紫花苜蓿逆境响应基因MsCBL10及其编码蛋白与应用

摘要

本发明公开了紫花苜蓿逆境响应基因MsCBL10及其编码蛋白与应用，主要涉及植物基因工程技术领域。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，其编码的MsCBL10蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.12所示。本发明的有益效果在于：该基因在烟草中过量表达可提高转基因烟草植株的干旱和盐胁迫的抗性，该基因可用于其他林草植物的遗传转化，提高其抗逆性。

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体是紫花苜蓿逆境响应基因MsCBL10及其编码蛋白与应用。

背景技术

逆境胁迫，尤其是干旱和盐碱胁迫，是目前人类面临的世界性问题，也是影响作物正常生长发育和限制作物产量的主要环境因子。紫花苜蓿(Medicago Sativa L.)是属于中等耐盐植物，作为世界上种植最广的豆科牧草，盐碱和干旱等非生物胁迫是严重制约紫花苜蓿生长和品质高低的重要因素。

随着生物技术的发展，借助植物基因工程手段培育植物新品种已成为现代育种的重要途径，农杆菌介导法是最常用的转基因方法。1986年农杆菌介导的苜蓿转化首次获得成功之后，借助紫花苜蓿的遗传转化体系，苜蓿转基因工作取得了长足的发展。将Alfin1基因转入苜蓿，在过量表达的转基因植株中，苜蓿内源盐诱导基因PRP2的表达上调，同时，过量表达的转基因植株表现出较强的耐盐性(Winicov and Bastola，1999)。不同浓度的NaCl处理转BADH基因苜蓿，转入的BADH基因可以稳定遗传且正常表达，同时，转基因苜蓿的耐盐性明显高于对照(燕丽萍等，2009)。

植物在生长发育过程中易遭受多种生物或非生物胁迫，因而在长期的进化过程中，它们形成了复杂的防御机制。类钙调神经素B亚基蛋白(Calcineurin B-like protein，CBL)家族是一类植物中特有的钙感受器，在细胞响应外界生物或非生物胁迫过程中发挥重要作用。当感应到胁迫刺激时，细胞通过增加Ca

发明内容

本发明的目的在于提供紫花苜蓿逆境响应基因MsCBL10及其编码蛋白与应用，该基因在烟草中过量表达可提高转基因烟草植株的干旱和盐胁迫的抗性，该基因可用于其他林草植物的遗传转化，提高其抗逆性。

本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：

紫花苜蓿逆境响应基因MsCBL10，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

作为本发明的另一个方面，为紫花苜蓿逆境响应基因MsCBL10编码的蛋白，该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

作为本发明的另一个方面，为紫花苜蓿逆境响应基因MsCBL10在调节植物抗干旱耐盐胁迫中的应用。

进一步的，具体应用时，将含基因MsCBL10的植物表达载体导入植物细胞或种子，使该基因过量表达，从而获得抗干旱、耐盐胁迫能力高于野生型植株的转基因植株。

所述植物选自紫花苜蓿、烟草。

进一步的，上述应用包括以下步骤：

根据基因MsCBL10序列的过量表达引物，构建获得过量表达载体为pCAMBIA2300-MsCBL10质粒；

将所述过量表达载体质粒导入根癌农杆菌LBA4404中，用所得菌液对植物组织进行浸染，使用头孢霉素筛选植株；

使用头孢霉素诱导生长后，壮苗、移栽。

进一步的，所述植物组织为烟草叶片。

进一步的，所述过量表达引物为：

CBLEF：5′-GGGGTACCATGCCTACTCATTCCCCTGATG-3′；

CBLER：5′-GCGTCGACTCAATTTCCAGCTTCTGATTTG-3′。

进一步的，构建获得过量表达载体包括：将含有MsCBL10基因的质粒用KpnI和SalI酶切后，与被KpnI和SalI酶切的pCAMBIA2300载体进行连接。

作为本发明的另一个方面，一种通过过量表达基因MsCBL10获得转基因植物的方法，将含基因MsCBL10的植物表达载体导入植物细胞或种子，使该基因过量表达，从而获得抗干旱、耐盐胁迫能力高于野生型植株的转基因植株。

对比现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明提供了紫花苜蓿逆境响应基因MsCBL10的全长CDS，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。本发明提供的MsCBL10基因结构特性分析表明：MsCBL10基因CDS全长为750bp，该基因编码249个氨基酸。原核细胞表达诱导研究表明MsCBL10蛋白大小为28kDa。本发明公开的MsCBL10基因为研究苜蓿逆境响应分子机理研究和分子定向育种提供了理论依据。

本发明公开了含有上述的紫花苜蓿逆境响应基因MsCBL10的克隆载体，进一步构建了含有上述的紫花苜蓿逆境响应基因MsCBL10的过量表达载体，最后将构建的植物表达载体通过农杆菌介导法转化到烟草中，筛选获得转基因植株。在干旱和盐胁迫处理下，转基因植株与对照相比表现出了更强的抗逆性，说明该基因参与了植物的抗逆过程。MsCBL10基因的功能鉴定有助于揭示紫花苜蓿的抗逆机制，对苜蓿乃至林草的遗传育种和品种改良都具有重要的意义。

附图说明

图1为RT-PCR方法获得基因MsCBL10的电泳图，其中M为2000bp Marker，1为PCR产物。

图2为MsCBL10的蛋白结构域。

图3为MsCBL10与其他物种的蛋白同源树。

图4为MsCBL10基因在紫花苜蓿根、茎、叶、花和果实中的表达模式。

图5为MsCBL10基因在盐胁迫6h、24h和48h后的表达模式。

图6为pGEX4T-1-MsCBL10原核表达的电泳图，其中M为蛋白Marker，1为未处理的pGEX4T-1-MsCBL10，2为0.5M IPTG诱导4h后的pGEX4T-1-MsCBL10，3为未处理的pGEX4T-1，4为0.5M IPTG诱导4h后的pGEX4T-1。

图7为根癌农杆菌介导法转化再生的烟草生根苗。

图8为转基因烟草RT-PCR检测，其中M为2000bp Marker，WT为对照，1、2、3为转MsCBL10基因的烟草株系。

图9为转基因烟草苗子的抗旱性分析，其中CK为对照，1、2、3为转MsCBL10基因的烟草株系。

图10为转基因烟草种子在盐胁迫下的生长分析，其中CK为对照，1、2、3为转MsCBL10基因的烟草株系。

图11为不同浓度盐胁迫对转基因烟草相对电导率的影响结果，其中CK为对照，L1、L2、L3为转MsCBL10基因的烟草株系。

图12为不同浓度盐胁迫对转基因烟草叶绿素含量的影响结果，其中CK为对照，L1、L2、L3为转MsCBL10基因的烟草株系。

图13为不同浓度盐胁迫对转基因烟草MDA含量的影响结果，其中CK为对照，L1、L2、L3为转MsCBL10基因的烟草株系。

图14为不同浓度盐胁迫对转基因烟草SOD活性的影响结果，其中CK为对照，L1、L2、L3为转MsCBL10基因的烟草株系。

图15为不同浓度盐胁迫对转基因烟草POD活性的影响结果，其中CK为对照，L1、L2、L3为转MsCBL10基因的烟草株系。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所限定的范围。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1：紫花苜蓿逆境响应基因MsCBL10的获得

(1)RNA的提取：用TRIzol试剂(Invitrogen)法提取紫花苜蓿RNA。

(2)cDNA合成：利用Reverse Transcriptase XL(AMV)(TaKaRa)进行cDNA第一链的合成。

(3)引物设计：在NCBI数据库中搜索并下载已知的蒺藜苜蓿MtCBL10序列文本文件，利用该序列设计引物，引物为：

MsCBL10F：5′-ATGCCTACTCATTCCCCTGATG-3′(SEQ ID NO.1)；

MsCBL10R：5′-TCAATTTCCAGCTTCTGATTTG-3′(SEQ ID NO.2)。

(4)PCR反应：聚合酶链式反应(PCR)试剂与条件为：

将下列试剂混合在一起：

PCR反应条件为：94℃预变性5min；然后进入下列循环：94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸10min。

(5)如图1所示，扩增得到约750bp大小的条带。将PCR产物回收目的条带并连接到pMD18-T(TaKaRa)载体中的EcoRV位点。

(6)重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，筛选阳性克隆进行测序(上海博尚)。

(7)最终鉴定得到MsCBL10基因ORF的全长。MsCBL10基因全长750bp，该基因编码249个氨基酸。将其氨基酸序列与MtCBL10蛋白氨基酸序列经DNAMAN软件分析，如图2所示，发现其与MtCBL10相比，氨基酸同源性为98％。在EMBL中SMART分析，发现MsCBL10蛋白具备CBL的保守结构域。图3为MsCBL10蛋白与其他物种的蛋白聚类树。

实施例2：MsCBL10基因在紫花苜蓿不同组织中的表达模式

为探究MsCBL10基因在紫花苜蓿不同组织中的表达模式，提取紫花苜蓿根、茎、叶、花和果实的总RNA，反转录成cDNA，用于实时荧光定量PCR分析，检测MsCBL10基因在紫花苜蓿不同组织的表达情况。

根据MsCBL10基因的全长cDNA序列设计荧光定量表达引物，目的序列长184bp，引物为：

YGCBLF：5′-AGCTCTGTAATTGATGATGGCTTG-3′(SEQ ID NO.3)；

YGCBLR：5′-TTGGGGCATAAGGATGGAAA-3′(SEQ ID NO.4)。

以紫花苜蓿ACTIN2基因(JQ028730)为内参基因，设计荧光定量表达引物，目的序列长197bp，引物为：

ACTINF：5′-CCCACTGGATGTCTGTAGGTT-3′(SEQ ID NO.5)；

ACTINR：5′-AGAATTAAGTAGCAGCGCAAA-3′(SEQ ID NO.6)。

如图4所示，结果表明MsCBL10基因在紫花苜蓿根、茎和花中表达量较低，在叶和果实中表达量较高，其中MsCBL10基因在果实中的表达量是根中表达量的9.9倍，在叶中的表达量是根中表达量的2.1倍。

实施例3：MsCBL10基因在紫花苜蓿盐胁迫下的表达模式

为探究MsCBL10基因在紫花苜蓿盐胁迫下不同时间内的表达模式，用200mM NaCl处理紫花苜蓿幼苗，处理时间为6h、24h和48h，以未作处理的作为对照，处理完成后分别提取各处理的幼苗总RNA，反转录成cDNA，用于实时荧光定量PCR分析。引物同实施例2。

如图5所示，结果表明MsCBL10基因表达受NaCl的诱导表达量升高，在盐胁迫48h后MsCBL10基因表达量达到最高，是对照的3.4倍。

实施例4：MsCBL10基因原核表达载体的构建

(1)引物设计：利用基因MsCBL10序列设计原核表达引物，引物为：

YHCBLF：5′-CGGGATCCATGATGCCTACTCATTCC-3′(SEQ ID NO.7)；

YHCBLR：5′-GCGTCGACCATTTCCAGCTTCTGATTTG-3′(SEQ ID NO.8)。

(2)PCR反应：

将下列试剂混合在一起：

PCR反应条件同实施例1(4)。

(3)将PCR产物回收目的条带并连接到pMD18-T(TaKaRa)载体中的EcoRV位点。

(4)重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，筛选阳性克隆进行测序确认。

(5)用BamHI和SalI对pGEX4T-1载体进行酶切反应，回收后备用；提取含有MsCBL10基因的质粒，用BamHI和SalI进行酶切，回收后与酶切回收的pGEX4T-1载体进行连接反应。

(6)将连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆进行测序确认。

(7)提取连接好的pGEX4T-1-MsCBL10质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)，筛选阳性克隆进行测序确认。

实施例5：MsCBL10基因原核表达

挑取测序正确的阳性菌落于LB液体培养基中培养至OD600值0.6～1.0，加IPTG至终浓度为0.5mM，37℃诱导表达4h，离心，弃上清。加PBS溶液重悬菌体，加入等体积的2倍上样缓冲液，沸水浴加热5min。12000rpm离心30s，取10uL上清液上样。

SDS-PAGE中，分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为4％。步骤如下：

(1)安装好电泳槽。

(2)制备分离胶：

使总体积为20mL。

加入TEMED并混匀后，立即将分离胶到入两块玻璃板之间，并马上在胶面覆盖一层ddH2O，保持胶面水平，静置30min至胶完全凝固。

(3)将上层ddH2O倒去，用吸水纸吸干，制备浓缩胶：

加入TEMED并混匀后，立即将分离胶到入两块玻璃板之间，插上样品梳，于室温静置40min至胶完全凝固。

(4)取20μL样品上样。

(5)加入电泳缓冲液(500mL：Glycine 7.2g，Tris-HCl 1.5g，SDS 0.5g)加120伏电压至溴酚兰刚好跑出分离胶。

(6)卸下胶板，将凝胶置于50mL染色液中，于室温染色1h。

(7)将凝胶取出放入10％冰醋酸脱色液中脱色，每2～3h更换一次脱色液，至完全脱净。

(8)观察是否有差异带，并用数码相机拍照。MsCBL10基因编码的蛋白质的分子量理论值为28kDa，而GST表达蛋白的分子量为26kDa，由此推算MsCBL10-GST融合蛋白的分子量约为54kDa，如图6所示，SDS-PAGE图谱在54kDa附近处有表达明显的条带，与推算结果相符合。表明重组质粒pGEX4T-1-MsCBL10在大肠杆菌BL21(DE3)中成功经IPTG诱导成功表达了MsCBL10蛋白。

实施例6：MsCBL10基因过量表达载体的构建

(1)引物设计：利用基因MsCBL10序列设计过量表达引物，引物为：

CBLEF：5′-GGGGTACCATGCCTACTCATTCCCCTGATG-3′(SEQ ID NO.9)；

CBLER：5′-GCGTCGACTCAATTTCCAGCTTCTGATTTG-3′(SEQ ID NO.10)。

(2)PCR反应：PCR反应试剂与条件同实施例1(4)。

(3)将PCR产物回收目的条带并连接到pMD18-T(TaKaRa)载体中的EcoRV位点。

(4)重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，筛选阳性克隆进行测序确认。

(5)用KpnI和SalI对pCAMBIA2300载体进行酶切反应，回收后备用；提取含有MsCBL10基因的质粒，用KpnI和SalI进行酶切，回收后与酶切回收的pCAMBIA2300载体进行连接反应。

(6)将连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆进行测序确认。

(7)提取连接好的pCAMBIA2300-MsCBL10质粒，转化根癌农杆菌LBA4404，筛选阳性克隆进行测序确认。

实施例7：根癌农杆菌介导法转化烟草

含有pCAMBIA2300-MsCBL10质粒的根癌农杆菌LBA4404在含有50mg/L Rif和抗生素的YEP液体培养基中28℃振荡培养至对数生长期(OD600＝0.6)。将烟草(NC89)无菌苗叶片切割成0.5cm

实施例8：转基因植株的功能分析

(1)转基因烟草的检测

提取对照和转基因烟草幼苗总RNA，反转录成cDNA，用于RT-PCR分析。如图8所示，对照WT中未检测到目的基因，转基因株系1、2、3样品均获得长约750bp的单一条带，与目的基因大小一致。这表明MsCBL10基因已经整合入基因组，并且可以过量表达。

待阳性转基因烟草开花结实后，单株收集转基因种子，进行种子和苗子的胁迫处理分析。

(2)转基因烟草苗子的抗旱性分析

将长至3～4叶期的转基因烟草苗进行干旱处理，然后再进行浇水复苏，看幼苗生长情况。干旱处理过程中，对照和转基因烟草均表现出叶片卷曲、萎蔫叶脉和茎端弯曲等。当经过长时间处理之后，如图9所示，可以看出对照(CK)和转基因烟草(株系1、2、3)均叶片均变黄、枯萎，整株已经接近死亡；当经过后期浇水后，转基因烟草苗已经恢复到正常，叶片也逐渐变绿；但对照和之前干旱处理后一样，没有恢复过来，已经因长期缺水而死亡。这说明转基因烟草对干旱环境有着较强的抗性，从而证明MsCBL10基因能够提高植物对干旱胁迫的抗性。

(3)转基因烟草种子在盐胁迫下的生长分析

转基因烟草(株系1、2、3)和非转基因烟草(CK)分别用75％乙醇消毒30～60s，用4％的次氯酸钠消毒10min，播种到1/2MS培养基、含50mM NaCl的1/2MS培养基和含100mMNaCl的1/2MS的培养基上，待幼苗长至2叶时，观察幼苗生长情况。如图10所示，结果表明，在无盐胁迫影响的条件下，转基因烟草的长势和非转基因烟草的植株的长势没有太大的差别，而在受不同浓度盐胁迫下，转基因烟草植株仍能正常的生长，且转基因烟草的长势明显要好于非转基因烟草植株，根长和生物量也明显大于非转基因植株。通过对比可得出，非转基因植株不适合在盐环境下生长，而转基因植株可以在盐胁迫下生长良好，这就说明转基因植株在盐环境下有一定的抵抗力。由此推断，MsCBL10基因可提高植物对盐胁迫的抗性。

(4)盐胁迫对转基因烟草相对电导率的影响

植物维持正常生理功能的重要因素之一是胞原生质膜的选择透性，其对植物的伤害程度可由相对电导率值的大小来反映。当细胞受到的伤害越小，植物细胞膜受损程度越低，相对电导率也就越低。如图11所示，说明烟草在不同浓度NaCl的影响下，对照(CK)与转基因植株(株系L1、L2、L3)的相对电导率均有不同程度的提升，但转基因株系上升的幅度始终在对照之下。当NaCl浓度在50mmol/L和150mmol/L时，对照和转基因植株的之间的变化不是特别明显；而当NaCl浓度在250mmol/L时，转基因植株与照植株相比差异显著。这说明盐胁迫已经对对照的烟草叶片的膜结构造成的明显的损害，使膜系统功能受阻；转基因烟草与对照相比，转基因株系表现出较高的膜稳定性，受到的损害较轻。

(5)盐胁迫对转基因烟草叶绿素含量的影响

NaC1可以提高植物叶片中叶绿素酶的活性，致使叶绿素分解，从而使叶绿素含量降低，最终降低植物的光合作用。如图12所示，结果表明，随着盐浓度的增大，烟草叶片整体上呈现下降的趋势，与正常条件下对照(CK)的差异明显。盐胁迫下烟草叶片的叶绿素含量下降，与转基因植株(株系L1、L2、L3)相比，对照植株在盐浓度较高时下降幅度较大。

(6)盐胁迫对转基因烟草MDA含量的影响

MDA是膜脂过氧化作用的主要产物之一，若在植物体内过多的积累会对细胞产生毒害作用，因此常用其含量反映植物遭受胁迫损害的程度。如图13所示，随着NaCl浓度的提高，对照烟草(CK)叶片中MDA含量迅速提高，且提高的速度要明显高于转基因植株(株系L1、L2、L3)，这表明转基因烟草的抗性有所提高，说明MsCBL10基因有抑制膜脂过氧化的作用。

(7)盐胁迫对转基因烟草抗氧化酶活性的影响

植物在正常生理条件下，细胞中活性氧处于平衡中，一旦打破这种平衡，就会对植物造成伤害。盐胁迫对植物的伤害主要是致使活性氧在体内大量积累，破坏膜结构。SOD能使植物体内的超氧阴离子(O

POD能使H

<110> 山东省林业科学研究院

<120> 紫花苜蓿逆境响应基因MsCBL10及其编码蛋白与应用

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<213> Medicago sativa

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<212> PRT

<213> Medicago sativa

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Met Pro Thr His Ser Pro Asp Val Ser Arg Gly Ile Gly Glu Cys Phe

1 5 10 15

Asn Ala Ala Leu Met Pro Leu Ile Ala Val Phe Glu Val Phe Val Phe

20 25 30

Ala Val Thr Gly Cys Phe Asn Ser His Leu Pro Asn Phe His Thr Gln

35 40 45

Lys Ser Ala Phe Thr Ala Lys Asp Phe Ile Arg Leu Ala Gln Glu Thr

50 55 60

Arg Phe Thr Val Asn Glu Val Glu Ala Leu His Glu Leu Phe Lys Lys

65 70 75 80

Ile Ser Ser Ser Val Ile Asp Asp Gly Leu Ile His Lys Val Glu Leu

85 90 95

Gln Leu Ala Leu Phe Gln Thr Pro Asn Gly Glu Asn Leu Phe Leu Asp

100 105 110

Arg Val Phe Asp Ile Phe Asp Glu Lys Arg Asn Gly Val Ile Glu Phe

115 120 125

Asp Glu Phe Val His Ala Leu Ser Val Phe His Pro Tyr Ala Pro Met

130 135 140

Asp Glu Lys Ile Asp Phe Ala Phe Lys Leu Tyr Asp Leu Arg Gln Thr

145 150 155 160

Gly Phe Ile Glu Pro Glu Glu Val Lys Gln Met Val Ile Ala Ile Leu

165 170 175

Met Glu Ser Glu Met Asn Leu Ser Asp Asp Leu Leu Glu Ala Ile Val

180 185 190

Asp Lys Thr Ile Ala Asp Val Asp Gln Asp Asn Asp Gly Lys Ile Ser

195 200 205

Lys Glu Asp Trp Lys Thr Phe Val Ser Arg Asn Pro Ser Leu Leu Lys

210 215 220

Asn Met Thr Leu Pro Tyr Leu Lys Asp Ile Thr Thr Ala Phe Pro Ser

225 230 235 240

Phe Ile Phe Lys Ser Glu Ala Gly Asn

245