一种异补骨脂素衍生物、制备方法和在CIK细胞体外培养方面的应用

摘要

本发明公开了一种异补骨脂素衍生物、制备方法和在CIK细胞体外培养方面的应用，制备方法为：取适量异补骨脂素，加入质量分数为0.5％的氢氧化钠溶液，置于365nm紫外光下照射，过滤，滤液与等体积质量分数为10％的盐酸溶液混合，静置后用乙酸乙酯对混合液萃取，乙酸乙酯萃取液浓缩，硅胶柱纯化，根据薄层板收集异补骨脂素衍生物。本发明提供的异补骨脂素衍生物比异补骨脂素具有更好的水溶性，还可以用于CIK细胞体外培养提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，而异补骨脂素无这种活性。

说明书

技术领域

本发明属于化学生物领域，具体涉及一种异补骨脂素衍生物、制备方法和在CIK细胞体外培养方面的应用。

背景技术

肿瘤的生物免疫治疗手段作为肿瘤的第四种治疗手段日益受到重视。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killercell，CIK)是肿瘤生物免疫治疗的主力军。国内的一些临床研究机构也相继开展了这方面的研究工作并取得了一定的成效。体外培养获得高杀伤力的CIK细胞是将其输入肿瘤患者体内发挥抗肿瘤活性的关键。

异补骨脂素是一种生物活性丰富的天然化合物，其化学结构如下：

异补骨脂素由于是内酯的形式，水溶性差。目前未见其开环形式化合物的报道。

发明内容

本发明旨在提供一种异补骨脂素衍生物、制备方法和在CIK细胞体外培养方面的应用。

本发明上述目的通过如下方案实现：

一种异补骨脂素衍生物，化学结构如下：

上述异补骨脂素衍生物的制备方法，步骤为：取适量异补骨脂素，加入质量分数为0.5％的氢氧化钠溶液，置于365nm紫外光下照射，过滤，滤液与等体积质量分数为10％的盐酸溶液混合，静置后用乙酸乙酯对混合液萃取，乙酸乙酯萃取液浓缩，硅胶柱纯化，根据薄层板收集异补骨脂素衍生物。

优选地，置于365nm紫外光下照射48h。

优选地，静置12h后用乙酸乙酯萃取3次。

上述异补骨脂素衍生物用于CIK细胞体外培养提高其对肿瘤细胞杀伤力的用途，所述肿瘤细胞为白血病细胞。

有益效果：

本发明提供的异补骨脂素衍生物比异补骨脂素具有更好的水溶性，还可以用于CIK细胞体外培养提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，而异补骨脂素无这种活性。

附图说明

图1为异补骨脂素衍生物的合成路线图；

图2为CIK细胞中TLR7蛋白表达测定的Western blot结果。

具体实施方式

下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。

实施例1：异补骨脂素衍生物的制备和结构确证

合成路线图如图1所示：

取5g异补骨脂素，加入100mL质量分数为0.5％的氢氧化钠溶液，置于365nm紫外光下照射48h，过滤，滤液与等体积质量分数为10％的盐酸溶液混合，静置12h后用等体积乙酸乙酯对混合液萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，浓缩，硅胶柱纯化，根据薄层板收集异补骨脂素衍生物，收率94％，HPLC纯度99.2％。根据高分辨质谱提供的分子量确定分子式为C

实施例2：活性测试

一、实验材料

GT-T551无血清培养基购自日本TAKARA公司。

各种试剂或试剂盒均为常规市售的试剂或试剂盒。

异补骨脂素衍生物按照实施例1方法制备。

二、实验方法

1、单个核细胞分离、CIK细胞诱导培养和流式检测

采集健康志愿者外周血，用4℃预冷的PBS缓冲液等体积稀释，然后缓慢加入淋巴细胞分离液上层，于650g、4℃离心20min，收集白色细胞层，即分离得到单个核细胞，用生理盐水洗涤后，用含5％自体血清的GT-T551培养基调至起始密度为2.0×10

于第0天加入IFN-γ1000U/mL，置于37℃、5％CO

取0d和培养至9d的细胞，按常规的流式操作规程，以FITC-CD3、APC-CD56单抗检测CD3

2、CCK-8法测定异补骨脂素衍生物对CIK细胞杀伤活性的影响

效应细胞的制备：取培养至9d的CIK细胞，消化后用含5％自体血清、IL-2 1000U/mL的GT-T551培养基制成细胞悬液，细胞浓度为2×10

分别以药物组和对照组的CIK细胞为效应细胞，以对数生长期的K562细胞为靶细胞，分别用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基制成2×10

杀伤率＝[1-(实验组OD值-效应细胞组OD值)/靶细胞组OD值]×l00％。

3、Western blot法测定CIK细胞中TLR7蛋白表达的影响

取培养至9d的CIK细胞，消化后用含5％自体血清、IL-2 1000U/mL的GT-T551培养基制成细胞悬液，细胞浓度为2×10

4、数据处理

采用SPSS17.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±SD表示。组间比较采用t检验，p<0.05代表具有显著性差异。

三、实验结果

1、单个核细胞分离、CIK细胞诱导培养和流式检测结果

单个核细胞中CD3

2、对CIK细胞杀伤活性的影响

CCK-8法测定结果如表1所示，与对照组相比，20μg/mL、50μg/mL异补骨脂素衍生物干预过的药物组的CIK细胞明显具有更高的肿瘤杀伤活性，并且可见剂量依赖效应。

异补骨脂素作用不明显。

表1各组CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤率(％)

该结果表明，异补骨脂素衍生物具有明显的体外提高CIK细胞杀伤活性的作用。

3、异补骨脂素衍生物对CIK细胞中TLR7蛋白表达的影响

Western blot检测结果如图2所示，与对照组相比，20μg/mL、50μg/mL异补骨脂素衍生物组CIK细胞中TLR7蛋白表达水平具有一定程度的提高。TLR7在CIK细胞培养中扮演重要角色，TLR7激动剂具有增强CIK效应细胞杀瘤活性的作用。该结果说明，异补骨脂素衍生物对CIK细胞杀伤活性的提高可能与激活TLR7蛋白表达有关。

上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。