成，导致细胞膜不能形成，使菌丝不能生长。药剂施用之后，植物可迅速吸收，并进行双向传导，把已侵入的病原菌和孢子杀死，是具预防和治疗作用的内吸性杀菌剂。可有效防治小麦的壳针孢、穗镰刀菌、叶锈病、白粉病、颖枯病。除此之外，叶菌唑还可通过干扰植物代谢过程中的类异戊二烯途径，影响植物激素合成，打破植物重要激素间的平衡，从而有植物生长调节剂的作用。目前叶菌唑在美国被登记为可溶性液剂(SL)、可分散液剂(DC),乳油(EC)、水乳剂(EW)、悬浮剂(SC)、水分散粒剂(WP)等控制谷物的真菌病害，最大推荐剂量为60ga.i./公顷，施药间隔期为7-10天，同一生长时期施用不超过两次(EPA 2009叶菌唑)。叶菌唑在欧盟被登记为可溶性液剂(SL)使用用于防治谷物和油菜的真菌病害,最大推荐剂量为90ga.i./公顷(EFSA 2006)。叶菌唑在中国被登记为水分散剂防治小麦的白粉病和锈病，在发病初期喷施，也被登记为悬浮剂，于小麦扬花初期喷施，防治赤霉病。已有实验室内毒理测定发现叶菌唑对小麦赤霉病菌，小麦白粉病和小麦锈病有优异的杀菌活性。

随着小麦植株的生长发育，扬花期后进入籽粒灌浆期，小麦灌浆直接决定小麦的千粒重，影响小麦产量的高低。在此期间，小麦籽粒干重会不断增加。小麦内光合作用产生的淀粉和转化的蛋白质通过同化作用存储在小麦籽粒中。因此在小麦扬花期施用三唑类杀菌剂进行病害防治，应该考虑到药物对作物生长的影响，以防减产。

叶菌唑具有两个手性碳原子，四个立体异构体，目前，叶菌唑以外消旋体的形式加工成可湿性粉剂、悬浮剂和乳油等剂型使用。然而三唑类杀菌剂通常伴有植物调节的活性，因此施用于植物可能对植物的伤害性较大，常常会导致植物无法良好的生长，影响农作物的质量和产量。

发明内容

本发明的目的之一在于提供cis-1S,5R-叶菌唑的新用途。

本发明所提供的cis-1S,5R-叶菌唑的新用途，为：

所述应用为：在小麦扬花期使用cis-1S,5R-叶菌唑在杀菌的同时对小麦生长发育不产生抑制作用反而提高小麦质量。

上述应用中，所述提高小麦质量具体指：促进小麦籽粒灌浆及成熟；增加小麦穗干重；增加小麦千粒重。

本发明的另一目的是提供一种提高小麦质量的方法。

本发明所提供的提高小麦质量的方法，为：在小麦扬花期使用cis-1S,5R-叶菌唑杀菌的同时提高小麦质量。

所述提高小麦质量的方法，具体包括以下步骤：

1)将叶菌唑外消旋体分离纯化，得到cis-1S,5R-叶菌唑；

2)将cis-1S,5R-叶菌唑制成乳油；

3)于小麦扬花期施药cis-1S,5R-叶菌唑乳油。

上述方法步骤1)中，所述分离纯化的操作为：将叶菌唑外消旋体采用高效液相色谱，利用Enantiopak OD色谱柱，在流动相为正己烷：乙醇97：3，流速1.0mL/min条件下,分离纯化成cis-1R,5S-叶菌唑，cis-1S,5R-叶菌唑；

上述方法步骤2)中，所述乳油的配方为：原药99.9％cis-1S,5R-叶菌唑占比8％，阴离子乳化剂农乳500占比5％，非离子乳化剂农乳601占比5％，溶剂油S-150(溶剂)占比82％；

所述施药的方案为：小麦扬花期施药，60g a.i./公顷，施药间隔期7-10天，同一生长时期施药不超过两次。

本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种环保、安全、高效，不仅具有良好杀菌效果且对施用作物的生长不会产生不利影响的在小麦扬花期使用cis-1S,5R-叶菌唑提高小麦质量的方法。解决了叶菌唑于小麦扬花期施用造成作物减产以及影响作物收获籽粒萌发的问题，选择出对小麦作物生长安全的叶菌唑光学异构体cis-1S,5R-叶菌唑。

实验结果表明：在小麦扬花期使用cis-1S,5R-叶菌唑能够促进小麦籽粒灌浆及成熟，增加小麦穗干重，增加小麦千粒重，在小麦扬花期施用cis-1S,5R-叶菌唑起到杀菌作用同时对籽粒灌浆、成熟以及成熟后籽粒萌发无不利影响。

附图说明

图1为叶菌唑外消旋体各组分的高效液相色谱分离图。

图2为cis-1R,5S-叶菌唑(P1)，cis-1S,5R-叶菌唑(P2)，rac-叶菌唑结构式。

图3为实验方案示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的叶菌唑外消旋体为江苏辉丰生物农业股份有限公司的产品，商品名为叶菌唑原药。

实施例

步骤1、将叶菌唑外消旋体采用高效液相色谱，利用Nu-Anylyticl Chiral ND色谱柱，在流动相为正己烷：乙醇97：3，流速1.0mL/min,分离纯化成叶菌组光学异构体cis-1R,5S-叶菌唑，cis-1S,5R-叶菌唑(如图1所示)；

步骤2、分别制作叶菌唑外消旋体和光学异构体乳油，配方为：原药99.9％叶菌唑占比8％，阴离子乳化剂农乳500占比5％，非离子乳化剂农乳601占比5％，溶剂为溶剂油S-150占比82％，均为质量百分比；

步骤3、将制备好的叶菌唑外消旋体与光学异构体乳油以根据美国商品化外消旋体的标签(60g a.i./公顷，施药间隔期7-10天，同一生长时期施药不超过两次)，将风险扩大化，将实验的施药浓度定位最大推荐剂量的1.5倍，次数为最大推荐次数的N+1次，即按90ga.i./公顷施药，喷施时以水按照30L/亩用量稀释，于小麦扬花期施药三次进行大田实验；

步骤4、于喷药后7、14、21、28、35天分别取植株，麦穗样本，第35天收集收集每个实验组1m

步骤5、分别称取每个处理每个平行试验0.1g植株样品，避光用研钵研磨后，利用南京建成公司叶绿素测试盒(比色法，货号A147-1-1)处理样品后利用可见分光光度计分别测定在663和645nm处的吸光度，根据试剂盒说明书计算样本中叶绿素a，叶绿素b和总叶绿素含量；

步骤6、分别称取每个处理每个平行0.2g植株、籽粒样本装入2ml离心管后加入800ml 1×磷酸缓冲液后，利用球磨机将样品制备成20％组织匀浆液，4℃，10000rpm离心10分钟，取上清液；

步骤7、步骤6所得上清液，利用齐一生物(上海)有限公司植物赤霉素(GA)ELISA试剂盒(货号QY-P96030)处理上清液后利用酶标仪测定在450nm处的吸光度，根据试剂盒说明书计算样本中赤霉素的含量；

步骤8、步骤6所得上清液，利用齐一生物(上海)有限公司植物脱落酸(ABA)ELISA试剂盒(货号QY-P96047)处理上清液后利用酶标仪测定在450nm处的吸光度，根据试剂盒说明书计算样本中脱落酸的含量；

步骤9、步骤4中第35天收获的籽粒风干后，挑取大小均匀，饱满的种子，用20％的双氧水消毒10min后，迅速用蒸馏水清洗数次，均匀摆放至铺有双层湿滤纸的直径为9cm培养皿内，每个处理设置6个重复，每个培养皿摆放20颗种子，小麦种子置于24℃的培养箱中，每隔24h检测种子的发芽情况,记录发芽种子数直至连续三天发芽种子数不变。

药效试验

试验方法：试验于小麦田内进行，每个组别重复3次，处理面积约为30m

1)试验地概况：试验田设在北京市通州区小麦实验田，总面积5亩，试验田面积400m

2)分组设计：本实验设3个处理，1个对照，3次重复。处理1施用cis-1R,5S-叶菌唑(P1)(乳油),处理2施用cis-1S,5R-叶菌唑(P2)(乳油)，处理3施用rac-叶菌唑(乳油)，处理4为空白对照不施用叶菌唑及其他三唑类药物；

小区划分：按分组设计的要求划分各处理小区，设3个重复，随机区组排列，每个小区面积30m

3)用药时期：在小麦扬花期进行3次施药；

4)结果统计：最后一次施药后的7、14、21、28、35天，每个小区每次随机选取30株生长状态一致的植株，剪下叶片与麦穗立即置于液氮，冷冻后置于-80℃直至分析叶绿素(使用南京建成生物研究所的叶绿素测试盒测定)及激素(使用上海齐一生物科技有限公司的植物赤霉素、植物脱落酸试剂盒分别测定)含量；每个小区另外选取30株生长状态一致的植株，室内剪下穗后烘干至恒重测量重量。第35天，每小区取1m

5)植株叶绿素计算方法：将大田实验所收集的植株样本，每个时间段每个处理每个平行分别取0.1g叶片组织，剪碎后，蒸馏水洗干净后室温下风干，将样本置于研钵加入1mL蒸馏水与50mg试剂盒提供的试剂一，在避光条件下充分研磨后置于10mL离心管内。将无水乙醇和丙酮按照1：2(v:v)比例充分混合为提取液，用提取液冲洗研钵，将洗液转移至离心管，提取液定容至10mL,在避光条件下浸提约3h，直到观察到底部残渣变白下提取完全。取浸提液1ml于1ml玻璃比色皿，利用提取液调零，分别测定665和645nm处的吸光度，分别为A

计算公式

叶绿素a含量(mg/g鲜重)＝(12.7×A

叶绿素b含量(mg/g鲜重)＝(22.9×A

总叶绿素含量(mg/g鲜重)＝(20.21×A

其中V提是提取液体积(10mL),m是样本质量，使用克(g)为单位

6)植物赤霉素测定方法：每个样本取10uL步骤6所得上清液加入96孔酶标板后，每个样本加入40uL试剂盒所提供的样本稀释液。设置标准孔，使用试剂盒所提供的标准品以及标准品稀释液，设置浓度为900、600、300、150、75pmol/L的标准孔。每孔加入酶标试剂50uL,用封板膜封板后置37℃温浴30min后，揭开封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满试剂盒提供的洗涤液，静置30s后弃去，重复5次拍干。每孔先加入试剂盒提供的显色剂A50uL,再加入显色剂B50uL，轻轻震荡混匀，37℃下避光显色10min。每孔加终止液50uL，以空白孔调零，450nm波长依次测序各孔吸光度。

以标准物的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，根据样品的吸光度由标准曲线计算出相应的浓度，再乘以稀释倍数(25倍)，即为样品的实际浓度。

7)植物脱落酸测定方法：每个样本取10uL步骤6所得上清液加入96孔酶标板后，每个样本加入40uL试剂盒所提供的样本稀释液。设置标准孔，使用试剂盒所提供的标准品以及标准品稀释液，设置浓度为150、100、50、25、12.5ug/L的标准孔。每孔加入酶标试剂50uL,用封板膜封板后置37℃温浴30min后，揭开封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满试剂盒提供的洗涤液，静置30s后弃去，重复5次拍干。每孔先加入试剂盒提供的显色剂A50uL,再加入显色剂B50uL，轻轻震荡混匀，37℃下避光显色10min。每孔加终止液50uL，以空白孔调零，450nm波长依次测序各孔吸光度。

以标准物的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，根据样品的吸光度由标准曲线计算出相应的浓度，再乘以稀释倍数(25倍)，即为样品的实际浓度。

8)籽粒萌发率计算方法：按照步骤9处理收获籽粒，每天统计每个培养皿内小麦发芽个数，芽长超过种子长度1/2作为发芽，统计发芽率。

发芽率的计算公式为：发芽率＝发芽种子数/供试种子总数×100％

9)结果与分析：

9.1穗干重与收获时千粒重的效果对比

在本实施例中，通过在不同时期采样小麦的穗，并烘干至恒重后测定其重量来反应小麦的灌浆情况。与空白对照组相比，在籽粒灌浆的后期(28，35天)不同类型叶菌唑处理之间有显著的差异，其中cis-1R,5S-叶菌唑处理显著抑制了穗的增重，与其他两种类型的叶菌唑处理相比，cis-1S,5R-叶菌唑处理在生长后期对穗干重的增加有显著的促进作用，具体数值为见表1。

表1空白对照组与叶菌唑处理组在不同时期麦穗干重

abc代表不同类型叶菌唑处理组之间的差异，不同字母代表有显著差异(p<0.05),相同字母则无显著性差异；

*代表处理组与空白对照组有显著差异，*代表p<0.05,**代表p<0.01。

最后一次施药后7、14天，与空白对照组相比，三种形式的叶菌唑处理组都无显著区别，然后从第21天开始，叶菌唑处理组和空白对照组之间出现显著区别，与空白对照组相比，cis-1R,5S-叶菌唑处理组的小麦穗干重增加了12％，cis-1S,5R-叶菌唑处理组的小麦穗干重增加了23％，rac-叶菌唑处理组小麦穗干重增加了10％。然而这种促进穗干重积累的作用并没有持续，到了第28天，与对照组相比，28天时cis-1R,5S-叶菌唑处理组穗干重降低了19％。这种抑制作用到了收获时(35天)也依旧没有减轻。在第35天，与对照组相比，cis-1R,5S-叶菌唑处理组穗干重降低了18％。然而，35天时，cis-1S,5R-叶菌唑处理组与对照组相比，穗干重增加了9.3％。

表2空白对照组与叶菌唑处理组千粒重

abc代表不同类型叶菌唑处理组之间的差异，不同字母代表有显著差异(p<0.05),相同字母则无显著性差异

*代表处理组与空白对照组有显著差异，*代表p<0.05,**代表p<0.01

在最后一次喷药后的第35天收获小麦，测定小麦的千粒重,与空白对照组相比，rac-叶菌唑处理组的千粒重没有显著变化，然而两个光学异构体处理却出现相反的显著性变化。与空白对照组相比，其中cis-1R,5S-叶菌唑处理千粒重显著降低了17％，而cis-1S,5R-叶菌唑处理千粒重显著增加了14％。

9.2叶绿素的效果对比

表3空白对照组与叶菌唑处理组不同时期植株叶绿素a含量

abc代表不同类型叶菌唑处理组之间的差异，不同字母代表有显著差异(p<0.05),相同字母则无显著性差异；

*代表处理组与空白对照组有显著差异，*代表p<0.05,**代表p<0.01。

植物主要通过光合作用来获取能量以及产生有机物质。几乎所有植物的产量和品质都于叶绿素的合成、发育和降解有密切的联系。因此本实施例测定了在扬花期施用不同的叶菌唑后对小麦植株叶绿素a,叶绿素b,总叶绿素含量的影响。与空白对照处理相比，喷施cis-1R,5S-叶菌唑和cis-1S,5R-叶菌唑植株叶片能合成更多的叶绿素a。其中cis-1R,5S-叶菌唑处理组叶绿素a增加的最为显著，cis-1R,5S-叶菌唑处理组在第7，14，21，28天叶绿素a含量分别比对照组植株叶绿素a含量增加了386％、356％、145％和441％。然而rac-叶菌唑处理(处理3)植株叶片叶绿素a只在前期有增加，到第28天，rac-叶菌唑处理组植株叶片叶绿素a水平都显著降低,与对照相比显著降低了89％。

表4空白对照组与叶菌唑处理组不同时期植株叶绿素b含量

abc代表不同类型叶菌唑处理组之间的差异，不同字母代表有显著差异(p<0.05),相同字母则无显著性差异；

*代表处理组与空白对照组有显著差异，*代表p<0.05,**代表p<0.01。

叶绿素b的变化与叶绿素a也具有相似的趋势，其中cis-1R,5S-叶菌唑处理组叶绿素b含量增加的最为显著，cis-1R,5S-叶菌唑处理组在第7，14，21，28天叶绿素a含量分别比对照组植株叶绿素a含量增加了107％、405％、122％和349％。

表5空白对照组与叶菌唑处理组不同时期植株总叶绿素含量

abc代表不同类型叶菌唑处理组之间的差异，不同字母代表有显著差异(p<0.05),相同字母则无显著性差异；

*代表处理组与空白对照组有显著差异，*代表p<0.05,**代表p<0.01。

总叶绿素含量的变化也具有相似的趋势，其中cis-1R,5S-叶菌唑处理组总叶绿素含量增加的最为显著，cis-1R,5S-叶菌唑处理组在第7，14，21，28天叶绿素a含量分别比对照组植株叶绿素a含量增加了342％、361％、139％和385％。

值得注意的是，cis-1R,5S-叶菌唑处理组植株叶片叶绿素a,叶绿素b和总叶绿素水平即使在28天都显著高于对照组和其他叶菌唑处理组，叶绿素降解是叶片衰老和果实成熟的最明显的标志，叶绿素降解对于叶片发育来说是必不可少的，因此cis-1R,5S-叶菌唑处理后不利于叶绿素的降解，因此会对籽粒的成熟产生不利影响。

9.3赤霉素效果对比

表6空白对照组与叶菌唑处理组不同时期植株赤霉素含量

abc代表不同类型叶菌唑处理组之间的差异，不同字母代表有显著差异(p<0.05),相同字母则无显著性差异；

*代表处理组与空白对照组有显著差异，*代表p<0.05,**代表p<0.01。

表7空白对照组与叶菌唑处理组不同时期籽粒赤霉素含量

abc代表不同类型叶菌唑处理组之间的差异，不同字母代表有显著差异(p<0.05),相同字母则无显著性差异；

*代表处理组与空白对照组有显著差异，*代表p<0.05,**代表p<0.01。

赤霉素能促进小麦结实，与空白对照处理相比，叶菌唑处理都显著降低了籽粒和植株的赤霉素含量，其中rac-叶菌唑处理降低得最为显著，与对照组相比rac-叶菌唑处理组植株赤霉素含量在第7，14，21，28，35天分别下降了33％、25％、46％、49％和41％。与对照组相比rac-叶菌唑处理组籽粒赤霉素含量在第7，14，21，28，35天分别下降了76％、63％、71％、86％和91％。

9.4脱落酸效果对比

表8空白对照组与叶菌唑处理组不同时期植株脱落酸含量

abc代表不同类型叶菌唑处理组之间的差异，不同字母代表有显著差异(p<0.05),相同字母则无显著性差异；

*代表处理组与空白对照组有显著差异，*代表p<0.05,**代表p<0.01。

一般来说脱落酸含量会在小麦籽粒成熟后期显著上升，它会促进营养物质运输到小麦籽粒。与空白对照组相比，叶菌唑处理显著改变了植株脱落酸水平。其中在28d及以后，cis-1R,5S-叶菌唑处理显处理显著降低了植株脱落酸水平。与空白对照组相比，cis-1R,5S-叶菌唑处理植株28，35d脱落酸含量分别下降了23％和18％。

表9空白对照组与叶菌唑处理组不同时期籽粒脱落酸含量

abc代表不同类型叶菌唑处理组之间的差异，不同字母代表有显著差异(p<0.05),相同字母则无显著性差异；

*代表处理组与空白对照组有显著差异，*代表p<0.05,**代表p<0.01。

在籽粒成熟的后期，籽粒中脱落酸的含量也明显受到叶菌唑处理的影响。与空白对照组相比，cis-1R,5S-叶菌唑处理和rac-叶菌唑处理显著降低了籽粒脱落酸的含量，但是cis-1R,5S-叶菌唑处理组降低得更为显著，在28和35天cis-1R,5S-叶菌唑处理组籽粒脱落酸含量与空白对照组相比分别显著下降了46％和55％。这对小麦籽粒成熟是非常不利的。

以上小麦穗干重增加、千粒重，叶绿素含量及赤霉素和脱落酸含量的变化表明，在小麦生产中喷施cis-1R,5S-叶菌唑对小麦籽粒成熟有显著的抑制作用，且小麦的千粒重(产量衡量的一个重要指标)也会降低。cis-1S,5R-叶菌唑处理小麦从穗干重增加及千粒重都较对照有显著增加，表明与cis-1R,5S-叶菌唑相比，cis-1S,5R-叶菌唑在小麦扬花期施用对小麦籽粒灌浆及成熟有促进作用。

9.5小麦籽粒萌发效果对比

小麦籽粒收获后除了作为粮食外，一部分也会风干后作为第二年种植的种子，因此在本实施例中考察了于扬花期施用不同叶菌唑对收获小麦籽粒萌发的影响。

表10空白对照组与叶菌唑处理组收获籽粒萌发率

abc代表不同类型叶菌唑处理组之间的差异，不同字母代表有显著差异(p<0.05),相同字母则无显著性差异；

*代表处理组与空白对照组有显著差异，*代表p<0.05,**代表p<0.01。

将处理1、2、3、4收获籽粒进行萌发实验，实验表明，与对照处理(处理4)相比，cis-1R,5S-叶菌唑处理与rac-叶菌唑都显著降低了种子的萌发率。cis-1R,5S-叶菌唑处理与rac-叶菌唑处理组收获籽粒的萌发率与空白对照组相比分别降低了13％和33％。

cis-1S,5R-叶菌唑处理与对照组相比对籽粒的萌发率无显著影响。从对籽粒萌发率的效果来看，在小麦扬花期喷施rac-叶菌唑会强烈抑制籽粒的萌发。

本实施例证明，喷施cis-1R,5S-叶菌唑会抑制小麦籽粒的灌浆和成熟，喷施rac-叶菌唑会小麦成熟籽粒的萌发，因此在小麦扬花期施用叶菌唑时推荐使用对籽粒灌浆、成熟以及成熟后籽粒萌发不利影响最小的cis-1S,5R-叶菌唑。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。