一株白色木霉真菌及其在航天食品废弃物降解中的应用

摘要

本发明公开了一株白色木霉真菌及其在航天食品废弃物降解中的应用，该白色木霉真菌为白色木霉真菌DD2(Trichoderma album DD2)，已于于2020年7月22日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏号为CCTCC NO:M2020339。本发明通过对白色木霉真菌DD2进行培养，得到菌种发酵液，取航天食品废弃物加入菌种发酵液，混匀，得发酵混合物，然后装入食品自封袋，打透气孔，然后平铺于塑料降解箱中；自然降解，完成航天食品废弃物的降解。本发明的白色木霉真菌DD2，菌丝体生长速度快、酶系丰富，具有良好的产纤维素酶活力，其纤维素酶活性(Up)为20.85±3.84，远高于已报道的同属菌株，能够高效降解有机物中的糖类、纤维素，可用于航天生物质废弃物的微生物降解处理，应用前景良好。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株白色木霉真菌及其在航天食品废弃物降解中的应用。

背景技术

随着我国航空航天事业(尤其是载人航天、太空站的运行)的快速发展，伴随产生的航天固体废弃物，如宇航员大便、食物残渣、蔬菜水果废弃物等垃圾问题，易导致航天器环境污染、细菌滋生，危害航天器的正常运行和宇航员的身体健康。此类废弃物的处置一直成为一个难题。

微生物降解法是处理航空生物可降解废弃物的常用方法，可以用来处理固体废弃物的微生物可分为两大类：好氧微生物和厌氧微生物。在处理生物质基废弃物过程中，通过添加有益功能微生物菌剂，可加快废弃物降解进程，促进分解，是一种低成本、环境友好型的处置技术。

木霉(Trichoderma spp.)，菌落呈白色，致密，菌丝细长，呈扩散状生长形成白色菌丝生长带，后期菌落产生绿色孢子，初级变为灰绿色。好氧，在自然界中分布广泛，常见的木霉主要有绿色木霉、康宁木霉、长枝木霉等。近年来，高效产纤维素木霉菌的选育及其在生物质基废弃物处置领域的应用逐渐受到关注，但国内对木霉菌降解航天自然型食品废弃物的研究及应用却鲜有报道。

另外，公告号为CN105176833A的专利公开了一种产纤维素酶的木霉菌RUT-C30，其最高滤纸酶活为8.28U/mL，纤维素降解能力不强，说明其对纤维素的降解能力较弱，降解航天食品废弃物的效率不高。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种白色木霉真菌，其特征在于，该白色木霉真菌为白色木霉真菌DD2(Trichoderma album DD2)，已于于2020年7月22日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏号为CCTCC NO:M2020339。

优选的是，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供一种采用如上述的白色木霉真菌制备菌种发酵液的方法，包括以下步骤：

步骤一、取保藏号为CCTCC NO:M2020339的白色木霉真菌DD2，接种于改良马丁液体培养基中，接种量为改良马丁液体培养基体积的1～2％(v/v)；25～28℃、120～150rpm培养4～7d，得到600nm下吸光值为0.9-1.2的种子菌悬浮液；

步骤二、取步骤一制备的种子菌悬浮液，接种至白色木霉真菌液体发酵培养基中，接种量为白色木霉真菌液体发酵培养基体积的2.5～5.0％(v/v)，25～28℃、120～150rpm培养4～8d，得到菌种发酵液。

优选的是，所述步骤一中，在培养的过程中，每隔6～8小时施加一次静电场，所述静电场的场强为30～40kV/m，每次静电场施加的时间为60～90min，且相邻的两次施加的静电场的电场方向相反。

所述步骤二中，在培养至中间时间时，将白色木霉真菌液体发酵培养基置于高压脉冲电场处理室中进行高压脉冲电场处理5～8小时，然后继续正常培养剩余时间；所述高压脉冲电场处理参数为：脉冲宽度为8～10μs，脉冲频率15～25Hz，脉冲电场强度为5～12kV·cm。

优选的是，所述改良马丁液体培养基包括如下配比的组分：

蛋白胨4～6g/L，酵母浸出粉1.5～3g/L，葡萄糖15～20g/L，磷酸氢二钾0.5～1g/L，硫酸镁0.3～0.6g/L，pH 6.0～7.0；

优选的是，所述白色木霉真菌液体发酵培养基包括如下配比的组分：

马铃薯粉10～50g/L，葡萄糖2～10g/L，pH 5.5～7.5。

本发明还提供一种如上述的菌种发酵液在航天食品废弃物降解中的应用。

优选的是，按重量份，取8.5～9份航天食品废弃物、加入菌种发酵液1～1.5重量份，混匀，得发酵混合物；调节发酵混合物的水分含量为55～60％(w/w)，然后装入食品自封袋，打透气孔，然后平铺于于塑料降解箱中；置于25-30℃环境中，每隔2天翻堆1次，自然降解20～30天，取出，即完成航天食品废弃物的降解。

优选的是，所述航天食品废弃物为废弃果皮、果核、蔬菜叶、馒头、面条、米饭中的一种或多种的混合。

优选的是，按重量份，取航天食品废弃物、加入菌种发酵液0.25-0.5重量份，混匀，得发酵混合物；调节发酵混合物的水分含量为55～60％(w/w)，然后装入高压釜中，通入二氧化碳至釜内压强为10～15MPa，在温度为30～35℃下，保持90～120min，然后泄压，将混合物装入食品自封袋，打透气孔，然后平铺于塑料降解箱中；置于25～30℃环境中，每隔2天翻堆1次，自然降解10～15天，取出，即完成航天食品废弃物的降解。

本发明至少包括以下有益效果：

(1)本发明保藏号：CCTCC NO:M2020339的白色木霉真菌DD2(Trichoderma albumDD2)，菌丝体生长速度快、酶系丰富，具有良好的产纤维素酶活力，其纤维素酶活性(Up)为20.85±3.84，远高于已报道的同属菌株，能够高效降解有机物中的糖类、纤维素，可用于航天生物质废弃物的微生物降解处理，应用前景良好。

(2)采用本发明保藏号：CCTCC NO:M2020339的白色木霉真菌DD2(Trichodermaalbum DD2)制备发酵菌液，可直接以马铃薯粉为原料，成本低廉、发酵效率高，发酵3～6天后就可获得含有高活性纤维素酶、有效活菌的发酵液，将发酵液作为添加剂，施加到食品废弃物中，能够高效降解有机物中的糖类、纤维素，实现固体废弃物的快速减容减量。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明：

图1为本发明白色木霉真菌DD2的扫描仪扫描照片。

具体实施方式：

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

实施例1：

一种白色木霉真菌，该白色木霉真菌为白色木霉真菌DD2(Trichoderma albumDD2)，已于于2020年7月22日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏号为CCTCC NO:M2020339；

对于本发明的白色木霉真菌DD2的分离鉴定；

一、鉴定方法

从西南科技大学校园内的苔藓中分离得到本发明菌株，进行分子生物学鉴定。取分离得到的菌株，接种至PDA培养基中，25-28℃培养72小时，观察菌丝体形态；

采用真菌DNA提取试剂盒抽提菌株的基因组DNA，常规PCR技术扩增菌株ITS基因序列(ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4:5’-CCTCCGCTTATTGATATGC-3’)，具体操作：将真菌接种在PDA平板上，25-28℃培养小时，取适量菌丝体至研钵中，液氮冷冻后快速研磨，取100mg研磨样品，真菌DNA提取试剂盒抽提总DNA；菌株ITS扩增采用通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-CCTCCGCTTATTGATATGC-3’)为上下游引物对菌株进行PCR扩增；凝胶电泳检测扩增效果合格后，将PCR产物进行测序；将所得ITS序列在NCBI网站进行Blast比对，分析菌株分类地位。

二、鉴定结果

(1)形态特征

本发明菌株菌丝体发达、菌落为白色，致密，四周扩散生长；菌落中央产生绿色孢子；菌丝白色，纤细，宽度为1.2～2.6微米；簇生分生孢子；本发明菌株符合木霉属的特征。

(2)ITS序列及分析

本发明菌株的ITS基因序列长度为619bp，序列如SEQ ID NO.1所示；根据ITS基因序列网上序列比对，将其鉴定为木霉属。结合菌体形态特征、分子生物学特征，将本发明分离菌株鉴定为木霉真菌(Trichoderma album)，命名为白色木霉真菌DD2(Trichodermaalbum DD2)，并于2020年7月22日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCCNO:M2020339。

实施例2：

本发明白色木霉真菌DD2(Trichoderma album DD2)的纤维素酶活力检测

一、实验方法

(1)菌种活化：无菌开启菌种管，无菌操作，将本发明白色木霉真菌DD2(Trichoderma album DD2)菌种接种至接种至PDA液体培养基中，25-28℃培养96小时，备用；

(2)纤维素酶活性测定：采用3.5-二硝基水杨酸法测定纤维素酶催化纤维素降解产生的还原糖的含量；纤维素酶活力(U·mg-1prot-1)：以每毫克组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1μg葡萄糖定义为一个酶活力单位；测定步骤为：收集培养后的真菌培养液到离心管内，离心后弃上清；加入1mL磷酸缓冲液(pH7.0)，超声冰浴破碎后；4℃、8,000g离心10min，取上清液待测；采用纤维素酶(CL)活性检测试剂盒测定纤维素酶活力；

2、实验结果

采用3,5-二硝基水杨酸法测定了本发明菌株的纤维素酶活力，测定结果显示白色木霉真菌DD2(Trichoderma album DD2)纤维素酶活力达到20.85±3.84；在相同条件下，本发明白色木霉真菌DD2(Trichoderma album DD2)的产纤维素酶能力(20.85±3.84)远高于已报道的木霉菌RUT-C30(8.28U/mL)，能够高效降低植物纤维，可用于航天食品废弃物的生物降解。

实施例3：

一种采用白色木霉真菌制备菌种发酵液的方法，包括以下步骤：

步骤一、菌种活化：无菌开启菌种管，无菌操作，将白色木霉真菌DD2(Trichodermaalbum DD2)菌种划线接种于PDA培养基，26℃培养36h后，封口膜密封后4℃保存，备用；将活化的菌种接种于改良马丁液体培养基中，接种量为改良马丁液体培养基体积的1％(v/v)；26℃、120rpm培养6d，得到600nm下吸光值为0.9-1.2的种子菌悬浮液；所述改良马丁液体培养基包括如下配比的组分：蛋白胨5g/L，酵母浸出粉2g/L，葡萄糖17g/L，磷酸氢二钾0.8g/L，硫酸镁0.5g/L，pH 7；

步骤二、取步骤一制备的种子菌悬浮液，接种至白色木霉真菌液体发酵培养基中，接种量为白色木霉真菌液体发酵培养基体积的4％(v/v)，26℃、120～pm培养6d，得到菌种发酵液；所述白色木霉真菌液体发酵培养基包括如下配比的组分：马铃薯粉30g/L，葡萄糖7g/L，pH 6；

取该实施例的菌种发酵液，逐步梯度稀释法进行平板计数，统计真菌孢子数，进行有效活菌数测定。结果显示，真菌孢子数达到9.89±0.41(10

实施例4：

一种采用白色木霉真菌制备菌种发酵液的方法，包括以下步骤：

步骤一、菌种活化：无菌开启菌种管，无菌操作，将白色木霉真菌DD2(Trichodermaalbum DD2)菌种划线接种于PDA培养基，26℃培养36h后，封口膜密封后4℃保存，备用；将活化的菌种接种于改良马丁液体培养基中，接种量为改良马丁液体培养基体积的1％(v/v)；26℃、120rpm培养6d，得到600nm下吸光值为0.9-1.2的种子菌悬浮液；所述改良马丁液体培养基包括如下配比的组分：蛋白胨5g/L，酵母浸出粉2g/L，葡萄糖17g/L，磷酸氢二钾0.8g/L，硫酸镁0.5g/L，pH 7；在接种于改良马丁液体培养基中培养的过程中，每隔8小时施加一次静电场，所述静电场的场强为35kV/m，每次静电场施加的时间为60min，且相邻的两次施加的静电场的电场方向相反；通过静电场的刺激作用，实现促进菌种在改良马丁液体培养基中的生长；

步骤二、取步骤一制备的种子菌悬浮液，接种至白色木霉真菌液体发酵培养基中，接种量为白色木霉真菌液体发酵培养基体积的4％(v/v)，26℃、120pm培养6d，得到菌种发酵液；所述白色木霉真菌液体发酵培养基包括如下配比的组分：马铃薯粉30g/L，葡萄糖7g/L，pH 6；在培养至3d时，将白色木霉真菌液体发酵培养基置于高压脉冲电场处理室中进行高压脉冲电场处理6小时，然后继续正常培养剩余时间；所述高压脉冲电场处理参数为：脉冲宽度为10μs，脉冲频率20Hz，脉冲电场强度为10kV·cm；采用高压脉冲电场可以促进种子菌悬浮液的增殖和发酵活动；

取该实施例的菌种发酵液，逐步梯度稀释法进行平板计数，统计真菌孢子数，进行有效活菌数测定。结果显示，真菌孢子数达到11.24±0.56(10

实施例5：

一种实施例3制备的菌种发酵液在航天食品废弃物降解中的应用，取90g航天食品废弃物、加入菌种发酵液12g，混匀，得发酵混合物；调节发酵混合物的水分含量为60％(w/w)，然后装入食品自封袋，打透气孔，然后平铺于塑料降解箱中；置于30℃环境中，每隔2天翻堆1次，自然降解25天，取出，航天食品废弃物质量减少75％；所述航天食品废弃物为10g废弃果皮、20g果核、20g蔬菜叶、25g馒头、20g面条、5g米饭的混合。

实施例6：

一种实施例4制备的菌种发酵液在航天食品废弃物降解中的应用，取90g航天食品废弃物、加入菌种发酵液12g，混匀，得发酵混合物；调节发酵混合物的水分含量为60％(w/w)，然后装入食品自封袋，打透气孔，然后平铺于塑料降解箱中；置于30℃环境中，每隔2天翻堆1次，自然降解25天，取出，航天食品废弃物质量减少85％；所述航天食品废弃物为10g废弃果皮、20g果核、20g蔬菜叶、25g馒头、20g面条、5g米饭的混合。

实施例7：

一种实施例3制备的菌种发酵液在航天食品废弃物降解中的应用，取90g航天食品废弃物、加入菌种发酵液12g，混匀，得发酵混合物；调节发酵混合物的水分含量为60％(w/w)，然后装入高压釜中，通入二氧化碳至釜内压强为12MPa，在温度为35℃下，保持100min，然后泄压，将混合物装入食品自封袋，打透气孔，然后平铺于塑料降解箱中；置于30℃环境中，每隔2天翻堆1次，自然降解12天，取出，取出，航天食品废弃物质量减少87％；所述航天食品废弃物为10g废弃果皮、20g果核、20g蔬菜叶、25g馒头、20g面条、5g米饭的混合；采用超临界CO

实施例8：

一种实施例4制备的菌种发酵液在航天食品废弃物降解中的应用，取90g航天食品废弃物、加入菌种发酵液12g，混匀，得发酵混合物；调节发酵混合物的水分含量为60％(w/w)，然后装入高压釜中，通入二氧化碳至釜内压强为12MPa，在温度为35℃下，保持100min，然后泄压，将混合物装入食品自封袋，打透气孔，然后平铺于塑料降解箱中；置于30℃环境中，每隔2天翻堆1次，自然降解12天，取出，取出，航天食品废弃物质量减少93％；所述航天食品废弃物为10g废弃果皮、20g果核、20g蔬菜叶、25g馒头、20g面条、5g米饭的混合。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

<110> 西南科技大学

<120> 一株白色木霉真菌及其在航天食品废弃物降解中的应用

<160> 3

<210> 1

<211> 619

<212> DNA

<213> 中国典型培养物保藏中心的保藏号为：CCTCC NO: M2020339的白色木霉真菌

<223> ITS基因序列

<400> 1

GGAAGTAAAA GTCGTAACAA GGTCTCCGTT GGTGAACCAG CGGAGGGATC ATTACCGAGT 60

TTACAACTCC CAAACCCAAT GTGAACGTTA CCAAACTGTT GCCTCGGCGG GATCTCTGCC 120

CCGGGTGCGT CGCAGCCCCG GACCAAGGCG CCCGCCGGAG GACCAACCAA AACTCTTTTG 180

TATACCCCCT CGCGGGTTTT TATATCTGAG CCATCTCGGC GCCTCTCGTA GGCGTTTCGA 240

AAATGAATCA AAACTTTCAA CAACGGATCT CTTGGTTCTG GCATCGATGA AGAACGCAGC 300

GAAATGCGAT AAGTAATGTG AATTGCAGAA TTCAGTGAAT CATCGAATCT TTGAACGCAC 360

ATTGCGCCCG CCAGTATTCT GGCGGGCATG CCTGTCCGAG CGTCATTTCA ACCCTCGAAC 420

CCCTCCGGGG GGTCGGCGTT GGGGATCGGC CCTTTACGGG GCCGGCCCCG AAATACAGTG 480

GCGGTCTCGC CGCAGCCTCT CCTGCGCAGT AGTTTGCACA CTCGCATCGG GAGCGCGGCG 540

CGTCCATTGC CGTAAAACAC CCAACTTTCT GAAATGTTGA CCTCGGATCA GGTAGGAATA 600

CCCGCTGAAC TTAAGCATA 619

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 中国典型培养物保藏中心的保藏号为：CCTCC NO: M2020339的白色木霉真菌

<223> ITS基因的上游引物序列

<400> 2

TCCGTAGGTGAACCTGCGG 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 中国典型培养物保藏中心的保藏号为：CCTCC NO: M2020339的白色木霉真菌

<223> ITS基因的下游引物序列

<400> 3

CCTCCGCTTATTGATATGC 19