一种丁香假单胞菌豌豆致病变种微滴式数字PCR分子检测方法

摘要

本发明提供一种丁香假单胞菌豌豆致病变种微滴式数字PCR分子检测方法，属于生物技术领域。该检测方法使用引物A1F、A1R和探针AP1，引物B3F、B3R和探针BP3。引物A1F、A1R的序列如SEQ ID NO:1‑2所示，TaqMan探针AP1的序列如SEQ ID NO:3所示，引物B3F、B3R的序列如SEQ ID NO:4‑5所示，TaqMan探针BP3的序列如SEQ ID NO:6所示，AP1和BP3的5’端均结合有荧光发光基团FAM，3’端均结合有荧光猝灭基团TAMRA。本发明检测方法，可快速、灵敏、准确、高特异性地对口岸进口的豌豆种子进行丁香假单胞菌豌豆致病变种的检测。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种丁香假单胞菌豌豆致病变种微滴式数字PCR分子检测方法。

背景技术

豌豆细菌性疫病的病原菌为丁香假单胞菌豌豆致病变种(Pseudomonas syringaepv.pisi)，属于薄壁菌门(Gracilicutes)假单胞菌科(Pseudomonadaceae)假单胞菌属(Pseudomonas)丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的致病变种，革兰氏阴性菌。该病菌主要寄主为豌豆(Pisum sativum)，自然条件下也可侵染扁豆(Lablab purpureus)、山黧豆(Lathyrus odoratus)、宽叶山黧豆(L.latifolius)、野豌豆属(Vicia spp.)和孟加拉野豌豆(V.benghalensis)。该病菌可引起寄主植物花梗、花和豆荚等萎蔫枯死，导致植株猝倒，早期侵染可造成严重损失，对产量影响较大。

豌豆细菌性疫病为我国禁止进境植物检疫性细菌病害，1915年首次报道在美国科罗拉多州发生,随后该病害迅速扩散至世界各豌豆重要生产区，我国尚无分布。

豌豆细菌性疫病菌主要随种子进行远距离传播，病菌在种子表面或种子内部可存活数个生长季节，经表面药剂处理后的种子内部仍有病菌存活，因此极难防治。

豌豆是我国第一大食用豆进口品种，中国是全球第二大进口国，加拿大、美国是我国的豌豆主要进口国。豌豆细菌性疫病在加拿大广泛分布，美国的加利福利亚州、科罗拉多州、堪萨斯州、纽约州、华盛顿州、威斯康辛州均有分布。海关从加拿大进口豌豆中多次检出过该病菌，因此，该病菌随进口豌豆等大宗农产品传入、定殖和扩散的可能性都很大，并可随种子的调运在国内传播。因此，豌豆细菌性疫病病原菌已成为我国豌豆生产潜在的巨大威胁。

丁香假单胞菌P.syringae寄主范围广，常见的致病变种已达60多种，种内致病变种的区分和鉴定一直是植物病原细菌鉴定中的难点。因寄主范围相近，在对进口豌豆疫情检测中，丁香假单胞菌豌豆致病变种与丁香致病变种、菜豆变种、大豆变种常常并存，难以区分。同时，丁香假单胞菌豌豆致病变种根据8个不同豌豆栽培种无毒基因(A)与抗性基因(R)的相互作用被分为8个生理小种。根据病原菌特异性片段，并以此设计引物进行PCR扩增，8个生理小种分别扩增出272bp或132bp片段，因此将8个生理小种分为两个系统发育群，I群为1、3B、4B、5、7生理小种，II群为2、3A、4A、6、8生理小种。从现有研究资料来看，II群相对来说更常见。对致病变种的鉴定，采用生理生化方法耗费时间较长，同时一些理化鉴定结果易于因为主观上的差异从而不能客观反应不同致病变种之间的差异。近些年，在分子生物学检测方法上，进行了较多的尝试，但存在特异性不足、耗时较长等问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种丁香假单胞菌豌豆致病变种微滴式数字PCR分子检测方法，可快速、灵敏、准确、高特异性地对口岸进口的豌豆种子进行丁香假单胞菌豌豆致病变种的检测。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

用于丁香假单胞菌豌豆致病变种的组合物，包括组合物1和组合物2，所述组合物1含有引物A1F、A1R和探针AP1，所述组合物2含有引物B3F、B3R和探针BP3；所述引物A1F、A1R的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，TaqMan探针AP1的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示，TaqMan探针AP1的5’端结合有荧光发光基团FAM，3’端结合有荧光猝灭基团TAMRA；引物B3F、B3R的序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示，TaqMan探针BP3的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，TaqMan探针BP3的5’端结合有荧光发光基团FAM，3’端结合有荧光猝灭基团TAMRA。

在本发明中，丁香假单胞菌豌豆致病变种包括I群和II群。

本发明还提供一种丁香假单胞菌豌豆致病变种微滴式数字PCR分子检测方法，包含如下步骤：

(1)将豌豆样品采用生理盐水浸泡过夜，离心取沉淀，提取基因组DNA；

(2)以所述基因组DNA为模板，采用引物B3F、B3R和探针BP3进行微滴式数字PCR检测；若阳性微滴数大于0，则待测样品中含有丁香假单胞菌豌豆致病变种；若阳性微滴数小于或等于0，则进行步骤(3)；

(3)以所述基因组DNA为模板，采用引物A1F、A1R和探针AP1进行微滴式数字PCR检测；若阳性微滴数大于0，则待测样品中含有丁香假单胞菌豌豆致病变种；若阳性微滴数小于或等于0，则样品中无丁香假单胞菌豌豆致病变种。

在本发明中，所述丁香假单胞菌豌豆致病变种微滴式数字PCR分子检测方法，其特征在于微滴式数字PCR检测中的反应体系包括：10μL的ddPCR supermix(2×)、0.4μL的上游引物、0.4μL的下游引物、0.2μL的TaqMan探针、2μL基因组DNA和7μL的ddH

在本发明中，微滴式数字PCR检测中的反应条件为：95℃预变性10min；94℃变性30s，60度退火及延伸60s，共40个循环；98℃固化微滴10min。

本发明丁香假单胞菌豌豆致病变种微滴式数字PCR分子检测方法，使用病原菌DNA测试至结束，不超过两小时即可得出结论,因此可快速、灵敏、准确、高特异性地对口岸进口的豌豆种子进行丁香假单胞菌豌豆致病变种的检测，无需外部标准等优点。本发明适合对进境豌豆种子中豌豆疫病菌的检测，尤其适合细菌浓度较低时的检测，具有良好的应用前景。

本申请相关研究由南京海关科技计划资助项目2018KJ57资助。

附图说明

图1豌豆细菌性疫病菌I型特异性检测图，上面的横坐标表示样品编号，A08、E08、F08、G08、H08分别是丁香假单胞菌豌豆致病变种I群生理小种1、丁香假单胞菌豌豆致病变种II群生理小种2、丁香假单胞菌菜豆致病变种(P.savastanoi pv.phaseolicola)、丁香假单胞菌丁香致病变种(P.syringae pv.syringae)和瓜类果斑病菌(Acidovoraxcitrulli)。纵坐标代表微滴数(0以上表示阳性微滴数，0以下表示阴性微滴数)。

图2显示了采用微滴式数字PCR分子检测方法对丁香假单胞菌豌豆致病变种I群生理小种1的最低检测浓度，上面的横坐标表示样品编号，A08、B08、C08、D08、E08、F08、G08、H08分别是浓度为0.1ng/ul、0.01ng/ul、0.001ng/ul、0.0001ng/ul的丁香假单胞菌豌豆致病变种I群生理小种1基因组DNA、丁香假单胞菌大豆致病变种(P.savastanoipv.glycinea)、丁香假单胞菌菜豆致病变种(P.savastanoi pv.phaseolicola)、丁香假单胞菌丁香致病变种(P.syringae pv.syringae)基因组DNA、空白对照的扩增结果。纵坐标代表微滴数(0以上表示阳性微滴数，0以下表示阴性微滴数)。

图3豌豆细菌性疫病菌II型特异性检测图，上面的横坐标表示样品编号，A07、E07、F07、G07、H07分别是丁香假单胞菌豌豆致病变种II群生理小种2、丁香假单胞菌豌豆致病变种I群生理小种1、丁香假单胞菌菜豆致病变种(P.savastanoi pv.phaseolicola)、丁香假单胞菌丁香致病变种(P.syringae pv.syringae)和瓜类果斑病菌(Acidovoraxcitrulli)。纵坐标代表微滴数(0以上表示阳性微滴数，0以下表示阴性微滴数)。

图4豌豆细菌性疫病菌II型浓度检测图，上面的横坐标表示样品编号，A08、B08、C08、D08、H07分别是浓度为1ng/ul、0.1ng/ul、0.01ng/ul、0.001ng/ul的丁香假单胞菌豌豆致病变种II群生理小种2的DNA和ddH

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1微滴式数字PCR分子检测方法检测丁香假单胞菌豌豆致病变种

1.引物与TaqMan探针的设计和合成

根据NCBI豌豆细菌性疫病菌(丁香假单胞菌豌豆致病变种)I和II群特异性片段序列(登录号:X97404和X97405)，使用Primer Express3.0设计了多对引物及对应的探针。通过大量的实验，发现仅下面的两对寡核苷酸引物和TaqMan探针能够达到较高的灵敏度及特异性。引物A1F、A1R和TaqMan探针AP1用于检测丁香假单胞菌豌豆致病变种I群。引物B3F、B3R和TaqMan探针BP3用于检测丁香假单胞菌豌豆致病变种II群。

各引物和探针的具体序列如下：

A1F(SEQ ID NO:1)：5’-ACAGCCCTAATCCCAAACACA-3’，

A1R(SEQ ID NO:2)：5’-GTCAATGGGAGCATGGACTAACT-3’，

TaqMan探针AP1：5’(FAM)-TCCGATCCATGCGCCAAGCA-(TAMRA)3’。

TaqMan探针AP1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，5’端结合有荧光发光基团FAM(6-羧基荧光素)，3’端结合有荧光猝灭基团TAMRA。

B3F(SEQ ID NO:4)：5’-GCCGCGGTGACCTTGAC-3’，

B3R(SEQ ID NO:5)：5’-TCGGCCTTCGCGTACGT-3’，

TaqMan探针BP3：5’(FAM)-CGCCACGTACCATTTGTGCTGCTTG-(TAMRA)3’。

TaqMan探针BP3的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，5’端结合有荧光发光基团FAM(6-羧基荧光素)，3’端结合有荧光猝灭基团TAMRA。

采用引物A1F、A1R和TaqMan探针AP1对丁香假单胞菌豌豆致病变种I群进行微滴式数字PCR分子检测，扩增产物大小为272bp。采用引物B3F、B3R和TaqMan探针BP3对丁香假单胞菌豌豆致病变种II群进行微滴式数字PCR分子检测，扩增产物大小为132bp。以上Taq Man探针和PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

2.采用微滴式数字PCR分子检测方法检测丁香假单胞菌豌豆致病变种

采用微滴式数字PCR分子检测方法检测丁香假单胞菌豌豆致病变种的方法，包括如下步骤：

(1)分别取丁香假单胞菌豌豆致病变种(生理小种1-8)、丁香假单胞菌丁香致病变种(P.syringae pv.syringae)、丁香假单胞菌菜豆致病变种(P.savastanoipv.phaseolicola)和瓜类果斑病菌(Acidovorax citrulli)侵染的豌豆样品100-200g，加入200mL生理盐水，4度浸泡过夜，在10000r/min离心15min，取沉淀用1mL灭菌水悬浮，离心后再次取沉淀提取各细菌的基因组DNA。采用TIANamp Bacteria DNAKit细菌基因组DNA提取试剂盒提取上述各细菌的基因组DNA。

(2)微滴式数字PCR反应体系及条件

①采用各细菌的基因组DNA，以引物B3F、B3R和TaqMan探针BP3，采用微滴式数字PCR分子检测方法，检测待检样品是否含有丁香假单胞菌豌豆致病变种II群。

配制微滴式数字PCR的反应体系(20μL)：

ddPCR supermix(2×):10μL，

10μmol/L的引物B3F:0.4μL，

10μmol/L的引物B3R:0.4μL，

10μmol/L的TaqMan探针BP3:0.2μL，

模板(DNA):2μL，

ddH

其中ddPCR supermix(2×)购自BIO-RAD。

反应条件为：95℃预变性10min；94℃变性30s，60度退火及延伸60s，共40个循环；98℃固化微滴10min。

采用美国BIO-RAD微滴式数字PCR系统进行上述反应并进行分析。扩增结束后，利用微滴读取仪，对扩增的产物进行分析，如果阳性微滴数＞0(如图3)，判定微滴式数字PCR反应为阳性，表示所检测的DNA样品为丁香假单胞菌豌豆致病变种II群(即为2、3A、4A、6、8生理小种中的一种或两种以上)。如果未出现阳性微滴，则所检测的DNA样品可能不含有丁香假单胞菌豌豆致病变种或者含有丁香假单胞菌豌豆致病变种I群。

结果：对丁香假单胞菌豌豆致病变种II群生理小种2、3A、4A、6、8，在模板中基因组DNA浓度为0.1ng/ul的条件下，采用上述微滴式数字PCR分子检测方法，阳性微滴数检测结果依次如下：592、483、497、452、424，均大于0，因此，PCR反应为阳性。其中丁香假单胞菌豌豆致病变种II群生理小种2的检测图如图3所示，丁香假单胞菌豌豆致病变种II群生理小种3A、4A、6、8的检测图类似。丁香假单胞菌豌豆致病变种I群生理小种1、3B、4B、5、7，丁香假单胞菌菜豆致病变种(P.savastanoi pv.phaseolicola)、丁香假单胞菌丁香致病变种(P.syringae pv.syringae)和瓜类果斑病菌(Acidovorax citrulli)无阳性微滴，微滴式数字PCR反应为阴性。

②采用各细菌的基因组DNA，采用引物A1F、A1R和TaqMan探针AP1进行微滴式数字PCR分子检测，检测待检样品是否含有丁香假单胞菌豌豆致病变种I群。

配制微滴式数字PCR的反应体系(20μL)：

ddPCR supermix(2×):10μL，

10μmol/L的引物A1F:0.4μL，

10μmol/L的引物A1R:0.4μL，

10μmol/L的TaqMan探针AP1:0.2μL，

模板(DNA):2μL，

ddH

反应条件为：95℃预变性10min；94℃变性30s，60度退火及延伸60s，共40个循环；98℃固化微滴10min。

采用美国BIO-RAD微滴式数字PCR系统进行上述反应并进行分析。扩增结束后，利用微滴读取仪，对扩增的产物进行分析。如果阳性微滴数＞0，判定PCR反应为阳性，表示所检测的DNA样品为丁香假单胞菌豌豆致病变种I群(即为1、3B、4B、5、7生理小种中的一种或两种以上)。如阳性微滴数＜0，判定PCR反应为阴性，表示所检测的DNA样品中不存在丁香假单胞菌豌豆致病变种或者含有丁香假单胞菌豌豆致病变种II群。

结果：丁香假单胞菌豌豆致病变种I群生理小种1、3B、4B、5、7，在模板中基因组DNA浓度分别为1ng/ul时，采用上述微滴式数字PCR分子检测方法，阳性微滴数检测结果依次如下：4680、4467、4243、4698、4547，均大于0，PCR反应为阳性。其中，丁香假单胞菌豌豆致病变种I群生理小种1的检测图如图1所示，丁香假单胞菌豌豆致病变种I群生理小种3B、4B、5、7的检测图与之类似。丁香假单胞菌豌豆致病变种II群生理小种2、3A、4A、6、8，丁香假单胞菌菜豆致病变种(P.savastanoi pv.phaseolicola)、丁香假单胞菌丁香致病变种(P.syringae pv.syringae)和瓜类果斑病菌(Acidovorax citrulli)无阳性微滴数，微滴式数字PCR反应为阴性。

因此，可以采用如下方法检测豌豆样品中是否含有丁香假单胞菌豌豆致病变种：

①以细菌基因组DNA为模板，采用引物B3F、B3R和探针BP3进行微滴式数字PCR检测，具体方法同标题2下(2)中标题①；若阳性微滴数大于0，则待测样品中含有丁香假单胞菌豌豆致病变种；若阳性微滴数小于或等于0，则进行下面的步骤②；

②以细菌基因组DNA为模板，采用引物A1F、A1R和探针AP1进行微滴式数字PCR检测，具体方法同标题2下(2)中标题②；若阳性微滴数大于0，则待测样品中含有丁香假单胞菌豌豆致病变种；若阳性微滴数小于或等于0，则样品中无丁香假单胞菌豌豆致病变种。

3.对照方法

(1)对照方法1

使用gyrB靶标基因，选取基因中比较特异的两个片段，设计了两组引物和探针的组合物，分别用于扩增丁香假单胞菌豌豆致病变种I群和II群。

第一组引物和探针的组合物序列如下:

引物Ppi-13：5’-AATCGGCACCGGGTATCTC-3’，

引物Ppi-95：5’-CAGGCGCTTGAGCGTCTT-3’，

TaqMan探针Ppi-51：5’(FAM)-CTGGTCAACGACTTCCGCATGGTCA-(TAMRA)3’。

第二组引物和探针的组合物序列如下:

引物Ppi-154：5’-TCGAACAGCTGTCGGATCAC-3’，

引物Ppi-247：5’-TTGTAGACAAGACCCGACTTCTCA-3’，

TaqMan探针Ppi-183：5’(FAM)-CAAGCCTGGCTGGCACTGTTCGAC-(TAMRA)3’。

分别采用上述两组引物和探针的组合物，对丁香假单胞菌豌豆致病变种I型/II型，丁香致病变种、菜豆致病变种、瓜类果斑病菌进行微滴式数字PCR检测，结果发现丁香致病变种、菜豆致病变种、瓜类果斑病菌都出现明显阳性反应，上述引物和探针不能特异性区分豌豆致病变种。

(2)对照方法2

使用hrpA靶标基因，设计了以下引物和探针，用于扩增丁香假单胞菌豌豆致病变种II群。

引物和探针的组合物序列如下:

引物Ppi-14：5’-GCTGCCGCGTTATCTGAAG-3’，

引物Ppi-112：5’-CACAGACCTGCCAGCTCGAT-3’，

TaqMan探针Ppi-43:5’(FAM)-TGCGTCTGGAAAAACTGCCGTCTCA-(TAMRA)3’。

采用上述引物和探针的组合物，对丁香致病变种、菜豆致病变种、瓜类果斑病菌进行微滴式数字PCR检测，结果发现除瓜类果斑，其他菌都出现阳性微滴，所以该引物和探针也不能特异性区分豌豆致病变种。

实施例2丁香假单胞菌豌豆致病变种微滴式数字PCR灵敏度检测

1.丁香假单胞菌豌豆致病变种DNA浓度测定

使用生物分光广度计分别检测丁香假单胞菌豌豆致病变种I(1、3B、4B、5、7生理小种)群和II群(2、3A、4A、6、8生理小种)DNA浓度，并用蒸馏水将浓度调整到10ng/ul，随后逐级稀释至浓度分别为1ng/ul、0.1ng/ul、0.01ng/ul、0.001ng/ul、0.0001ng/ul。

2.微滴式数字PCR反应

①采用丁香假单胞菌豌豆致病变种I群生理小种1的基因组DNA(0.1ng/ul、0.01ng/ul、0.001ng/ul、0.0001ng/ul)为模板，以引物A1F、A1R和TaqMan探针AP1，采用微滴式数字PCR分子检测方法，检测丁香假单胞菌豌豆致病变种I群生理小种1的最低检测浓度。另外设置阴性对照和空白对照，其中阴性对照为丁香假单胞菌大豆致病变种(P.savastanoi pv.glycinea)、丁香假单胞菌菜豆致病变种(P.savastanoipv.phaseolicola)、丁香假单胞菌丁香致病变种(P.syringae pv.syringae)基因组DNA，空白对照为ddH

配制微滴式数字PCR的反应体系(20μL)：

ddPCR supermix(2×):10μL，

10μmol/L的引物A1F:0.4μL，

10μmol/L的引物A1R:0.4μL，

10μmol/L的TaqMan探针AP1:0.2μL，

模板(DNA):2μL，

ddH

反应条件为：95℃预变性10min；94℃变性30s，60度退火及延伸60s，共40个循环；98℃固化微滴10min。

采用美国BIO-RAD微滴式数字PCR系统进行上述反应并进行分析。扩增结束后，利用微滴读取仪，对扩增的产物进行分析。

结果如图2，丁香假单胞菌豌豆致病变种I群生理小种1的检测下限为1×10

采用上述方法对丁香假单胞菌豌豆致病变种I群生理小种3B、4B、5、7的基因组DNA的检测下限也是1×10

②采用丁香假单胞菌豌豆致病变种II群生理小种2的基因组DNA(1ng/ul、0.1ng/ul、0.01ng/ul、0.001ng/ul)为模板，以引物B3F、B3R和TaqMan探针BP3，采用微滴式数字PCR，检测丁香假单胞菌豌豆致病变种II群生理小种2的最低检测浓度。另外设置空白对照，空白对照为ddH

配制微滴式数字PCR的反应体系(20μL)：

ddPCR supermix(2×):10μL，

10μmol/L的引物B3F:0.4μL，

10μmol/L的引物B3R:0.4μL，

10μmol/L的TaqMan探针BP3:0.2μL，

模板(DNA):2μL，

ddH

反应条件为：95℃预变性10min；94℃变性30s，60度退火及延伸60s，共40个循环；98℃固化微滴10min。

采用美国BIO-RAD微滴式数字PCR系统进行上述反应并进行分析。扩增结束后，利用微滴读取仪，对扩增的产物进行分析。

结果如图4，丁香假单胞菌豌豆致病变种II群生理小种2的检测下限为10

采用上述方法对丁香假单胞菌豌豆致病变种II群生理小种3A、4A、6、8的最低检测浓度也是10

SEQUENCE LISTING

<110> 中华人民共和国金陵海关

<120> 一种丁香假单胞菌豌豆致病变种微滴式数字PCR分子检测方法

<130> 20201211

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 21

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<213> artificial

<220>

<223> A1F

<400> 1

acagccctaa tcccaaacac a 21

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<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> A1R

<400> 2

gtcaatggga gcatggacta act 23

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> TaqMan探针AP1的核苷酸序列

<400> 3

tccgatccat gcgccaagca 20

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> B3F

<400> 4

gccgcggtga ccttgac 17

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> B3R

<400> 5

tcggccttcg cgtacgt 17

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> TaqMan探针BP3的核苷酸序列

<400> 6

cgccacgtac catttgtgct gcttg 25