水苏糖在制备预防和/或治疗多囊卵巢综合征药物方面的新用途

摘要

本发明公开了水苏糖在制备预防和/或治疗多囊卵巢综合征药物方面的新用途，本发明首次将从天然植物中提取的水苏糖应用于多囊卵巢综合征相关的研究中，并首次证明了水苏糖可明显改善PCOS的排卵功能障碍，恢复大鼠的排卵功能。相对于目前常用的对症治疗的传统药物而言，水苏糖不但不会给人体造成任何副作用和产生依赖性，而且水苏糖又能很好地被肠道有益菌合理利用，对临床上治疗和/或辅助治疗PCOS具有十分重要的意义。

说明书

技术领域

本发明涉及水苏糖的新用途，尤其是水苏糖在制备预防和/或治疗多囊卵巢综合征药物方面的新用途。

背景技术

水苏糖(Stachyose，STA)是一种四糖，结构式为果糖-葡萄糖-半乳糖-半乳糖，分子式为C

多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome，PCOS)是一种临床表现高度异质性的内分泌代谢紊乱症候群，是育龄妇女无排卵性不孕最主要的原因。其以高雄激素、排卵异常和卵巢多囊样改变为特征，常伴发胰岛素抵抗。但截至目前，其发病机制仍不清楚，针对该病的治疗多为对症治疗，包括改变生活方式、降低雄激素水平，以及使用胰岛素增敏剂改善代谢异常、促排卵等对照治疗方法，但是缺乏病因学治疗的手段。近期，相关研究报道称肠道菌群紊乱是PCOS的重要危险因素，研究表明PCOS与肠道菌群及其代谢产物密切相关(Qi X,Yun C,Sun L,et al.Gut microbiota–bile acid–interleukin-22axisorchestrates polycystic ovary syndrome[J].Nature medicine,2019,25(8):1225-1233.)，该发现为阐明PCOS发病机制的研究提供了重要参考。

目前，未见水苏糖应用于多囊卵巢综合征的预防和/或治疗等方面的研究。本发明针对目前用于防治多囊卵巢综合征的药物存在对人体副作用大、具有剂量依赖性等问题，将从天然植物中提取的水苏糖应用于多囊卵巢综合征相关的研究中，研究发现水苏糖对DHEA诱导的PCOS大鼠模型具有保护作用，可明显改善DHEA诱导的PCOS大鼠模型的排卵功能障碍，恢复大鼠的排卵功能，首次发现并证明了水苏糖在PCOS治疗方面的新用途，此外，相对于目前常用的对症治疗的传统药物而言，水苏糖不但不会给人体正常代谢造成任何副作用和产生依赖性，而且水苏糖作为低聚糖，又能很好的被肠道有益菌合理利用，促进自身的快速增殖，进而降低各类有害菌的种群数量。

发明内容

本发明的目的在于提供水苏糖在制备治疗和/或预防多囊卵巢综合征药物方面的新用途，以解决目前临床上常用于多囊卵巢综合征对症治疗的药物对人体副作用大、具有剂量依赖性等问题，本发明首次将水苏糖用于多囊卵巢综合征的治疗中。

本发明的目的是通过如下技术方案得以实现的：

本发明的第一方面提供了一种药物组合物。

进一步，所述药物组合物包括水苏糖；

优选地，所述水苏糖的使用剂量为200mg/kg；

优选地，所述水苏糖的连续使用周期为12天。

进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或辅料。

本发明所述的水苏糖可作为活性成分直接与药学上可接受的载体和/或辅料按照常规制剂工艺制备成各种形式的药物制剂。

本发明所述的“药学上可接受的载体和/或辅料”是指可以与本发明所述的水苏糖一起施用给患者的任何载体和/或辅料，它们不破坏本发明所述的水苏糖的药理活性。

进一步，所述应用于本发明药物组合物中的可药用载体、辅料包括(但不限于)：离子交换剂，矾土，硬脂酸铝，卵磷脂，半乳化药物递送系统(SEDDS)，例如dα一生育酚，聚乙二醇1000，琥珀酸盐，在药物剂型中使用的表面活性剂，例如吐温或其它类似聚合递送基质，血清蛋白，例如人血清白蛋白，缓冲物质，例如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质，例如硫酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐，胶态二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，基于纤维素的物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡，聚乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，聚乙二醇和羊毛脂。也可以使用环糊精例如α-环糊精、β-环糊精、和γ-环糊精，或化学修饰的衍生物，例如羟基烷基环糊精，包括2-和3-羟基丙基-β-环糊精、或其它增溶衍生物来促进本发明化合物的递送。

本发明所述药物组合物的给药方式包括(但不限于)：口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、阴道给药或通过植入的贮药装置给药，所述非胃肠道给药包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、损伤部位内、和颅内注射或输注技术。优选为口服给药或注射给药。

本发明药物组合物可含有任何常用的无毒可药用载体和/或辅料。在某些情况下，药用酸、碱或缓冲剂可用来调节制剂的pH以提高所配制的化合物或其给药剂型的稳定性。

本发明的第二方面提供了水苏糖在制备治疗多囊卵巢综合征药物中的应用。

进一步，所述水苏糖的使用剂量为200mg/kg；

优选地，所述水苏糖的连续使用周期为12天。

本发明的第三方面提供了一种体外非治疗性地降低哺乳动物雄激素水平、改善卵巢多囊性改变、恢复哺乳动物排卵功能的方法。

进一步，所述方法包括给哺乳动物施用水苏糖；

优选地，所述水苏糖的使用剂量为200mg/kg；

优选地，所述水苏糖的连续使用周期为12天。

进一步，所述施用的方法包括皮下注射、皮内注射、肌肉注射、腹腔注射、静脉注射、口服法、灌胃法；

优选地，所述施用的方法为灌胃法。

进一步，所述雄激素包括(但不限于)：脱氢表雄酮，雄烯二酮，双氢睾酮，硫酸脱氢表雄酮，睾酮。

在本发明的实施例中，所述雄激素优选为睾酮，所述卵巢多囊性改变的指标包括卵巢组织中的黄体数目、囊性卵泡数目，所述排卵功能的指标包括动情周期。

进一步，所述哺乳动物包括雌性哺乳动物；

优选地，所述哺乳动物包括患有多囊卵巢综合征的哺乳动物；

优选地，所述哺乳动物包括人或非人哺乳动物；

更优选地，所述非人哺乳动物包括啮齿动物，如小鼠、大鼠。

在本发明的实施例中，所述非人哺乳动物优选为大鼠。

本发明的第四方面提供了一种筛选预防和/或治疗多囊卵巢综合征候选药物的体系，其特征在于，所述体系包括水苏糖、待测物、非人动物模型。

在本发明的实施例中，优选地，经水苏糖处理的非人动物模型为阳性对照组，经待测物处理的非人动物模型为测试组，经芝麻油处理的非人动物模型为阴性对照组。

进一步，所述非人动物模型为非人哺乳动物模型；

优选地，所述非人哺乳动物包括雌性哺乳动物；

优选地，所述雌性哺乳动物包括患有多囊卵巢综合征的雌性哺乳动物；

更优选地，所述雌性哺乳动物包括啮齿动物，如小鼠、大鼠；

最优选地，所述雌性哺乳动物为大鼠。

进一步，所述处理的方法包括皮下注射、皮内注射、肌肉注射、腹腔注射、静脉注射、口服法、灌胃法；

优选地，所述处理方法为灌胃法。

进一步，所述体系还包括对测试组、阳性对照组和阴性对照组三组的雄激素水平、卵巢多囊性改变情况、排卵功能的恢复情况分别进行检测，并比较各组的实验结果。

进一步，所述雄激素包括(但不限于)：脱氢表雄酮，雄烯二酮，双氢睾酮，硫酸脱氢表雄酮，睾酮。

在本发明的实施例中，所述雄激素优选为睾酮。

进一步，所述睾酮包括(但不限于)：哺乳动物血清中的睾酮、哺乳动物血液中的睾酮。

在本发明的实施例中，所述睾酮优选为哺乳动物血清中的睾酮。

进一步，所述卵巢多囊性改变的检测指标包括卵巢组织中的黄体数目、囊性卵泡数目。

进一步，所述排卵功能的检测指标包括动情周期。

在本发明的实施例中，所述动情周期的检测是通过于每日下午同一时间取哺乳动物的阴道细胞涂片，连续10天，染色后观察细胞形态，并记录分析。

进一步，所述染色方法包括(但不限于)：吉姆萨染色、巴氏染色、邵氏染色、瑞氏染色。

优选地，所述染色方法优选为瑞氏染色。在本发明的实施例中采用瑞氏染色液(LEAGENE，1029A20)对阴道细胞涂片进行染色。

在本发明的实施例中，所述卵巢组织中的黄体数目、囊性卵泡数目的检测是通过对哺乳动物的卵巢组织进行HE染色，并记录分析。

进一步，所述雄激素的检测方法包括(但不限于)：酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫荧光法(FIA)、放射免疫法(RIA)、化学发光免疫分析法(CLIA)、时间分辨荧光分析法(TRFIA)。

在本发明的实施例中，所述雄激素的检测方法优选为酶联免疫吸附测定法(ELISA)。

进一步，如果所述测试组的待测物对非人动物模型的雄激素水平的降低程度、卵巢多囊性改变的改善程度和/或排卵功能的恢复程度显著高于阴性对照组，则提示所述待测化合物是预防和/或治疗多囊卵巢综合征的候选药物。

进一步，如果所述测试组的待测物对非人动物模型的雄激素水平的降低程度、卵巢多囊性改变的改善程度和/或排卵功能的恢复程度与阳性对照组的水苏糖对非人动物模型的雄激素水平的降低程度、卵巢多囊性改变的改善程度和/或排卵功能的恢复程度的比值≥80％，则提示所述待测物是预防和/或治疗多囊卵巢综合征的候选药物。

本发明的第五方面提供了水苏糖在预防和/或治疗多囊卵巢综合征候选药物筛选体系中的应用。

进一步，所述筛选体系如本发明第四方面所述的体系。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次将从天然植物中提取的水苏糖应用于多囊卵巢综合征相关的研究中，并首次证明了水苏糖可明显改善PCOS的排卵功能障碍，恢复大鼠的排卵功能。相对于目前常用的对症治疗的传统药物而言，水苏糖不但不会给人体造成任何副作用和产生依赖性，而且水苏糖作为低聚糖，又能很好地被肠道有益菌合理利用，促进自身的快速增殖，进而降低各类有害菌的种群数量。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1是各组大鼠动情周期的观察，其中，A图：造模期间大鼠体重变化图，B图：Oil+Saline组，C图：DHEA+Saline组，D图：DHEA+STA组；

图2是大鼠卵巢组织HE染色的结果图，其中，A图：Oil+Saline组，B图：DHEA+Saline组，C图：DHEA+STA组，#卵巢黄体，*囊性卵泡；

图3是大鼠卵巢组织中囊性卵泡数目、黄体数目和血清中睾酮水平的统计图，其中，A图：囊性卵泡数目，B图：黄体数目，C图：血清中睾酮水平，*与Oil+Saline组比较，P<0.05，#与DHEA+Saline组比较，P<0.05。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1动物模型的构建

3周龄SD大鼠，分成三组：对照组，PCOS模型组，水苏糖治疗组，每组9-11只。各组大鼠模型的构建方法如下：

(1)对照组(Oil+Saline组)：皮下注射芝麻油200μL，连续注射21天后，连续12天灌胃生理盐水。

(2)PCOS模型组(DHEA+Saline组)：皮下注射脱氢表雄酮(DHEA)(Solarbio，D8950)6mg/100g，200μL，连续注射21天后，连续12天灌胃生理盐水。

(3)水苏糖治疗组(DHEA+STA组)：皮下注射脱氢表雄酮(DHEA)(6mg/100g，200μL)，连续注射21天后，连续12天灌胃水苏糖(TCI，S0397)(200mg/kg)。

造模期间每周称重一次。造模第31天，将三组实验动物分成2部分，每组留3只大鼠于每日下午同一时间取阴道细胞涂片，连续10天，用瑞氏染色液(LEAGENE，1029A20)染色后观察细胞形态。其余大鼠麻醉后分别取血液、卵巢组织样本。

实施例2大鼠动情周期的观察、卵巢组织形态学观察及血清激素的测定分析1、大鼠动情周期的观察

大鼠为全年多发情动物，有较稳定的性周期，分为：动情前期(P)、动情期(E)、动情后期(M)和间情期(D)，每期的阴道粘膜均发生典型的变化，可根据阴道细胞涂片的细胞学特征判断处于哪个时期。本实施例将对照组(Oil+Saline组)、PCOS模型组(DHEA+Saline组)、水苏糖治疗组(DHEA+STA组)三组实验动物中的3只大鼠于每日下午同一时间取阴道细胞涂片，连续10天，用瑞氏染色液(LEAGENE，1029A20)染色后观察细胞形态，并分别记录和统计实验结果。

2、卵巢组织HE染色

将新鲜卵巢组织固定于4％多聚甲醛，24h后用于HE染色。将取到的材料在灭菌预冷的PBS中洗净，尽量彻底洗掉血液，以免切片观察时红细胞影响结果，分别用50％和70％酒精脱水1h，样品在70％酒精中置于4℃保存直至石蜡包埋，组织块从70％酒精中取出，在80％、95％、100％酒精中各脱水1h，组织块在100％酒精/二甲苯(1:1)中透明30min；再到二甲苯中透明，具体时间根据组织块大小而定，以组织块完全透明为宜，包埋机可直接接取加温并过滤好的石蜡液体，组织块在二甲苯/石蜡(1:1)、石蜡、石蜡中各透蜡2h。在包埋盒底先铺上一定厚度的石蜡，置于热台，将组织用镊子放入，调整好方向，将包埋盒置于凉台，使底部略微凝固，继续浇上石蜡，放上切片托，凉台冷冻，浇蜡，冷冻，直至整个蜡块成型。置于凉台，待石蜡彻底凝固后，利用切片托将蜡块取出。把切片刀架上，固定紧，然后利用切片托将蜡块在切片机固定器上夹紧。切片时，将厚度调为5μm，蜡片切成后，右手用小镊子摄蜡片，左手用毛笔沿刀锋轻轻把蜡片分开，切面朝下把切片放入42℃水中，展平后用镊子轻轻将连续蜡片分开，再用载玻片捞起，晾干，放入切片盒。37℃烤片过夜，脱蜡后进行HE染色，并记录实验结果。

3、血清激素的测定分析

ELISA法检测大鼠血清睾酮水平

将对照组(Oil+Saline组)、PCOS模型组(DHEA+Saline组)、水苏糖治疗组(DHEA+STA组)三组的实验动物分别麻醉后取血液样本，采用ELISA法测定各组大鼠血液中的血清睾酮的水平，并记录和统计实验结果。

4、实验结果

结果显示，造模期间大鼠体重持续增加，三组大鼠间体重无差异(见图1A)。Oil+Saline组大鼠具有规律性动情周期(见图1B)，DHEA+Saline处理组大鼠动情周期失常，动情后期/间情期(M/D)大约3-4天(见图1C)，而水苏糖处理后可以在一定程度上恢复相对规律的动情周期(见图1D)，表明水苏糖可改善DHEA诱导的大鼠排卵功能障碍，恢复大鼠的排卵功能。

卵巢组织HE染色结果显示，DHEA+Saline组大鼠卵巢组织中黄体数目减少，囊性卵泡数目增多，水苏糖处理后大鼠卵巢组织中黄体数目增多，囊性卵泡数目降低(见图2A-C和图3A、B)。与Oil+Saline组大鼠相比，DHEA+Saline处理后可以显著上调大鼠血清中睾酮水平，水苏糖处理后，睾酮水平下降，并恢复到正常水平(见图3C)。表明水苏糖对DHEA诱导的PCOS大鼠具有保护作用。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。