用于治疗与异常的IL-4和/或IL-13表达或活性相关的病症的包含IL-4和/或IL-13的免疫原性产品

摘要

本发明涉及包含与载体蛋白偶联的细胞因子的免疫原性产品，其中细胞因子选自包含IL‑4、IL‑13及其混合物的组，并且其中载体蛋白是CRM197。本发明进一步涉及一种制备本发明的免疫原性产品的方法。本发明还涉及本发明的免疫原性产品在治疗与异常的IL‑4和/或IL‑13表达或活性相关的炎性病症中的治疗用途。

说明书

发明领域

本发明涉及免疫原性产品及其在治疗与异常的IL-4和/或IL-13表达或活性相关的病症，尤其是哮喘、特应性皮炎和变应性病症中的用途。

发明背景

变应性病症是由多种遗传和环境因素之间的相互作用导致的复杂疾病。在过去几十年中观察到的过敏反应增长主要是由同期发生的环境变化予以解释。在所有过敏反应中，过敏性哮喘、变应性鼻炎和食物过敏反应是主要的公共卫生问题，目前各影响全世界至少3亿人。此外，据估计，截止到2050年，全球一半的人口将受到变应性疾病的影响。就年死亡率而言，在全球范围内几乎有300000例由哮喘、食物过敏反应或过敏反应(anaphylaxis)导致的可避免的与过敏反应相关的死亡。因此，变应性疾病的增长已成为导致巨大社会经济负担的全球范围内的重要健康问题，并且对其仍然没有有效的长期疗法。

变应性病症的发病机理是由于免疫系统暴露于变应原。这种暴露被认为是造成耐受性破坏的原因，导致2型免疫应答，其特征为T辅助细胞2型(Th2)细胞因子如白介素4(IL-4)和白介素13(IL-13)的产生、高水平的免疫球蛋白E(IgE)抗体以及发炎的组织内免疫细胞的浸润(infiltration)和扩张。肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞尤其参与含有预先形成的炎性介质如组胺的细胞质颗粒的释放。暴露于变应原后，此变应原被IgE识别并与肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞表面上的受体结合，其促进这些细胞的脱粒，并因此出现临床症状。值得注意的是，由于这些原因，对过敏反应的临床诊断很大程度上基于对变应原特异的IgE的测量。

有趣的是，IL-4和IL-13细胞因子在变应性病症的发病机理中起关键作用。两种细胞因子长期以来都与变应性病症的发病机理相关，并且基于它们的生物学功能，它们是治疗上重要的细胞因子。这两种细胞因子表现相似的结构，并共有一个受体亚基(IL-4Rα)。然而，尽管IL-4和IL-13有很多相似之处，它们也被认为在过敏反应中起着一些不重复的作用。

IL-4是参与过敏反应发展的多效性细胞因子(Gour N.&Wills-Karp M.，2015)，因为在哮喘患者的血清和支气管肺泡灌洗液中观察到IL-4水平的升高。IL-4被认为尤其在过敏反应发展的早期阶段起作用。IL-4的关键作用在于它的多重效应，其驱动过敏反应，如诱导IgE产生、IgE受体表达上调以及0型幼稚T辅助细胞(Th0)分化成Th2淋巴细胞。

2型免疫细胞通过控制体液免疫和B细胞在抗体应答中转换为IgE类，在过敏反应过程中发挥关键作用。因此，Th2细胞是产生Ig(例如IgE、IgG)的介体(mediator)，并产生多种细胞因子以及IL-4和IL-13。

相比之下，IL-13更多地参与变应性反应的效应物和晚期(Gour N.&Wills-KarpM.，2015)。已经显示IL-13足以诱导变应性疾病的主要表现，包括但不限于气道高反应性、粘液产生、气道平滑肌改变和表皮下纤维化。

考虑到参与哮喘的其上已知有IL-4和IL-13起作用的细胞范围，以及与这些白介素相关的致病功能，一种或全部两种细胞因子的中和是治疗变应性炎性病症的可靠方法。因此，由于IL-4和IL-13是治疗过敏反应的有前景的治疗靶标，显然需要改善当前策略以阻断这些分子，以便达到长期的治疗效果。

最近，已开发出新颖疗法来治疗过敏反应。这些基于被动免疫的治疗特别靶向参与过敏反应的致病因子。例如，本领域描述了针对IL-4和IL-13或其受体的重组抗体的使用。然而，重组抗体的使用受到高成本、需要进行重复注射以及出现抗药物抗体(ADA)或其他不良反应的潜在风险的限制。

申请人在本文提供了基于选自IL-4和IL-13的细胞因子与CRM

发明概述

本发明涉及包含与载体蛋白偶联的至少一种细胞因子的免疫原性产品，其中该至少一种细胞因子选自包含IL-4、IL-3及其混合物的组，并且其中该载体蛋白是CRM

在一个实施方案中，该至少一种细胞因子是IL-4。

在一个实施方案中，其中该至少一种细胞因子是IL-13。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性产品包含与IL-4和IL-13均偶联的CRM

本发明进一步涉及一种包含至少一种如上文所述的免疫原性产品的组合物。

在一个实施方案中，该组合物包含至少两种如上文所述的免疫原性产品的混合物。

在一个实施方案中，该组合物包含含有IL-4和CRM

在一个实施方案中，该组合物包含重量比范围为约10:1至约1:10的含有IL-4和CRM

在一个实施方案中，该组合物进一步包含至少一种药学上可接受的赋形剂和/或至少一种佐剂。

在一个实施方案中，该组合物是乳剂。

本发明进一步涉及一种生产如本文所述的免疫原性产品的方法，该方法包括以下步骤：

a)使该至少一种细胞因子与含有NHS-酯，优选N-[γ-马来酰亚胺丁酸琥珀酰亚胺酯(N-[γ-maleimidobutyryloxy]-succinimide ester，sGMBS)的异双功能交联剂接触；

b)使该载体蛋白与含有NHS-酯，优选N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯(N-succinimidyl-S-acetylthioacetate，SATA)的异双功能交联剂接触，以产生载体-SATA复合物；

c)使在步骤(a)获得的sGMBS-细胞因子复合物与在步骤(b)获得的载体SATA复合物接触。

本发明进一步涉及如本文所述的免疫原性产品或如本文所述的组合物，其用于治疗炎性病症。

在一个实施方案中，该炎性病症是与异常的IL-4和/或IL-13表达或活性相关的病症。

在一个实施方案中，该炎性病症选自包含以下的组：哮喘(变应性或非变应性的)、变应性病况(例如食物过敏反应、毒液过敏反应、对动物的过敏反应、药物过敏反应、高IgE综合征、变应性鼻炎、变应性结膜炎和变应性肠胃炎)、特应性病症(如特应性皮炎、荨麻疹(包括慢性特发性荨麻疹和慢性自发性荨麻疹)、湿疹)、大疱性天疱疮(bullouspemphigoid)、呼吸系统病症(例如变应性和非变应性哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD))、鼻息肉病和其他涉及气道炎症的病况(例如嗜酸性粒细胞增多、纤维化和过多的粘液产生，包括囊性纤维化和肺纤维化、系统性硬化病(SSc))；炎性和/或自身免疫病症或病况、胃肠道病症或病况(例如炎性肠疾病(IBD)和嗜酸性食管炎(eosinophilic esophagitis，EE)以及嗜酸性介导的胃肠道疾病(eosinophilic-mediated gastrointestinal disease)、溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)；系统性红斑狼疮、肝病症或病况(例如肝硬化和肝细胞癌)、硬皮病；纤维化疾病或病症(例如肝纤维化(例如由乙型和/或丙型肝炎病毒引起的纤维化))、硬皮病；实体瘤或癌症，例如白血病(例如B细胞慢性淋巴细胞性白血病)、胶质母细胞瘤、淋巴瘤(例如霍奇金淋巴瘤)和肥大细胞增多症。

在一个实施方案中，该炎性病症选自包含以下的组：哮喘(例如变应性哮喘)、特应性皮炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺纤维化、食物过敏反应、鼻息肉病和嗜酸性食管炎。

在一个实施方案中，该炎性病症选自包含以下的组：哮喘(例如变应性哮喘)、特应性皮炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺纤维化和食物过敏反应。

在一个实施方案中，该炎性病症是过敏反应、哮喘或特应性皮炎。

在一个实施方案中，如本文所述的免疫原性产品或组合物诱导变应性受试者对变应原的脱敏。

本发明进一步涉及如本文所述的免疫原性产品或组合物，其用于诱导对特定抗原变态反应的受试者脱敏，其中将所述免疫原性产品或组合物和所述特定抗原施用给变应性的受试者。

本发明进一步涉及一种诱导对特定抗原变态反应的受试者脱敏的方法，其中所述方法包括将如本文所述的免疫原性产品或组合物和所述特定抗原施用给受试者。

本发明还进一步涉及一种增加对特定变应原变态反应的受试者脱敏的效率和/或降低其持续时间的方法，其中将如本文所述的免疫原性产品或组合物施用给所述受试者，并进一步对其进行脱敏处理。

定义

在本发明中，下列术语具有如下含义：

-如本文所用，当指例如量、持续时间等的可测量值时，术语“约”意指涵盖偏离指定值的±20％的变化，或在一些情况下±10％，或在一些情况下±5％，或在一些情况下±1％，或在一些情况下±0.1％，因为这样的变化适合于实施所公开的方法。

-如本文所用，“佐剂”是增强本发明的免疫原性产品的免疫原性的物质。通常给予佐剂以增强免疫应答，并且其是技术人员公知的。

-如本文所用，术语“载体蛋白分子”是指长度为至少15、30或50个氨基酸的蛋白或肽，当其为了形成杂合物与至少一种选自IL-4、IL-13及其混合物的细胞因子部分共价结合时，其使所述至少一种细胞因子的大量抗原被呈递给B淋巴细胞。

-如本文所用，术语“免疫应答”是指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞和由上述细胞或肝产生的大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的行为。

-如本文所用，术语“免疫原性产品”是指与载体蛋白偶联的至少一种细胞因子，其在被施用所述免疫原性产品的受试者(优选哺乳动物)中诱导免疫应答，包括体液免疫应答，即产生中和例如内源性细胞因子的生物学活性的性质的抗体。

-如本文所用，“抑制或中和”选自IL-4、IL-13或其混合物的至少一种细胞因子的“生物学活性”的抗体旨在指，例如通过使用实施例中描述的那些功能性测定法，相比于不存在抗体时该细胞因子的活性水平，抑制该细胞因子的活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％或更多的抗体。

-如本文所用，术语“药学上可接受的赋形剂”是指当施用给哺乳动物(优选人)时，不产生不利的、变应性的或其他不良反应的赋形剂。它包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体或赋形剂是指任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、封装材料或制剂助剂(formulationauxiliary)。对于人的施用，制剂应符合如FDA或EMA等监管局所要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。

-如本文所用，术语“重组蛋白”是指使用重组DNA技术产生的蛋白(例如，细胞因子或载体蛋白CRM

-如本文所用，术语“受试者”旨在包括可在其中引起免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物，特别是人、灵长类动物、狗、猫、马、绵羊等)。优选地，受试者是人。在一个实施方案中，受试者可以是“患者”，即温血动物，优选人，其正在等待接受或正在接受医疗护理，或曾经/正在/将要是医疗程序的客体，或在监控其目标疾病或病况例如炎性病症的发展。在一个实施方案中，受试者是成年人(例如18岁以上的受试者)。在另一个实施方案中，受试者是儿童(例如18岁以下的受试者)。在一个实施方案中，受试者是男性。在另一个实施方案中，受试者是女性。在一个实施方案中，受试者患有，优选被诊断有炎性病症。在一个实施方案中，受试者处于发展炎性病症的风险中。风险因素的示例包括但不限于炎性病症的遗传易感性或家族史。

-如本文所用，术语“治疗有效量”是指有效实现特定生物学结果的如本文所述的免疫原性产品的量。因此，术语“治疗有效量”意指所针对的免疫原性产品的水平或量，其目的在于在不对靶标造成显著的负面或不利的副作用下，(1)延迟或预防目标疾病或病况的发作；(2)减慢或停止目标疾病或病况的一种或多种症状的进展、加重或恶化；(3)引起目标疾病或病况的症状减轻；(4)降低目标疾病或病况的严重性或发生率；或(5)治愈目标疾病或病况。为了预防(prophylactic)或防止(preventive)作用，可以在目标疾病或病况发作之前施用治疗有效量。可选地或另外地，为了治疗作用，可以在目标疾病或病况开始后施用治疗有效量。

-如本文所用，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性(prophylactic)或防止性(preventative)措施二者；其中目的是预防或减慢(减轻)目标疾病或病况。需要治疗的那些包括已经罹患该病况的那些以及易于罹患该病况的那些或想要预防该病况的那些。如果在接受治疗量的如本文所述的免疫原性产品后，受试者表现出以下一种或多种的可观察和/或可测量的改善，则成功“治疗”了受试者的疾病或病况：致病细胞的数量减少；细胞总数中致病细胞的百分比降低；在某种程度上缓解了与特定病况相关的一种或多种症状；发病率和死亡率降低，和/或生活质量问题改善。可以通过医师熟悉的常规程序容易地测量用于评估成功治疗和改善病况的上述参数。

具体实施方式

本发明涉及包含与载体蛋白偶联的至少一种细胞因子的免疫原性产品，其中该至少一种细胞因子选自包含IL-4、IL-13及其混合物的组，并且其中该载体蛋白是CRM

发明人在本文证明，本发明的免疫原性产品与包含KLH而不是CRM

CRM

SEQ ID NO：1

GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS

在一个实施方案中，如Hickey在2018年所述(Hickey等人2018)，可以通过本领域已知的常规方法在自体系统(白喉杆菌(C.diphtheriae))或异源系统(大肠杆菌(E.coli)和荧光假单胞菌(P.fluorescens))中获得CRM

在一个实施方案中，本发明的免疫原性产品包含CRM

术语“同一性”或“同一的”，当用于两个或更多个核酸序列或两个或更多个多肽的序列之间的关系时，是指核酸序列或多肽之间的序列相关性程度，其分别由两个或更多个核酸或氨基酸残基的串之间的匹配数所确定。“同一性”测量由特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)所解决的具有空位比对(如果有的话)的两个或更多个序列中的较小者之间的相同匹配的百分比。通过已知方法可以容易地计算相关核酸序列或多肽的同一性。这些方法包括但不限于描述于以下的那些：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and GenomeProjects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis ofSequence Data,Part 1,Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,NewJersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,AcademicPress,1987；Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.,eds.,M.StocktonPress,New York,1991；和Carillo等人,SIAM J.Applied Math.48,1073(1988)。设计用于确定同一性的优选方法以在所测试的序列之间给出最大的匹配。确定同一性的方法描述在公开可得的计算机程序中。用于确定两个序列之间的同一性的优选计算机程序方法包括ClustalO(Sievers F等人2011)，GCG程序包，其包括GAP(Devereux等人,Nucl.Acid.Res.\2,387(1984)；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,Wis.)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人,J.MoI.Biol.215,403-410(1990))。BLASTX程序可公开获得自国家生物技术信息中心(NCBI)和其他来源(BLAST Manual，Altschul等人NCB/NLM/NIH Bethesda,Md.20894；Altschul等人，如上所述)。也可以使用公知的史密斯沃特曼算法(Smith Waterman algorithm)来确定同一性。

在一个实施方案中，CRM

在一个实施方案中，本发明的免疫原性产品包含CRM

在一个实施方案中，该至少一种细胞因子是IL-4。

在一个实施方案中，IL-4是重组的。可以通过本领域已知的常规方法使用编码IL-4的核酸序列获得重组IL-4。例如，可以通过培养含有包含IL-4基因的表达载体的细胞、收获包涵体并纯化IL-4细胞因子来获得重组IL-4。重组IL-4是可商购的，并且可以购自例如PeproTech(Rocky Hill,NJ,US)。

在本发明的一个实施方案中，IL-4源自哺乳动物。

在一个实施方案中，IL-4是哺乳动物IL-4的变体，其中所述变体与其源自的哺乳动物IL-4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的同一性。

在一个实施方案中，IL-4是全长IL-4。

在另一个实施方案中，该至少一种细胞因子是IL-4的片段，例如包含其源自的IL-4的至少约50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、105个、110个、115个、120个或125个氨基酸(优选连续氨基酸)的IL-4的片段。

在一个实施方案中，所述片段包含IL-4的至少一个特异性表位。

在本发明的一个实施方案中，IL-4是人IL-4，优选重组人IL-4。人IL-4具有序列SEQ ID NO：2(UniProt ID：P05112-1)。

SEQ ID NO：2

HKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAASKNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMREKYSKCSS

在一个实施方案中，IL-4是SEQ ID NO：2的变体，其中所述变体与SEQ ID NO：2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的同一性。

在一个实施方案中，IL-4是全长人IL-4。

在另一个实施方案中，该至少一种细胞因子是人IL-4的片段，例如包含SEQ IDNO：2的至少约50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、105个、110个、115个、120个或125个氨基酸(优选连续氨基酸)的人IL-4的片段。

在一个实施方案中，所述片段包含人IL-4的至少一个特异性表位。

在一个实施方案中，所述片段包含以下序列或由以下序列组成：AQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLW(SEQ ID NO：3)。

在本发明的一个实施方案中，IL-4是鼠IL-4，优选重组鼠IL-4。鼠IL-4具有序列SEQ ID NO：4(UniProt ID：P07750-1)。

SEQ ID NO：4

HIHGCDKNHLREIIGILNEVTGEGTPCTEMDVPNVLTATKNTTESELVCRASKVLRIFYLKHGKTPCLKKNSSVLMELQRLFRAFRCLDSSISCTMNESKSTSLKDFLESLKSIMQMDYS

在一个实施方案中，IL-4是SEQ ID NO：4的变体，其中所述变体与SEQ ID NO：4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的同一性。

在一个实施方案中，IL-4是全长鼠IL-4。

在另一个实施方案中，该至少一种细胞因子是鼠IL-4的片段，例如包含SEQ IDNO：4的至少约50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、105个、110个或115个氨基酸(优选连续氨基酸)的鼠IL-4的片段。

在一个实施方案中，所述片段包含鼠IL-4的至少一个特异性表位。

在本发明的一个实施方案中，IL-4是犬IL-4，优选重组犬IL-4。犬IL-4具有序列SEQ ID NO：5(UniProt ID：O77762-1)。

SEQ ID NO：5

HNFNITIKEIIKMLNILTARNDSCMELTVKDVFTAPKNTSDKEIFCRAATVLRQIYTHNCSNRYLRGLYRNLSSMANKTCSMNEIKKSTLKDFLERLKVIMQKKYYRH

在一个实施方案中，IL-4是SEQ ID NO：5的变体，其中所述变体与SEQ ID NO：5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的同一性。

在一个实施方案中，IL-4是全长犬IL-4。

在另一个实施方案中，该至少一种细胞因子是犬IL-4的片段，例如包含SEQ IDNO：5的至少约50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个或105个氨基酸(优选连续氨基酸)的犬IL-4的片段。

在一个实施方案中，所述片段包含犬IL-4的至少一个特异性表位。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性产品包含以范围为约16:1至约1:2，优选约8:1至约2:1，更优选约4:1的IL-4:CRM

在一个实施方案中，本发明的免疫原性产品包含与CRM

可以通过本领域已知的常规方法来验证免疫原性产品包含与CRM

在一个实施方案中，本文所述的TEST A

按如下进行TEST A

-用针对CRM

-在约37℃下将平板用封闭缓冲液(例如含2％酪蛋白(w/v)的PBS)封闭约90min，

-在约37℃下将平板用从250ng/mL开始以两倍连续稀释(two-fold-serialdilution)的免疫原性产品或用阴性对照如IL-4和CRM

-在约37℃下将平板用针对IL-4的生物素化检测抗体温育约90min，针对IL-4的生物素化检测抗体例如来自Abcam(AB84278)、R&D systems(BAF204)或PeproTech(500-P24BT)的抗IL-4生物素化抗体，或来自Southern Biotech(10204-08)、R&D systems(BAF404)或PeproTech(500-P54BT)的鼠抗IL-4生物素化抗体，

-在约37℃下将平板用链霉亲和素-HRP温育约30分钟，并用OPD底物溶液显色复合物约30分钟，

-在停止酶促反应后，通过分光光度法在490nm处确定所得颜色的强度。

在一个实施方案中，当含有每孔约25ng的本发明的免疫原性产品的孔的光密度是含有阴性对照的孔的光密度的至少约3倍，优选至少约5倍，且更优选至少约10倍时，本领域技术人员可以得出结论：本发明的免疫原性产品(i)被抗IL-4抗体识别，并且(ii)包含与CRM

在一个实施方案中，本发明的免疫原性产品包含与CRM

在一个实施方案中，本发明的免疫原性产品包含鼠IL-4，并且TEST B

-使CTLL-2细胞在补充有2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、1mM HEPES、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素(完全RMPI或RPMIc)和10％(v/v)FBS的RPMI中的终浓度为10ng/mL的IL-2的存在下生长，

-在96孔板中将本发明的免疫原性产品(IL-4/CRM

-作为阳性对照，添加了具有10ng/mL muIL-4的6个孔，并用作最大细胞增殖对照(maximum cell proliferation control)，

-将这些样品添加到每孔的20,000个CTLL-2细胞中，并将平板在约37℃、5％CO

-在培养结束时，使用本领域公知的方法评估细胞活力。这些方法的一个示例如下：根据制造商的说明，将MTS/PMS溶液(Promega,Madison,Wi,US)(其中MTS代表3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)–2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)，内盐；且PMS代表吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate))以40μL/孔加到孔中，并将平板在37℃ 5％CO

在另一个实施方案中，本发明的免疫原性产品包含人IL-4，并且TEST B

根据该实施方案，TEST B

-将HEK-Blue

-将免疫原性产品(IL-4/CRM

-然后将这些稀释样品转移到每孔含有40,000个HEK-Blue

-在培养结束时，使用本领域公知的方法评估激活通路。这些方法的一个示例如下：将QUANTI-Blue

有效剂量50(ED

在TEST B

在一个实施方案中，本发明的免疫原性产品包含与CRM

根据以下方法进行TEST C

将特定总蛋白量的免疫原性产品(例如通过Bradford蛋白测定法确定的)注射到小鼠(3周龄以上)中，在120天内注射三到四次。在一个实施方案中，TEST C

简而言之，用1μg/mL用于制备免疫原性产品的IL-4包被96孔板，并在约2℃至约8℃的温度范围内温育过夜。然后在约37℃下将平板用封闭缓冲液封闭约90min。将100μL免疫前样品和血清样品(免疫前和试验)以两倍连续稀释添加到孔中，例如从起始500dil

在一个实施方案中，当含有试验血清样品的孔的光密度(490nm)比含有免疫前血清样品的孔的光密度高至少约1.5倍，优选至少约2倍时，免疫原性产品被认为是免疫原性的，这意味着它已经在体内诱导抗IL-4抗体。

在这个试验中，将滴度定义为达到测定中ODmax减去相应免疫前样品的OD的50％的血清稀释度。这种计算模式比考虑公知的血清转化滴度要严格得多，但提供了更可靠的分析和更少的假阳性。滴度表达为血清稀释因子(dil

在另一个实施方案中，在TEST C

在一个实施方案中，本发明的免疫原性产品包含与CRM

在一个实施方案中，本发明的免疫原性产品包含鼠IL-4，并且TEST D

-使CTLL-2细胞在RPMIc和10％(v/v)FBS中的终浓度为10ng/ml的IL-2的存在下生长，

-分别以1/200和1μg/mL的终浓度添加血清样品和阳性对照多克隆抗IL-4抗体，并两倍连续稀释在培养板中的每孔25μL的RPMIc+10％(v/v)FBS中。

-然后将muIL-4以2ng/mL的终浓度添加到血清样品和对照中，并然后在室温下温育1小时。

-然后，将每孔20,000个CTLL-2细胞添加到预温育的样品中。然后在约37℃下将平板在5％CO

-在培养结束时，使用本领域公知的方法评估细胞活力。这些方法的一个示例如下：将MTS/PMS溶液以40μL/孔添加到孔中，并将平板在37℃ 5％CO

在另一个实施方案中，本发明的免疫原性产品包含人IL-4，并且TEST D

-将HEK-Blue

-分别以1/200和1μg/mL的终浓度将血清样品、对照抗体(多克隆山羊抗IL-4抗体)稀释在测定培养基中。将血清样品或对照抗体两倍连续稀释在存在终浓度为0.25ng/mL的IL-4的圆底96孔板中，在室温下温育一小时。

-然后将这些混合物添加到每孔含有40,000个HEK-Blue

-在培养结束时，使用本领域公知的方法评估激活通路。这些方法的一个示例如下：将QUANTI-Blue

NC

在TEST D

在一个实施方案中，该至少一种细胞因子是IL-13。

在一个实施方案中，IL-13是重组的。可以使用编码IL-13的核酸序列通过本领域已知的常规方法来获得重组IL-13。例如，可以通过培养含有包含IL-13基因的表达载体的细胞、收获包涵体并纯化IL-13细胞因子来获得重组IL-13。重组IL-13是可商购的，并且可以购自例如PeproTech(Rocky Hill,NJ,US)。

在本发明的一个实施方案中，IL-13源自哺乳动物。

在一个实施方案中，IL-13是哺乳动物IL-13的变体，其中所述变体与其源自的哺乳动物IL-13具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的同一性。

在一个实施方案中，IL-13是全长IL-13。

在另一个实施方案中，该至少一种细胞因子是IL-13的片段，例如包含其源自的IL-13的至少约50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、105个、110个、115个或120个氨基酸(优选连续氨基酸)的IL-13的片段。

在一个实施方案中，所述片段包含IL-13的至少一个特异性表位。

在本发明的一个实施方案中，IL-13是人IL-13，优选重组人IL-13。人IL-13具有序列SEQ ID NO：6(UniProt ID：P35225-1)。

SEQ ID NO：6

LTCLGGFASPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN

在一个实施方案中，IL-13是SEQ ID NO：6的变体，其中所述变体与SEQ ID NO：6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的同一性。

在一个实施方案中，IL-13是全长人IL-13。

在另一个实施方案中，该至少一种细胞因子是人IL-13的片段，例如包含SEQ IDNO：6的至少约50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、105个、110个、115个或120个氨基酸(优选连续氨基酸)的人IL-13的片段。

在一个实施方案中，所述片段包含人IL-13的至少一个特异性表位。

在本发明的一个实施方案中，IL-13是鼠IL-13，优选重组鼠IL-13。鼠IL-13具有序列SEQ ID NO：7(UniProt ID：P20109-1)。

SEQ ID NO：7

PVPRSVSLPLTLKELIEELSNITQDQTPLCNGSMVWSVDLAAGGFCVALDSLTNISNCNAIYRTQRILHGLCNRKAPTTVSSLPDTKIEVAHFITKLLSYTKQLFRHGPF

在一个实施方案中，IL-13是SEQ ID NO：7的变体，其中所述变体与SEQ ID NO：7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的同一性。

在一个实施方案中，IL-13是全长鼠IL-13。

在另一个实施方案中，该至少一种细胞因子是鼠IL-13的片段，例如包含SEQ IDNO：7的至少约50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个或105个氨基酸(优选连续氨基酸)的鼠IL-13的片段。

在一个实施方案中，所述片段包含鼠IL-13的至少一个特异性表位。

在本发明的一个实施方案中，IL-13是犬IL-13，优选重组犬IL-13。犬IL-13具有序列SEQ ID NO：8(UniProt ID：Q9N0W9-1)。

SEQ ID NO：8

SPSPVTPSPTLKELIEELVNITQNQASLCNGSMVWSVNLTAGMYCAALESLINVSDCSAIQRTQRMLKALCSQKPAAGQISSERSRDTKIEVIQLVKNLLTYVRGVYRHGNFR

在一个实施方案中，IL-13是SEQ ID NO：8的变体，其中所述变体与SEQ ID NO：8具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的同一性。

在一个实施方案中，IL-13是全长犬IL-13。

在另一个实施方案中，该至少一种细胞因子是犬IL-13的片段，例如包含SEQ IDNO：8的至少约50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、105个或110个氨基酸(优选连续氨基酸)的犬IL-13的片段。

在一个实施方案中，所述片段包含犬IL-13的至少一个特异性表位。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性产品包含以范围为约16:1至约1:2，优选约8:1至约2:1，更优选约4:1的IL13:CRM

在本发明的一个实施方案中，免疫原性产品包含与CRM

可以通过本领域已知的常规方法来验证免疫原性产品包含与CRM

在一个实施方案中，本文所述的TEST A

按如下进行TEST A

-用针对CRM

-在约37℃下将平板用封闭缓冲液(例如含2％酪蛋白(w/v)的PBS)封闭约90min，

-在约37℃下将平板用从250ng/mL开始以两倍连续稀释的免疫原性产品或阴性对照如IL-13和CRM

-在约37℃下将平板用针对IL-13的生物素化检测抗体温育约90min，针对IL-13的生物素化检测抗体例如来自SouthernBiotech(10126-08)、PeproTech(500-P13BT)或R&Dsystems(BAF213)的抗IL-13生物素化抗体，或来自Bio-Rad(AAM34B)、PeproTech(500-P178BT)或R&D systems(BAF413)的鼠抗IL-13生物素化抗体，

-在约37℃下将平板用链霉亲和素-HRP温育约30min，并用OPD底物溶液显色复合物约30min，

-在停止酶促反应后，通过分光光度法在490nm处确定所得颜色的强度。

在一个实施方案中，当含有每孔约25ng的本发明的免疫原性产品的孔的光密度是含有阴性对照的孔密度的至少约3倍，优选至少约5倍，且更优选至少约10倍时，本领域技术人员可以得出结论：本发明的免疫原性产品(i)被抗IL-13抗体识别，并且(ii)包含与CRM

在另一个实施方案中，本发明的免疫原性产品包含与CRM

在一个实施方案中，TEST B

TEST B

-将HEK-Blue

-将人免疫原性产品(IL-13/CRM

-将鼠免疫原性产品(muIL-13/CRM

-然后将样品转移到每孔含有40,000个HEK-Blue

-在培养结束时，使用本领域公知的方法评估激活通路。这些方法的一个示例如下：将QUANTI-Blue

有效剂量50(ED

在TEST B

在一个实施方案中，本发明的免疫原性产品包含与CRM

根据以下方法进行TEST C

将特定总蛋白量的免疫原性产品(例如通过Bradford蛋白测定法确定的)注射到小鼠(3周龄以上)中，在120天内注射至少三次。在一个实施方案中，TEST C

简而言之，用1μg/mL用于制备免疫原性产品的IL-13包被96孔板，并在约2℃至约8℃的温度范围下温育过夜。然后在约37℃下将平板用封闭缓冲液封闭约90min。以两倍连续稀释将100μL免疫前样品和血清样品(免疫前和试验)添加到孔中，例如从起始500dil

在一个实施方案中，当含有试验血清样品的孔的光密度比含有免疫前血清样品的孔的光密度高至少约1.5倍，优选至少约2倍时，免疫原性产品被认为是免疫原性的，这意味着它已经在体内诱导抗IL-13抗体。

在这个试验中，将滴度定义为达到测定中ODmax减去相应免疫前样品的OD的50％的血清稀释度。这种计算模式比考虑公知的血清转化滴度要严格得多，但提供了更可靠的分析和更少的假阳性。滴度表达为血清稀释因子(dil

在另一个实施方案中，在TEST C

在一个实施方案中，本发明的免疫原性产品包含与CRM

使用HEK-Blue

在有生物活性的IL-13的存在下，HEK-Blue

-将HEK-Blue

-将在施用人免疫原性产品后获得的血清样品和对照抗体(多克隆山羊抗IL-13抗体，例如AF-213-NA)分别以1/100和4μg/mL的终浓度稀释在测定培养基中，并添加2ng/mL的IL-13。

-将在施用鼠免疫原性产品后获得的血清样品和对照抗体(多克隆山羊抗muIL-13抗体，例如AF-413-NA)分别以1/100和1μg/mL的终浓度稀释在测定培养基中，并添加2ng/mL的muIL-13。

-然后将这些混合物在室温下温育1h，随后添加到每孔40,000个HEK-Blue

-在培养结束时，使用本领域公知的方法评估激活通路。这些方法的一个示例如下：将QUANTI-Blue

NC

在TEST D

在一个实施方案中，本发明的免疫原性产品包含IL-4和IL-13。

在一个实施方案中，IL-4、IL-13或两者是重组的。

在一个实施方案中，IL-4和IL-13均源自同一哺乳动物。在一个实施方案中，IL-4、IL-13或两者是人的。

在一个实施方案中，IL-4是人IL-4的变体，其中所述变体与人IL-4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的同一性。在一个实施方案中，IL-13是人IL-13的变体，其中所述变体与人IL-13具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的同一性。

在一个实施方案中，IL-4、IL-13或两者是全长的。

在一个实施方案中，IL-4是全长IL-4的片段。在一个实施方案中，IL-13是全长IL-13的片段。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性产品包含均与CRM

在一个实施方案中，细胞因子(即IL-4和IL-13):CRM

在一个实施方案中，IL-4:CRM197的摩尔比范围是约8:1至约1:2，优选约4:1至约1:1，更优选约2:1。

在一个实施方案中，IL-13:CRM197的摩尔比范围是约8:1至约1:2，优选约4:1至约1:1，更优选约2:1。

在一个实施方案中，IL-4:IL-13的摩尔比范围是约5:1至约1:5，优选约2:1至约1:2，更优选约1:1。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性产品包含与CRM

可以通过本领域已知的常规方法来验证免疫原性产品包含与CRM

在一个实施方案中，可以使用本文所述的TESTS A(TEST A

在一个实施方案中，本发明的免疫原性产品包含与CRM

在一个实施方案中，该免疫原性产品包含与CRM

在一个实施方案中，本发明的免疫原性产品包含与CRM

本发明进一步涉及一种生产免疫原性产品的方法，该免疫原性产品包含选自IL-4、IL-13及其混合物的至少一种细胞因子，并与优选为CRM

a)使该至少一种细胞因子与含有NHS-酯，优选N-[γ-马来酰亚胺丁酸琥珀酰亚胺酯(sGMBS)的异双功能交联剂接触；

b)使该载体蛋白与含有NHS-酯，优选N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)的异双功能交联剂接触，以产生载体-SATA复合物；

c)使在步骤(a)获得的sGMBS-细胞因子复合物与在步骤(b)获得的载体SATA复合物接触。

在一个实施方案中，在步骤a)中，反应缓冲液在液体溶液，优选水溶液中。

在一个实施方案中，在步骤a)中，反应缓冲液的pH范围是约6至约8，优选约6.5至约7.5，更优选约pH 7.2。

在一个实施方案中，在步骤a)中，细胞因子以约0.1至约10mg/mL，优选约0.5至约5mg/mL，更优选约1mg/mL的浓度范围存在于溶液中。

在一个实施方案中，在步骤a)中，在反应缓冲液中以1mM至100mM，优选5mM至50mM，且更优选10mM的浓度范围制备含有NHS-酯，优选sGMBS的异双功能交联剂。

在一个实施方案中，在步骤a)中，将IL-4和含有NHS-酯，优选sGMBS的异双功能交联剂以范围为约1:120至约1:1，优选约1:50至约1:10的IL-4:含有NHS-酯、优选sGMBS的异双功能交联剂摩尔比混合。

在一个实施方案中，在步骤a)中，将IL-13和含有NHS-酯，优选sGMBS的异双功能交联剂以范围为约1:120至约1:1，优选约1:50至约1:10的IL-13:含有NHS-酯、优选sGMBS的异双功能交联剂摩尔比混合。

在一个实施方案中，在步骤a)中，将该至少一种细胞因子与含有NHS-酯，优选sGMBS的异双功能交联剂一起温育范围约30min至约120min，优选约45至约90min，且更优选至少60min的时间段。

在一个实施方案中，在步骤a)中，在约15℃至约35℃，优选约18℃至约27℃的温度范围下进行该至少一种细胞因子与含有NHS-酯，优选sGMBS的异双功能交联剂的接触步骤。

在一个实施方案中，在步骤a)之后，去除存在于反应混合物中的分子量小于约10kDa、小于约5kDa或小于约3kDa的小化合物。这些小化合物主要涵盖过量的含有NHS-酯(和与NHS-酯水解相关的副产物)，优选sGMBS的异双功能交联剂，以及未反应的过量分子。可以通过本领域公知的方法进行这种去除。

在一个实施方案中，在步骤a)结束时，通过Bradford测定法或通过本领域公知的任何方法确定蛋白含量。

在一个实施方案中，在步骤b)中，反应缓冲液在液体溶液，优选水溶液中。

在一个实施方案中，在步骤b)中，反应缓冲液的pH范围是约6至约8，优选约6.5至约7.5，更优选约pH 7.2。

在一个实施方案中，在步骤b)中，CRM

在一个实施方案中，在步骤b)中，含有NHS-酯，优选SATA的异双功能交联剂以范围为20mM至约500mM，优选约50mM至约200mM且更优选约100mM的浓度存在于溶液中，优选于DMSO中。

在一个实施方案中，在步骤b)中，将CRM

在一个实施方案中，在步骤b)中，将CRM

在一个实施方案中，在范围为约15℃至约35℃，优选约18℃至约27℃的温度下进行接触步骤b)。

在一个实施方案中，在步骤b)之后，去除存在于反应混合物中的分子量小于约10kDa、小于约5kDa或小于约3kDa的小化合物。这些小化合物主要涵盖过量的含有NHS-酯(和与NHS-酯水解相关的副产物)，优选SATA的异双功能交联剂，DMSO，以及未反应的过量分子。可以通过本领域公知的方法进行这种去除。

在一个实施方案中，在步骤b)之后，将CRM

将分子脱保护的方法的示例是本领域公知的，且包括但不限于使用羟胺、使用甲氧基胺或使用碱(例如，NaOH、KOH、K

在一个实施方案中，脱保护步骤包括向反应混合物中添加羟胺溶液，优选以范围约10mM至约500mM，优选约20mM至约100mM，更优选约50mM的终浓度。

在一个实施方案中，将羟胺溶液与反应混合物一起温育范围约60min至约180min，优选约90min至约150min，更优选120min的时间段。

在一个实施方案中，在120分钟内以50mM添加羟胺溶液。

在一个实施方案中，在范围约15℃至约35℃，优选约18℃至约27℃的温度下进行羟胺溶液与反应混合物的温育。

在一个实施方案中，在脱保护步骤之后，去除存在于反应混合物中的分子量小于约10kDa、5kDa或3kDa的小化合物。这些小化合物主要涵盖过量的羟胺和来自先前步骤的可能的残余SATA。可以通过本领域公知的方法进行这种去除。

在一个实施方案中，在步骤b)结束时，通过Bradford测定法或通过本领域公知的任何方法确定蛋白含量。

然后，在本发明的方法的步骤c)中，使步骤a)的终产物与步骤b)的终产物接触，从而产生本发明的免疫原性产品。

在一个实施方案中，在步骤c)中，使包含IL-4的步骤a)的终产物和包含CRM

在一个实施方案中，在步骤c)中，使包含IL-13的步骤a)的终产物和包含CRM

在步骤c)的另一个实施方案中，使包含IL-4的步骤a)的终产物、包含IL-13的步骤a)的终产物和步骤b)的终产物接触。在一个实施方案中，以范围约16:1至约1:2，优选约8:1至约2:1，更优选约4:1的细胞因子(即IL-4和IL-13):CRM

在一个实施方案中，在步骤c)中，反应缓冲液在液体溶液，优选水溶液中。

在一个实施方案中，在步骤c)中，反应缓冲液的pH范围是约6至约8，优选约6.5至约7.5，更优选约pH 7.2。

在步骤c)的一个实施方案中，将接触步骤进行范围为约2小时至约26小时，优选约10至18小时，更优选约12至约18小时的时间段。

在一个实施方案中，在范围约2℃至10℃，优选约3℃至约7℃，更优选约4℃的温度下进行温育步骤c)。

在一个实施方案中，在步骤c)之后，去除存在于反应混合物中的分子量小于约100kDa、小于约50kDa、小于约25kDa、小于约10kDa、小于约5kDa或小于约3kDa的小化合物。这些小化合物主要涵盖未反应的过量分子。可以通过本领域公知的方法进行这种去除。

在一个实施方案中，将在步骤c)中获得的免疫原性产品进行浓缩。可以由技术人员通过本领域已知的任何技术进行免疫原性产品的浓缩，例如通过可任选地与无菌过滤组合的离心超滤方法。

在一个实施方案中，将在步骤c)获得并任选浓缩的免疫原性产品冻干。

本发明进一步涉及易于通过本发明的方法获得的免疫原性产品。

本发明进一步涉及包含至少一种如上文所述的免疫原性产品或基本上由其组成或由其组成的组合物。在一个实施方案中，所述组合物可以称为免疫原性组合物。

本发明进一步涉及包含至少一种如上文所述的免疫原性产品以及至少一种药学上可接受的赋形剂或基本上由其组成或由其组成的药物组合物。

可用于本发明的药物组合物中的药学上可接受的赋形剂包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白例如人血清白蛋白、缓冲物质例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质(例如羧甲基纤维素钠)、聚乙二醇、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。

本发明进一步涉及包含至少一种如上文所述的免疫原性产品或基本上由其组成或由其组成的药物(medicament)。

如本文所用，就组合物、药物组合物或药物而言，术语“基本上由……组成”意指该至少一种本发明的免疫原性产品是所述组合物、药物组合物或药物中唯一具有生物活性的治疗剂或剂。

在一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物或药物包含含有与CRM

在一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物或药物包含含有与CRM

在一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物或药物包含含有均与CRM

在一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物或药物包含重量比范围为约10:1至约1:10，优选重量比范围为约4:1至1:4的含有与CRM

在一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物或药物是疫苗组合物。在本发明的一个实施方案中，本发明的疫苗组合物包含至少一种佐剂。

本发明进一步涉及本发明的组合物、药物组合物、药物或疫苗的制剂，其中该组合物、药物组合物、药物或疫苗是佐剂化的(adjuvanted)。

在一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物、药物或疫苗因此包含一种或多种佐剂。

可用于本发明的合适的佐剂包括但不限于：

(1)铝盐(明矾)，例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；

(2)水包油乳剂制剂(含有或不含其他特定的免疫刺激剂，例如，胞壁肽(定义如下)或细菌细胞壁组分)，例如，角鲨烯基乳剂(例如，角鲨烯基水包油乳剂)或角鲨烷基乳剂，例如

(a)MF59(在PCT公开号WO 90/14837中描述的角鲨烯基水包油佐剂)，含有5％角鲨烯、0.5％Tween 80和0.5％span 85(任选含有不同量的MTP(见下文，尽管不是必需的))，使用微流化器例如Model 110Y微流化器(Microfluidics，Newton，Mass.)将其配制成亚微米颗粒，

(b)SAF，含有10％角鲨烯、0.4％Tween 80、5％普卢尼克嵌段聚合物L121(pluronic-blocked polymer L121)和thr-MDP(见下文)，将其微流化成亚微米乳剂或将其涡旋振荡以产生更大粒径的乳剂，和

(c)Ribi

(d)角鲨烷基佐剂，其包含但不限于以下组成：角鲨烷3.9％，w/v，三油酸山梨坦(0.47％，w/v)和聚氧乙烯(80)去水山梨糖醇单油酸酯(0.47％，w/v)，分散于柠檬酸盐缓冲剂中；

(3)油包水乳剂制剂，例如ISA-51或角鲨烯基油包水佐剂(例如ISA-720)；适用于油包水乳剂的油佐剂可包括矿物油和/或可代谢油。矿物油可以选自

(4)可以使用皂苷佐剂，例如Quil A或STIMULON

(5)细菌脂多糖，合成的脂质A类似物，例如氨基烷基葡糖胺磷酸酯化合物(AGP)，或其衍生物或类似物，其可获得自Corixa，并且其描述在美国专利号6,113,918中；一种这样的AGP是2-[(R)-3-十四碳酰氧基十四烷酰氨基]乙基2-脱氧-4-O-膦酰基-3-Oi[(R)-3十四碳酰氧基十四烷酰氨基)-2-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷酰氨基]-b-D-吡喃葡萄糖苷(2-[(R)-3-Tetradecanoyloxytetradecanoylamino]ethyl 2-Deoxy-4-O-phosphono-3-Oi[(R)-3tetradecanoyloxytetradecanoyl]-2-[(R)-3–tetradecanoyloxytetradecanoylamino]-b-Dglucopyranoside)，其也称为529(以前称为RC529)，它被配制为水性形式或稳定的乳剂，合成多核苷酸例如含有CpG基序的寡核苷酸(美国专利号6,207,646)；

(6)细胞因子，例如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18等)、干扰素(例如，γ干扰素)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、共刺激分子B7-1和B7-2等；

(7)细菌ADP-核糖基化毒素的去毒突变体，例如野生型或突变形式的霍乱毒素(CT)，例如根据公开的国际专利申请号WO 00/18434(也参见WO 02/098368和WO 02/098369)，其中氨基酸位置29处的谷氨酸被另一种氨基酸(优选组氨酸)替代，百日咳毒素(PT)或大肠杆菌不耐热毒素(LT)，尤其是LT-K63、LT-R72、CT-S109、PT-K9/G129(例如参见WO 93/13302和WO92/19265)；和

(8)充当免疫刺激剂以增强组合物有效性的其他物质。胞壁肽包括但不限于N-乙酰基胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(N-acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamine，thr-MDP)、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酸-2-(1'-2'二棕榈酰基-sn-丙三基-3羟基磷酰基氧)-乙胺(N-acetylnormuramyl-L-alanine-2-(1'-2'dipalmitoyl-sn-glycero-3hydroxyphosph oryloxy)-ethylamine，MTP-PE)等。

所使用的佐剂可部分取决于受体生物体。此外，佐剂的施用量将取决于动物的类型和大小。

在一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物、药物或疫苗组合物是(或包含)进一步包含一种或多种表面活性剂，以及任选至少一种如上所述的佐剂的乳剂。在一个实施方案中，乳剂是油包水乳剂或水包油乳剂。

可用于本发明的表面活性剂的示例是本领域公知的，且包括但不限于mannidemonoleate，例如由Arlacel(SEPPIC，法国)销售的

在一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物、药物、疫苗组合物包含治疗有效量的至少一种本发明的免疫原性产品。

在一个实施方案中并且出于存储目的，将本发明的免疫原性产品或组合物、药物组合物、药物、疫苗组合物或乳剂冻干。

在一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物、药物、疫苗组合物或乳剂因此可以冷冻干燥(冻干)形式存在。根据该实施方案，将本发明的免疫原性产品与一种或多种冻干助剂组合。各种冻干助剂是本领域技术人员公知的，且包括但不限于糖，例如乳糖和甘露醇。

在一个实施方案中，可以将本发明的组合物、药物组合物、药物、疫苗组合物或乳剂与稳定剂混合，例如以保护易于降解的蛋白不被降解，以延长免疫原性产品的保质期，或以提高冷冻干燥效率。有用的稳定剂包括但不限于SPGA、碳水化合物(例如山梨糖醇、甘露醇、海藻糖、淀粉、蔗糖、葡聚糖或葡萄糖)、蛋白(例如白蛋白或酪蛋白或其降解产物)、氨基酸混合物例如赖氨酸或甘氨酸，以及缓冲剂例如碱金属磷酸盐。

在一个实施方案中，可以通过注射、局部(例如通过经皮递送)、经直肠、经鼻腔或经阴道施用本发明的免疫原性产品、组合物、药物组合物、疫苗组合物或乳剂。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性产品、组合物、药物组合物、药物、疫苗组合物或乳剂是适于注射的形式。因此，在一个实施方案中，将通过肌肉内、腹膜内或皮下注射将本发明的免疫原性产品、组合物、药物组合物、药物或疫苗组合物注射给受试者。

适用于可注射用途的形式的示例包括但不限于无菌溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。可以通过在组合物中添加防腐剂例如各种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来防止微生物污染。在一个实施方案中，引入等渗剂例如糖或氯化钠以减少注射期间的疼痛可以是优选的。在一个实施方案中，可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射组合物的延长吸收。

在一个实施方案中，将本发明的冻干疫苗组合物溶解于注射用水并轻柔混合；然后添加如上文所述的免疫佐剂；将混合物轻柔混合并装入合适的注射器中。因此，本发明还涉及医疗装置，包括填充有或预填充有本发明的疫苗组合物的注射器。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性产品、组合物、药物组合物、药物或疫苗组合物是适于局部施用的形式。适于局部施用的形式的示例包括但不限于聚合物贴剂或控释贴剂等。

在另一个实施方案中，本发明的免疫原性产品、组合物、药物组合物、药物、疫苗组合物或乳剂是适于直肠施用的形式。适于直肠施用的形式的示例包括但不限于栓剂、微灌肠剂、灌肠剂、凝胶、直肠泡沫、乳膏、软膏等。

本发明还涉及为填充有或预填充有本发明的组合物、药物组合物、药物或疫苗组合物的注射器的医疗装置。

在一个实施方案中，所述注射器是双室注射器，其中一个室包含具有本发明的免疫原性产品的溶液，并且另一个室包含佐剂。

本发明还涉及包含预填充有本发明的免疫原性产品或本发明的组合物、药物组合物、药物或疫苗组合物的小瓶的医疗装置。

本发明进一步涉及本发明的免疫原性产品、组合物、药物组合物、药物或疫苗组合物，其用于治疗受试者中的炎性病症。

因此，本发明还涉及一种治疗受试者中炎性病症的方法，包括向受试者施用本发明的免疫原性产品、组合物、药物组合物、药物、疫苗组合物或乳剂。

本发明进一步涉及一种在受试者中诱导抗IL-4、IL-13或两者的免疫应答的方法，包括向受试者施用本发明的免疫原性产品、组合物、药物组合物、药物或疫苗组合物。

本发明进一步涉及一种在受试者中诱导生产抑制IL-4、IL-13或二者的生物学活性或中和IL-4、IL-13或二者的生物学活性的抗体的方法，包括向受试者施用本发明的免疫原性产品、组合物、药物组合物、药物或疫苗组合物。在一个实施方案中，抗体是多克隆抗体。

在一个实施方案中，受试者患有，优选被诊断有炎性病症，尤其是与异常的IL-4和/或IL-13表达或活性相关的病症。

在一个实施方案中，受试者是人。优选地，根据该实施方案，本发明的免疫原性产品中包含的该至少一种细胞因子是人的。

在一个实施方案中，受试者是非人哺乳动物(例如宠物)。优选地，根据该实施方案，本发明的免疫原性产品中包含的该至少一种细胞因子源自所述非人哺乳动物。

在一个实施方案中，炎性病症是与异常的IL-4和/或IL-13表达或活性相关的病症。

炎性病症的示例包括但不限于哮喘(变应性或非变应性的)、变应性病况(例如食物过敏反应、毒液过敏反应、对猫的过敏反应、药物过敏反应、高IgE综合征、变应性鼻炎、变应性结膜炎和变应性肠胃炎)、特应性病症(如特应性皮炎、荨麻疹(包括慢性特发性荨麻疹和慢性自发性荨麻疹)、湿疹)、大疱性天疱疮、呼吸系统病症(例如变应性和非变应性哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD))、鼻息肉病和其他涉及气道炎症的病况(例如嗜酸性粒细胞增多、纤维化和过多的粘液产生，包括囊性纤维化和肺纤维化、系统性硬化病(SSc))；炎性和/或自身免疫病症或病况、胃肠道病症或病况(例如炎性肠疾病(IBD)和嗜酸性食管炎(eosinophilic esophagitis，EE)以及嗜酸性介导的胃肠道疾病(eosinophilic-mediatedgastrointestinal disease)、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病和系统性红斑狼疮)；系统性红斑狼疮、肝病症或病况(例如肝硬化和肝细胞癌)、硬皮病；纤维化疾病或病症(例如肝纤维化(例如由乙型和/或丙型肝炎病毒引起的纤维化))、硬皮病；实体瘤或癌症，例如白血病(例如B细胞慢性淋巴细胞性白血病)、胶质母细胞瘤、淋巴瘤(例如霍奇金淋巴瘤)和肥大细胞增多症。

在一个实施方案中，炎性病症选自包含以下的组：哮喘(例如变应性哮喘)、特应性皮炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺纤维化、食物过敏反应，鼻息肉病和嗜酸性食管炎。

在一个实施方案中，炎性病症选自包含以下的组：哮喘(例如变应性哮喘)、特应性皮炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺纤维化和食物过敏反应。

在一个实施方案中，炎性病症是过敏反应、哮喘或特应性皮炎。

在一个实施方案中，炎性病症是变应性哮喘。

在一个实施方案中，炎性病症是实体瘤。在一个实施方案中，本发明的方法用于预防实体瘤转移。

本发明进一步涉及一种诱导对特定抗原变态反应的受试者脱敏的方法，其中所述方法包括向受试者施用本发明的免疫原性产品、组合物、药物组合物、药物或疫苗组合物和所述变应原。

如本文所用，术语“脱敏”，也称为变应原免疫疗法、脱敏或低敏化(hypo-sensitization)或过敏反应疫苗接种，是指针对环境性过敏反应例如变应性哮喘的药物治疗。这种治疗涉及使人们暴露于越来越大量的变应原，以试图在变应原存在下减少免疫系统的应答。

变应原的示例包括但不限于吸入性变应原、摄入性变应原和接触性变应原。

吸入性变应原的示例包括但不限于来自无气门亚目(Astigmata)的变应原(例如粗足粉螨(Acarus siro)(贮藏螨(Storage mite)，Aca s 13)、热带无爪螨(Blomiatropicalis)(螨虫，Blo t)、美洲尘螨(Dermatophagoides farinae)(美国房尘螨(american house dust mite)，Der f)、微角尘螨(Dermatophagoides microceras)(房尘螨(house dust mite)，Der m)、屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)(欧洲房尘螨(European house dust mite)，Der p)、梅氏嗜霉螨(Euroglyphus maynei)(房尘螨，Eurm)、家食甜螨(Glycyphagus domesticus)(贮藏螨，Gly d 2)、害鳞嗜螨(Lepidoglyphusdestructor)(贮藏螨，Lep d)、腐食酪螨(Tyrophagus putrescentiae)(贮藏螨，Tyr p))；蜚蠊目(例如德国小蠊(Blattella germanica)(德国蜚蠊(German cockroach)，Bla g)、美洲大蠊(Periplaneta americana)(美洲蜚蠊(American cockroach)，Per a))；鞘翅目(例如异色瓢虫(Harmonia axyridis)(亚洲瓢虫，Har a))、双翅目(例如，埃及伊蚊(Aedesaegypti)(黄热蚊(Yellow fever mosquito)，Aed a)、花翅摇蚊(Chironomus kiiensis)(摇蚊(Midge)，Chi k)、Chironomus thummi thummi(摇蚊(Midge)，Chi t)、台湾蛱蠓(Formcipomyia taiwana)(蠓(Biting midge)，For t)、刺舌蝇(Glossina morsitans)(萨凡纳采采蝇(Savannah Tsetse fly)，Glo m)、半翅目(Hemidiptera)：长锥蝽(Triatomaprotracta)(加州接吻虫(California kissing bug)，Tria p))、膜翅目(例如中华蜜蜂(Apis cerana)(东方蜂(Eastern hive bee)，Api c)、大蜜蜂(Apis dorsata)(巨型蜜蜂(Giant honeybee)，Api d)、西方蜂(Apis mellifera)(蜜蜂，Api m)、Bombuspennsylvanicus(熊蜂(Bumble bee)，Bom p)、欧洲熊蜂(Bombus terrestris)(熊蜂，Bomt)、长黄胡蜂(Dolichovespula arenaria)(大黄蜂(Yellow hornet)，Dol a)、白脸长黄胡蜂(Dolichovespula maculata)(白脸大黄蜂(White face hornet)，Dol m)、杰克跳蚁(Myrmecia pilosula)(澳大利亚跳蚁(Australian jumper ant)，Myr p)、胡蜂(Polistesannularis)(黄蜂(Wasp)，Pol a)、造纸胡蜂(polistes dominulus)(地中海纸黄蜂(Mediterranean paper wasp)，Pol d)、鸣黄蜂(Polistes exclamans)(黄蜂，Pol e)、北方纸巢蜂(Polistes fuscatus)(黄蜂，Pol f)、柞蚕马蜂(Polistes gallicus)(黄蜂，Polg)、长足胡蜂(Polistes metricus)(黄蜂，Pol m)、Polybia paulista(黄蜂，Pol p)、Polybia scutellaris(黄蜂，Pol s)、热带火蚁(Solenopsis geminata)(热带火蚁(Tropical fire ant)，Sol g)、红火蚁(Solenopsis invicta)(入侵红火蚁(Red importedfire ant)，Sol i)、里氏火蚁(Solenopsis richteri)(黑火蚁(Black fire ant)，Sol r)、残暴火蚁(Solenopsis saevissima)(巴西火蚁(Brazilian fire ant)，Sol s)、黄边胡蜂(Vespa crabro)(欧洲大黄蜂(European hornet)，Vesp c)、大虎头蜂(Vespa mandarinia)(亚洲巨大黄蜂(Giant asian hornet)，Vesp m)、Vespula fiavopilosa(黄夹克(Yellowjacket)，Vesp f)、德国黄胡蜂(Vespula germanica)(黄夹克，Vesp g)、额斑黄胡蜂(Vespula maculifrons)(黄夹克，Vesp m)、西部黄胡蜂(Vespula pensylvanica)(黄夹克，Vesp p)、南方黄胡蜂(Vespula squamosa)(黄夹克，Vesp s)、黄胡蜂(Vespula vidua)(黄蜂，Vesp vi)、大胡蜂(Vespula vulgaris)(黄夹克，Vesp v))、真蜱目(Ixodida)(例如，卷边锐缘蜱(Argas reflexus)(鸽蜱(Pigeon tick)，Arg r))，鳞翅目(Lepidoptera)(例如家蚕(Bombbyx niori)(蚕蛾(Silk moth)，Bomb n)、印度谷斑螟(Plodia interpunctella)(印度谷螟(Indianmeal moth)，Plo i)、松异舟蛾(Thaumetopoea pityocampa)(松异舟蛾(Pine processionary moth)，Tha p))、缨尾目(Thysanura)(例如蠹鱼(Lepismasaccharina)(银鱼((Silverfish)，Lep s))、蚤目(Siphonaptera)(例如猫栉首蚤(Ctenocephalides felis felis)(猫蚤(Cat flea)，Cte f))、食肉目(Carnivora)(例如家犬(Canis familiaris)(狗，Can f)、家猫(Felis domesticus)(猫，Fel d))；兔形目(例如欧洲兔(Oryctolagus cuniculus)(兔，Ory c)、Perissodactlyla：马(Equus caballus)(家养马，Equ c))、鲽形目(Pleuronectiformes)(例如帆鳞鲆(Lepidorhombus whiffiagonis)(帆鳞鲆(Megrim)，Whiff，Gallo，Lep w))、啮齿目(例如豚鼠(Cavia porcellus)(豚鼠，Cavp)、小家鼠(Mus musculus)(小鼠，Mus m)、褐家鼠(Rattus norvegius)(大鼠，Rat n))；松柏目(Coniferales)：台湾扁柏(Chamaecyparis obtusa)(日本扁柏(Japanese cypress)，Cha o)、绿干柏(Cupressus arizonica)(柏，Cup a)、日本柳杉(Cryptomeria japonica)(日本柳杉(Sugi)，Cry j)、地中海柏木(Cupressus sempervirens)(普通柏(Commoncypress)，Cup s)、Juniperus ashei(雪松(Mountain cedar)，Jun a)、刺柏(Juniperoxycedrus)(刺桧(Prickly juniper)，Jun o)、Juniperus sabinoides(雪松，Jun s)、北美圆柏(Juniperus virginiana)(东部红柏(Eastern red cedar)，Jun v))；龙胆目(Gentianales)(例如长春花(Catharanthus roseus)(紫长春花属(Rosy periwinkle)，Catr))；禾本目(Poales)(例如黄花茅(Anthoxanthum odoratum)(甜春草(Sweet vernalgrass)，Ant o 1)、狗牙根(Cynodon dactylon)(百慕大草(Bermuda grass)，Cyn d 1，Cynd 7，Cyn d 12，Cyn d 15，Cyn d 22w，Cyn d 23，Cyn d 24)、果园草(Dactylis glomerata)(果园草(Orchard grass)，Dae g 1，Dae g 2，Dae g 3，Dae g 4，Dae g 5)、草甸羊茅(Festuca pratensis)(牛尾草(Meadow fescue)，Fes p 4))、绒毛草(Holcus lanatus)(天鹅绒草(Velvet grass)，Hol l 1，Hol l 5)、大麦(Hordeum vulgare)(大麦(Barley)，Horv 1，Hor v 5，Hor v 12，Hor v 15，Hor v 16，Hor v 17，Hor v 21)、黑麦草(Loliumperenne)(黑麦(Rye grass)，Lol p 1，Lol p 2，Lol p 3，Lol p 4，Lol p 5，Lol p 11)、水稻(Oryza sativa)(稻，Ory s 1，Ory s 12)、百喜草(Paspalum notarum)(巴哈雀稗(Bahiagrass)，Pas n 1)、球茎草芦(Phalaris aquatica)(金黄草(Canary grass)，Pha a 1，Phaa 5)、猫尾草(Phleum pratense)(梯牧草(Timothy)，Phl p 1，Phl p 2，Phl p 4，Phl p 5，Phl p 6，Phl p 7，Phl p 11，Phl p 12，Phl p 13)、草地早熟禾(Poa pratensis)(肯塔基六月禾(Kentucky blue grass)，Poa p 1，Poa p 5)、黑麦属(Secale cereale)(黑麦(Rye)，Sec c 1，Sec c 20)、石茅(Sorghum halepense)(约翰逊草(Johnson grass)，Sor h1)、普通小麦(Triticum aestivum)(小麦，Tri a 12，Tri a 14，Tri a 185，Tri a 19，Tria 25，Tri a 26，Tri a 27，Tri a 28，Tri a 29，Tri a 30)、玉米(Zea mays)(玉米(Maize)，Zea m 1，Zea m 12，Zea m 14，Zea m 25)、壳斗目(Fagales)：普通赤杨(Alnusglutinosa)(赤杨(Alder)，Aln g 1，Aln g 4)、疣皮桦(Betula verrucosa)(桦树(Birch)，Bet v 1，Bet v 2，Bet v 3，Bet v 4，Bet v 5，Bet v 6，Bet v 7)、Carpinus betuhxs(角树(Hornbeam)，Car b 1)；唇形目(Lamiales)(例如欧洲白蜡树(Fraxinus excelsior)(白蜡树(Ash)，Fra e l)、普通女贞(Livetrum vulgare)(女贞(Privet)，Lig v)、紫丁香(Syringa vulgaris)(丁香花(Lilac)，Syr v))；金虎尾目(Malpighiales)(例如巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)(帕拉胶树(para rubber tree)(乳胶)，Hev b 1，Hev b 2，Hev b3，Hev b 4，Hev b 5，Hev b 6，Hev b 7，Hev b 8，Hev b 9，Hev b 10，Hev b 11，Hev b 12，Hev b 13))；山龙眼目(Proteales)(例如二球悬铃木(Platanus acerifolia)(英国梧桐(London plane tree)，Pla a 1，Pla a 2，Pla a 3)、三球悬铃木(Platanus orientalis)(法国梧桐(Oriental plane)，Pla or 1，Pla or 2，Pla or 3))。

在一个实施方案中，吸入性变应原选自包含以下或由其组成的组：粗足粉螨(贮藏螨，Aca s 13)、美洲尘螨(美国房尘螨，Der f)、微角尘螨(房尘螨，Der m)、屋尘螨(欧洲房尘螨，Der p)、梅氏嗜霉螨(房尘螨，Eur m)、家食甜螨(贮藏螨，Gly d 2)、胡蜂(黄蜂，Pola)、造纸胡蜂(地中海纸黄蜂，Pol d)、鸣黄蜂(黄蜂，Pol e)、北方纸巢蜂(黄蜂，Pol f)、柞蚕马蜂(黄蜂，Pol g)、长足胡蜂(黄蜂，Pol m)、Polybia paulista(黄蜂，Pol p)、Polybiascutellaris(黄蜂，Pol s)、家猫(猫，Fel d)、禾本目和疣皮桦(桦树，Bet v 1，Bet v 2，Bet v 3，Bet v 4，Bet v 5，Bet v 6，Bet v 7)。

摄入性变应原的示例包括但不限于来自真菌子囊菌的变应原，例如座囊菌目(Dothideales)(例如互隔交链孢霉(Alternaria alternata)(链格孢腐菌(Alternariarot fungus)，Alt a)、支孢样支孢霉(Cladosporium cladosporioides)(Cla c)、草本支孢霉(Cladosporium herbarum)(Cla h)、月牙弯孢菌(Curvularia lunata)(Cur l)、-散囊菌目(Eurotiales)：黄曲霉菌(Aspergillus flavus)(Asp fl)、烟曲霉菌(Aspergillusfumigatus)(Asp f)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)(Asp n)、米曲霉菌(Aspergillusoryzae)(Asp o)、短密青霉菌(Penicillium brevicompactum)(Pen b)、产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)(Pen ch)、桔青霉菌(Penicillium citrinum)(Pen c)、草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)(Pen o))、肉座菌目(Hypocreales)(例如大刀镰刀菌(Fusarium culmorum)(Fus c))；甲爪团囊属(Onygenales)(例如红色毛癣菌(Trirphytonrubrum)(Tri r)、断发毛癣菌(Trichophyton tonsurans)(Tri t)、酵母目(Saccharomycetales)：白色念珠菌(Candida albicans)(酵母，Cand a)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)(酵母，Cand b))；瘤座孢目(Tuberculariales)(例如黑附球菌(Epicoccum purpurascens)(Epi p))，来自真菌担子菌(Fungi Basidiomycota)的变应原，例如层菌纲(Hymenomycetes)(例如毛头鬼伞(Coprinus comatus)(毛头鬼伞(Shaggymane)，Cop c)、古巴光盖伞(Psilocybe cubensis)(神奇蘑菇(Magic mushroom)，Psi c)、锈菌纲(Urediniomycetes)(例如胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)(酵母，Rho m))；黑粉菌纲(Ustilaginomycetes)(例如糠秕马拉色菌(Malassezia furfur)(花斑糠疹感染(Pastriasis versicolor infect.Agent，Mala f)，合轴马拉色菌(Malasseziasympodialis)(Mala s))；抗生素(例如青霉素、头孢菌素、氨基苷(Aminoside)、喹诺酮类、大环内酯类、四环素、磺胺类(Sulfamid))；药物(例如乙酰水杨酸、疫苗、吗啡及衍生物)；维生素，例如维生素K1；以及食物变应原(例如来自奶、蛋、花生、树坚果(核桃、腰果等)、鱼、贝类、大豆、小麦和胡萝卜、苹果、梨、鳄梨、杏、桃中的变应原)。

在一个实施方案中，摄入性变应原是食物变应原。

在一个实施方案中，食物变应原选自包含以下或由其组成的组：来自奶、蛋、花生、树坚果(核桃、腰果等)、鱼、贝类、大豆、小麦和胡萝卜、苹果、梨、鳄梨、杏、桃的变应原。

接触性变应原的示例包括但不限于重金属(例如镍、铬、金)、乳胶、半抗原如氟烷、肼苯哒嗪。

在一个实施方案中，变应原选自包含以下或由其组成的组：粗足粉螨(贮藏螨，Acas 13)、美洲尘螨(美国房尘螨，Der f)、微角尘螨(房尘螨，Der m)、屋尘螨(欧洲房尘螨，Derp)、梅氏嗜霉螨(房尘螨，Eur m)、家食甜螨(贮藏螨，Gly d 2)、胡蜂(黄蜂，Pol a)、造纸胡蜂(地中海纸黄蜂，Pol d)、鸣黄蜂(黄蜂，Pol e)、北方纸巢蜂(黄蜂，Pol f)、柞蚕马蜂(黄蜂，Pol g)、长足胡蜂(黄蜂，Pol m)、Polybia paulista(黄蜂，Pol p)、Polybiascutellaris(黄蜂，Pol s)、家猫(猫，Fel d)、禾本目和疣皮桦(桦树，Bet v 1，Bet v 2，Bet v 3，Bet v 4，Bet v 5，Bet v 6，Bet v 7)和食物变应原。

本发明还进一步涉及用于增加对特定变应原变态反应的受试者的脱敏的功效和/或减少其持续时间的方法，其中通过脱敏治疗所述受试者，并进一步施用本发明的免疫原性产品、组合物、药物组合物、药物或疫苗组合物。

在一个实施方案中，在本发明的方法中，首先向受试者施用本发明的免疫原性产品、组合物、药物组合物、药物或疫苗组合物，并且然后施用变应原。

在一个实施方案中，在本发明的方法中，首先给受试者施用变应原，并且然后施用本发明的免疫原性产品、组合物、药物组合物、药物或疫苗组合物。

在另一个实施方案中，在本发明的方法中，受试者接受本发明的免疫原性产品、组合物、药物组合物、药物或疫苗组合物和变应原的组合施用。

本发明进一步涉及如上文所述的组合物、药物组合物、药物或疫苗，其中所述组合物、药物组合物、药物或疫苗进一步包含至少一种变应原。

在一个实施方案中，向或将要向受试者施用治疗有效量的至少一种本发明的免疫原性产品。在一个实施方案中，治疗有效量对应于使用本领域公知的Bradford蛋白测定法所确定的总蛋白量。

在一个实施方案中，将要向受试者施用的免疫原性产品的量诱导免疫保护应答而无显著不良作用。

在一个实施方案中，将要向受试者施用的免疫原性产品的量诱导变应原脱敏而无显著不良作用。

可以通过标准研究来确定本发明的免疫原性产品的最佳成分量，包括观察受试者中适当的免疫应答。初次接种疫苗后，受试者可接受适当间隔的一次或多次加强免疫。

在一个实施方案中，治疗由一段时间内的单个剂量或多个剂量组成。

在本发明的一个实施方案中，一个月内向待治疗的受试者施用至少两次治疗有效量的如上所述的免疫原性产品。

在本发明的另一个实施方案中，一个月内向待治疗的受试者施用两次治疗有效量的本发明的免疫原性产品。在这个实施方案中，可以在第0天向受试者施用一次，并在第7天至第28天之间施用第二次。在一个实施方案中，在第0天向受试者施用一次，并在第28天施用第二次。

在本发明的另一个实施方案中，一个月内向待治疗的受试者施用三次治疗有效量的本发明的免疫原性产品。在这个实施方案中，可以在第0天向待治疗的受试者施用一次，并在第7天至第14天之间施用第二次，并在第21天至第28天之间施用第三次。在一个实施方案中，在第0天向受试者施用一次，并在第7天施用第二次，并在第28天施用第三次。

在本发明的另一个实施方案中，可进一步每三个月向待治疗的受试者施用一次治疗有效量的本发明的免疫原性产品。

在本发明的一个实施方案中，如上所述，在一个月内向待治疗的受试者施用三次，并且然后进一步每三个月施用一次治疗有效量的本发明的免疫原性产品。

在本发明的另一个实施方案中，当获得自受试者的血清样品中检测不到抗IL-4的抗体量时，可进一步向受试者施用治疗有效量的如上所述的免疫原性产品。

在本发明的另一个实施方案中，当获得自受试者的血清样品中检测不到抗IL-13的抗体量时，可进一步向受试者施用治疗有效量的如上所述的免疫原性产品。

在本发明的另一个实施方案中，当获得自受试者的血清样品中检测不到抗IL-4和IL-13的抗体的量时，可进一步向受试者施用治疗有效量的如上所述的免疫原性产品。

附图简要说明

图1是通过添加硫醇-马来酰亚胺将sGMBS修饰的IL-4或IL-13和标记有SATA的载体蛋白进行化学偶联以用于制备本发明的免疫原性产品的方案。

图2是显示muIL-4和muIL-13免疫原性产品的抗原性的组图。用抗CRM

图3是Balb/c小鼠中免疫的研究方案。将均乳化于角鲨烯佐剂中的免疫原性产品(具有充当载体蛋白的CRM

图4是显示小鼠血清中的抗muIL-4(A)、抗muIL-13(B)、抗CRM

图5是显示小鼠血清中的muIL-4中和能力的图。每组十只小鼠用于免疫原性产品组中，且五只小鼠用于对照组中。条形代表中位数。

图6是显示小鼠血清中的muIL-13中和能力的图。每组十只小鼠用于免疫原性产品组中，且五只小鼠用于对照组中。条形代表中位数。

图7是Balb/c小鼠中免疫和哮喘致敏的研究方案。

图8是显示小鼠血清中的抗muIL-4(A)和抗muIL-13(B)抗体滴度的组图。每组十二只小鼠。条形代表中位数。

图9是显示小鼠血清中的muIL-4(A)和muIL-13(B)中和能力的组图。每组十二只小鼠。条形代表中位数。

图10是显示对吸入的乙酰甲胆碱的气道高反应性的图。通过非侵入性全身体积描记法来测量增强的呼吸间歇(Enhanced pause(Penh))值。每个HDM致敏的/攻毒的小鼠组使用7-8只小鼠，且PBS对照为n＝16，来获得数据。*或**或***：相对于CRM197-HDM组，P<0.5或0.1或0.001，使用未配对的Mann-Whitney U检验。

图11是显示在疫苗接种前(A)和最后一次用HDM或PBS攻毒后24小时(B)收集的血清中的循环IgE水平的组图。每个HDM致敏的/攻毒的小鼠组使用7-8只小鼠，且PBS对照为n＝16，来获得数据。***：相对于CRM

图12是显示最后一次用HDM攻毒后24小时收集的BAL中的CD45+细胞(A)和嗜酸性粒细胞(B)水平的组图。每个HDM致敏的/攻毒的小鼠组使用7-8只小鼠，且PBS对照为n＝16，来获得数据。*或**或***：相对于CRM

图13是显示IL-4免疫原性产品(A)、IL-13免疫原性产品(B)和组合的免疫原性产品(A和B)的抗原性的组图。使用抗CRM

图14是Balb/c小鼠中免疫的研究方案。

图15是显示小鼠血清中的抗IL-4(A)和抗IL-13(B)抗体滴度的组图。每组十只小鼠。条形代表中位数。

图16是显示小鼠血清中的抗IL-4(A)和抗IL-13(B)中和能力的组图。每组十只小鼠。条形代表中位数。

实施例

通过以下实施例进一步说明本发明。

本发明涉及使用CRM

CRM

使用以下开发的制备过程生产本发明的免疫原性产品。

采用硫醇-马来酰亚胺偶联来制备IL-4和IL-13免疫原性产品。将巯基部分引入具有SATA的载体蛋白CRM

a)载体蛋白功能化

将CRM

随后，将羟胺以500mM稀释在相同的缓冲液中。然后，将CRM

b)muIL-4和muIL-13功能化

将muIL-4或muIL-13溶解在修饰缓冲液(70mM磷酸钠缓冲液、150mM NaCl、5mMEDTA，pH 7.2)中。将sGMBS以10mM稀释在修饰缓冲液中。然后，将sGMBS添加到muIL-4或muIL-13中，并在室温下在摇床上温育1小时后，使用Zeba

c)偶联

在CRM

将功能化的CRM197或功能化的KLH分别以1:2(载体:muIL-4或载体:muIL-13)和1:20的摩尔比加入功能化的muIL-4或功能化的muIL-13中。基于KLH和CRM

将单独的免疫原性产品制备物在4℃下在摇床上温育过夜。然后使用Amicon(3kDa截留膜)将所得的免疫原性产品浓缩，以0.22μm过滤，并保存在4℃下。

d)对照(未偶联的细胞因子和CRM

作为对照，制备了两种无蛋白功能化的混合物(称为未偶联的细胞因子和CRM

-以1:2的摩尔比(CRM

-以1:2的摩尔比(CRM

两种混合物均以0.22μm过滤，并保存在4℃下。

e)免疫原性产品的定量

根据制造商的说明通过Coomassie Plus(Bradford)蛋白测定法来确定muIL-4免疫原性产品和muIL-13免疫原性产品的浓度。

进行夹心ELISA以评估细胞因子与载体蛋白的偶联，并且还评估在制备过程中是否保留了表位。

简而言之，将捕获抗体(抗载体蛋白抗体)包被在96孔板上。在使用含2％(w/v)酪蛋白的PBS进行封闭步骤后，添加免疫原性产品样品并进行2倍连续稀释。在37℃下温育90分钟后，使用生物素化的抗muIL-4抗体(多克隆山羊IgG抗muIL-4)或生物素化的抗muIL-13抗体(多克隆山羊IgG抗muIL-13)检测结合的免疫原性产品，并然后用抗生蛋白链菌素-HRP和OPD底物进行显示。使用硫酸终止酶促反应，并在490nm处读取光密度(OD)。结果如图2所示。

该试验证实了本发明的免疫原性产品包含与CRM

将免疫原性产品作为乳剂与角鲨烯基佐剂一起施用给小鼠。用PBS将免疫原性产品稀释至所需浓度，并将稀释液与等体积的佐剂混合。

小鼠免疫方案

每只Balb/c小鼠接受均用角鲨烯基佐剂乳化(1:1)的免疫原性产品(具有CRM

表1：施用剂量时间表

在给药前以及第39、60和120天进行血液采集。在室温下凝血并离心以去除血块后，制备血清样品。在第120天通过致死性麻醉处死小鼠。

通过ELISA确定抗细胞因子和抗载体蛋白抗体的滴度

通过ELISA评估免疫小鼠的血清样品中抗细胞因子抗体和抗载体蛋白抗体的存在。

简而言之，将muIL-4、muIL-13、CRM

用于抗muIL-4抗体、抗muIL-13抗体、抗KLH抗体和抗CRM

从500dil

抗muIL-4、抗muIL-13、抗CRM

结果显示在图4中。在所有用免疫原性产品处理以及对于注射了佐剂化的DPBS或载体蛋白或未偶联的制备物的小鼠的组中，在给药前未检测到抗muIL-4、抗muIL-13、抗KLH和抗CRM

在第39、60和120天，在所有用CRM

muIL-4中和生物测定

在使用改编自Soman等人，2009的CTLL-2细胞的增殖测定中进一步评估由施用muIL-4免疫原性产品诱导的抗体的抗muIL-4中和能力。简而言之，使CTLL-2细胞在补充有2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、1mM HEPES、100单位/mL青霉素、100μg/ml链霉素和10％(v/v)FBS的RPMI中的终浓度为10ng/mL的IL-2的存在下生长。对于中和生物测定，用muIL-4替代IL-2。因此，在注射免疫原性产品后诱导的可能的中和性muIL-4抗体将阻止CTLL-2生长。

以1/200的终浓度添加血清样品，并以1μg/mL的终浓度添加阳性对照多克隆抗muIL-4抗体，并2倍连续稀释于培养板中的每孔25μL RPMI+10％(v/v)FBS中。然后将muIL-4以2ng/mL的终浓度添加到血清样品中，并在室温下温育1小时。然后将20,000个CTLL-2细胞添加到预温育的样品(血清或阳性对照加muIL-4)中。将平板在37℃、5％CO

NC

在给药前，没有小鼠表现出抗muIL-4中和抗体(图5和表2)。在对照组中，在任何时间点均未检测到具有中和能力的抗muIL-4抗体。对于用由CRM

表2：针对IL-4的NC

muIL-13中和生物测定

在给药前以及第39、60和120天，通过muIL-13中和生物测定法评估通过施用muIL-13免疫原性产品诱导的抗体的中和能力。

使用HEK-Blue

简而言之，将HEK-Blue

NC

在任何时间点，在给药前的所有组以及对照组中均未检测到muIL-13中和抗体(图6和表3)。用由CRM

表3：针对IL-13的NC

如预期的，在任何时间点在CRM

muIL-4免疫原性产品的残余活性

如下所述(改编自Soman等人，2009)，评估了muIL-4免疫原性产品的残余活性。

简而言之，使CTLL-2细胞在IL-2下生长。培养基由补充有终浓度为10ng/mL的IL-2和10％(v/v)FBS的RPMIc培养基组成。

对于残余活性生物测定，用muIL-4替代IL-2。将本发明的免疫原性产品(含有CRM

有效剂量50(ED

通过将所测免疫原性产品的ED

表4：ED

如表4所示，muIL-4残余活性在用CRM

muIL-13免疫原性产品的残余活性

如下所述使用HEK-Blue

简而言之，将muIL-13免疫原性产品和muIL-13对照两倍连续稀释在圆底平板中的测定培养基(DMEM、10％(v/v)FBS、10mM HEPES缓冲液、50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素)中，分别以250ng/mL和10ng/mL的终浓度开始。将这些混合物添加到每孔40,000个HEK-Blue

有效剂量50(ED

通过将muIL-13免疫原性产品的ED

表5：ED

如表5所示，muIL-13残余活性在用CRM

与用KLH作为载体制备的免疫原性产品相比，当免疫原性产品由CRM

在所有过敏反应中，变应性哮喘和食物过敏反应是主要的公共卫生问题，目前分别影响全球3亿多人。过敏反应被认为是由于耐受性破坏引起的，导致以产生TH2细胞因子如IL-4和IL-13、高水平的IgE抗体以及发炎组织内免疫细胞(尤其是肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和T细胞)的浸润和扩张为特征的2型免疫应答。

房尘螨(HDM)是变应原的主要来源，其影响超过50％的变应性患者(Meyer等人，1994)。在小鼠中，用HDM鼻内反复攻毒会重现人慢性哮喘的关键特征，包括气道高反应性(AHR)、气流阻塞、气道壁重塑、粘液产生和以高水平嗜酸性粒细胞为特征的肺部炎症反应。

制备muIL-4/IL-13免疫原性产品

a)CRM

将CRM

随后，将羟胺以500mM稀释在相同缓冲液中。然后，将CRM

b)muIL-4和muIL-13的功能化

将muIL-4溶解在修饰缓冲液(70mM磷酸钠缓冲液，150mM NaCl，5mM EDTA，pH 7.2)中。将sGMBS以10mM稀释在修饰缓冲液中。然后，将sGMBS添加到muIL-4中，并在室温下在摇床上温育1小时后，使用Zeba

将muIL-13溶解在修饰缓冲液(70mM磷酸钠缓冲液，150mM NaCl，5mM EDTA，pH7.2)中。将sGMBS以10mM稀释在修饰缓冲液中。然后，将sGMBS添加到muIL-13中，并在室温下在摇床上温育1小时后，使用Zeba

c)偶联

在CRM

将功能化的CRM197以1:2(载体:muIL-4)和1:4(或载体:muIL-13)的摩尔比添加到功能化的muIL-4或功能化的muIL-13中。将单独的免疫原性产品制备物在4℃下在摇床上温育过夜。然后使用Amicon(3kDa截留膜)将所得的免疫原性产品浓缩，以0.22μm过滤，并保存在4℃下。

d)免疫原性产品的定量

根据制造商的说明通过Coomassie Plus(Bradford)蛋白测定法确定muIL-4免疫原性产品和muIL-13免疫原性产品的浓度。

muCombo免疫原性产品的制备

在浓缩步骤和0.22μm无菌过滤步骤之后，以1-1重量比将独立合成的muIL-4免疫原性产品和muIL-13免疫原性产品混合在一起，并将所得的muCombo免疫原性产品保存在4℃下。

小鼠免疫，变应性哮喘规程和血液采样

每只Balb/c小鼠在第0、7、28和55天接受均用角鲨烯基佐剂乳化的仅免疫原性产品或muCombo免疫原性产品或仅CRM

表6：施用剂量时间表

在首次免疫原性产品免疫后的第39天，通过在第39、43和46天的三次来自美洲尘螨(Dermatophagoides farinae)(购自Greer)的100μg HDM的鼻内注射在小鼠中诱发慢性气道炎症。从第50天开始，使小鼠每周用两次25μg HDM的鼻内注射进行攻毒(共攻毒9次)。

在给药前7天，第39、64天和最后一次HDM攻毒后24小时(小鼠处死)进行血液采集。如前所述制备血清样品，并保存在-20℃下直至分析。

在这项研究中评估了以下：

-通过ELISA和生物测定法评估的所注射产品的免疫原性，

-通过全身体积描记法测量的气道高反应性(AHR)，

-生物标志物：通过ELISA评估的血清中的循环IgE水平，通过FACS分析和气道组织学以及炎性细胞浸润评估肺和支气管肺泡灌洗液(BAL)中的气道炎症。

a)通过ELISA和生物测定法评估的注射产品的免疫原性

通过ELISA(如上所述)从收集自四个处理组中的小鼠血清中测量抗muIL-4和抗muIL-13的抗体滴度。

在所有时间点的给药前的所有组中以及接受CRM

如上所述，使用两种不同的生物测定法在体外评估每种免疫原性产品的中和活性。值得注意的是，如果IL-4的NC

在至少一个时间点，分别在12只的n＝11或12只的n＝9中，在用muIL-4免疫原性产品和muCombo免疫原性产品免疫的小鼠中观察到高的抗muIL-4的中和能力(图9-A和表7)。

表7：针对IL-4的NC

有趣的是，在用muIL-4或muCombo免疫原性产品免疫后一年，在小鼠中仍检测到抗IL-4抗体(数据未显示)。

在至少一个时间点，分别在12只的n＝10或12只的n＝7中诱导了在用muIL-13免疫原性产品和muCombo免疫原性产品免疫的小鼠中的抗muIL-13中和能力(图9-B和表8)。

表8：针对IL-13的NC

有趣的是，用muIL-13或muCombo免疫原性产品免疫后一年，在小鼠中仍检测到抗IL-13抗体(数据未显示)。

值得注意的是，未事先化学偶联的muIL-4和/或muIL-13和CRM

免疫后产生了不同类别的抗IL-4和抗IL-13抗体(尤其包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgE和IgM)，主要是IgG1(数据未显示)。

b)通过全身体积描记法测量的气道高反应性(AHR)

最后一次攻毒后二十四小时，通过全身体积描记法评估AHR。在清醒的小鼠中测量对乙酰甲胆碱(一种支气管收缩剂)的应答。

通过气雾剂施用不同剂量的乙酰甲胆碱：0mg/mL、3.5mg/mL、7mg/mL和14mg/mL。增强的呼吸间歇(Penh)已用于评估肺功能的变化(Hamelmann等人，1997)。该量度概念化了胸腔流量和鼻腔流量曲线之间的相移：相移增加与呼吸系统阻力增加相关。通过公式Penh＝(Te/RT-1)xPEF/PIF计算Penh，其中Te是呼气时间，RT是松弛时间，PEF是峰值呼气流量，且PIF是峰值吸气流量。在每次乙酰甲胆碱攻毒后的5分钟内记录Penh值，并在图中记录期间的最大值。

在CRM

使用侵入性气道反应测量证实了这些结果。实际上，与经PBS处理的对照组相比，经HDM处理的对照组小鼠在乙酰甲胆碱攻毒后显现出肺抗性和弹性的显著提高，而在经muIL-4、muIL-13或muCombo免疫原性产品处理的小鼠中，这两个特征部分降低(数据未显示)。

总之，这些结果表明，抗IL-4和IL-13的双重疫苗接种可以阻断AHR。

c)生物标志物

通过ELISA评估的血清中的循环IgE水平

在免疫原性产品疫苗接种之前和最后一次HDM攻毒后24小时，按照制造商的说明通过ELISA(Mouse IgE ELISA Quantitation Set，Bethyl Labs E90-115)测量总循环IgE水平(图11)。

疫苗接种前未检测到循环IgE。在最后一次HDM攻毒后24小时，归因于HDM致敏而诱导了总循环IgE(图11-B)。该水平在所有接受免疫原性产品的组中降低，证明了本发明的产品相比于CRM

经HDM处理的小鼠也表现出对HDM特异的IgG抗体水平提高。但是，这些水平不受muIL-4和/或muIL-13免疫原性产品处理的影响(数据未显示)。

肺和支气管肺泡灌洗液(BAL)中的气道炎症

对由HDM或PBS致敏的小鼠的肺和支气管肺泡灌洗液(BAL)中的细胞变化进行了详细的时程分析。

根据制造商的说明，使用以下抗体(表9)通过FACS对来自BAL的炎性细胞进行分析：CD45-FITC、Ly6G-PE、CD11b-VG、SiglecF-PECy7、B220-APC和CD3-APC。

在对照小鼠的肺中，与经PBS处理的动物相比，慢性鼻内暴露于HDM导致主要由嗜酸性粒细胞(CD45+、Ly6G-、CD11b+、SiglecF+)组成的造血起源的CD45

在支气管肺泡灌洗液中，HDM致敏导致炎症反应，其特征在于主要由嗜酸性粒细胞(CD45+、Ly6G-、CD11b+、SiglecF+)组成的造血起源的CD45

有趣的是，本发明的免疫原性产品的疫苗接种对血液中的嗜酸性粒细胞水平没有影响(数据未显示)，这表明在经疫苗接种的小鼠中观察到的气道嗜酸性粒细胞减少是嗜酸性粒细胞向肺部的募集减少而不是对嗜酸性粒细胞或嗜酸性粒细胞祖细胞数量的全身性作用的结果。

气道组织学

通过组织学分析检查了致敏和疫苗接种对气道的影响。简而言之，在死后切除左肺，在室温下用4％PFA固定24h，并保存在70％乙醇中。进行纵向切片，并用以下染色：

-苏木精和曙红(H&E)，用于评估白细胞浸润，

-甲苯胺蓝，用于定量肥大细胞数量，或

-高碘酸希夫(PAS)染色，用于评估杯状细胞增生和粘液产生。

在全球范围内，这些肺组织学分析证实，与未经疫苗接种的经HDM处理的动物相比，对经HDM处理的动物进行muIL-4、muIL-13或muCombo免疫原性产品的疫苗接种显著减少白细胞和上皮内肥大细胞的数量(数据未显示)。

PAS组织学分析还证实，与未经疫苗接种的经HDM处理的动物相比，对经HDM处理的动物进行muIL-4、muIL-13或muCombo免疫原性产品的疫苗接种显著降低杯状细胞增生/粘液分泌(数据未显示)。这些结果支持了免疫原性产品(尤其是muIL-13和muCombo免疫原性产品)可以控制由HDM致敏诱导的粘液过度分泌。

总之，我们已经证明了由CRM

因此，这些结果证明，本发明的免疫原性产品能够破坏B细胞对IL-4和IL-13的耐受，并且表明这些免疫原性产品可以代表在对哮喘和/或过敏反应的治疗中有前景的新治疗策略，且尤其是在对变应性哮喘的治疗中。

有趣的是，单独的免疫原性产品是有活性的，但当将免疫原性产品组合(muCombo免疫原性产品)时观察到对哮喘和/或过敏反应症状(且尤其是对变应性哮喘症状)以及生物标志物的优异的有益作用。

按照与上述相同的制备过程，使用人细胞因子IL-4和IL-13代替鼠细胞因子，进行人IL-4免疫原性产品、IL-13免疫原性产品和组合免疫原性产品的制备。

IL-4和IL-13免疫原性产品的制备

a)CRM

如对鼠产品所述地进行CRM

b)IL-4和IL-13的功能化

使溶解在缓冲液(70mM磷酸钠缓冲液，150mM NaCl，5mM EDTA，pH 7.2)中的IL-4或IL-13与先前以10mM浓度溶解在缓冲液中的sGMBS反应。在室温温和搅拌下反应一小时后，用Zeba脱盐柱去除过量的sGMBS。

c)偶联

在CRM

组合的免疫原性产品的制备

可以使用以下两种不同的方法进行组合的免疫原性产品的制备：通过将两种修饰的细胞因子共同与修饰的载体蛋白一起温育(同时合成)，或者通过将两种独立合成的IL-4和IL-13免疫原性产品混合(混合制备)。

a)CRM

如对鼠产品所述地进行CRM

b)IL-4和IL-13的功能化

如单独的免疫原性产品制备所述地进行IL-4或IL-13的功能化。

c)偶联

在CRM

在浓缩步骤和0.22μm无菌过滤步骤后，将独立合成的IL-4和IL-13免疫原性产品以1-1的重量比混合在一起。将组合的免疫原性产品保存在4℃下直至使用。

进行夹心ELISA以评估细胞因子与载体蛋白的偶联，并且还评估在制备过程中是否保留了表位。使用的规程与上述的规程相同，使用生物素化的抗人IL-4和IL-13抗体。

结果显示在图13中。该试验证实了本发明的免疫原性产品包含与CRM

小鼠免疫规程

每只Balb/c小鼠(每组10只小鼠)在第0、7、28和49天接受四次用角鲨烯基佐剂乳化的免疫原性产品的肌肉内(i.m.)注射，均以4μg剂量进行，如图14详述。在7周龄时进行首次免疫。在给药之前以及在第38、59、90和120天进行血液采集。在室温下凝血并离心以去除血块后，制备血清样品。

通过ELISA确定抗IL4和抗IL-13抗体滴度

通过ELISA测量收集自每组的小鼠血清中的抗细胞因子抗体滴度。

如上所述，通过将人IL-4和IL-13包被在96孔板上，来评估用免疫原性产品或组合免疫原性产品免疫后的血清中每种抗体滴度的确定。

在给药前在所有组中均未检测到细胞因子抗体滴度。在用IL-4免疫原性产品和muCombo免疫原性产品免疫后的所有时间点，在所有小鼠中均检测到抗IL-4抗体滴度(图15-A)。在接受IL-4免疫原性产品和组合的免疫原性产品的小鼠中观察到相似的水平，表明我们可能已经到达免疫应答的平台。在IL-13免疫原性产品组中免疫后的所有时间点在所有小鼠中均检测到抗IL-13抗体滴度(图15-B)。在组合的免疫原性产品组中，最早在D38时，且在D59的10只小鼠中的8只中检测到抗IL-13抗体。在用IL-13免疫原性产品免疫后的血清中观察到的抗IL-13抗体滴度高于用组合的免疫原性产品时，因为组合组的小鼠接受了一半的单独的免疫原性产品剂量。

确定免疫后的中和能力

如上所述，使用HEK-Blue

在免疫后的所有时间点，在用IL-4免疫原性产品和组合的免疫原性产品免疫的组中观察到100％的应答小鼠均具有高的抗IL-4的中和能力(图16-A和表10)。

表10：针对IL-4的NC

在用IL-13免疫原性产品和组合的免疫原性产品免疫的小鼠中也诱导了具有抗IL-13的中和能力的抗体，其中在D59时100％的应答小鼠均有(图16-B和表11)。

表11：针对IL-13的NC

总之，本发明的产品能够诱导具有强中和能力的高的抗细胞因子抗体滴度。

人免疫原性产品的残余活性

如上对IL-4和IL-13的残余活性所述地，使用HEK-Blue

表12：针对IL-4的ED

表13：针对IL-13的ED

如表12和表13所示，人免疫原性产品中针对IL-4或IL-13的失活因子均大于1000(并且高达8765)，这表明免疫原性产品中的细胞因子残余活性相比于天然细胞因子降低了至少三个数量级。

这些高度降低的残余活性是支持本发明产品安全性的重要要素。

食物过敏反应是西方国家的主要健康问题，在过去的几十年中愈发流行，并且缺乏根治疗法。几种主要食品，包括奶、花生、大豆和小麦，均可以引起食物变应性反应。食物过敏反应反映了对无害食物变应原的口服耐受性下降，导致了失调的Th2免疫应答的发展，Th2细胞因子(主要是IL-4和IL-13)的分泌，对变应原特异的IgE的分泌以及效应细胞向胃肠(GI)道的募集。

使用IL-4raF709突变小鼠研究了本发明的免疫原性产品在食物过敏反应中的治疗功效。IL-4raF709小鼠携带在IL-4受体(IL-4R)α链中的功能获得性突变，其破坏了含有Src同源域2的蛋白酪氨酸磷酸酶1(SHP-1)与受体亚基的结合，并导致了通过IL-4和IL-13的转录激活子6(STAT6)激活的信号转导子及激活子的增强。这些小鼠表现出增强的Th2细胞应答和IgE产生。因此，该突变是许多促进受体信号传导并与特应性有关的人IL-4Rα多态性的原型。

制备muIL-4/IL-13和muCombo免疫原性产品

如上文所述合成muIL-4、muIL-13和muCombo免疫原性产品。

小鼠免疫、食物过敏反应模型、过敏反应(anaphylaxis response)、组织学分析和血液采样

在第0、7、28天用均用角鲨烯基佐剂乳化的muIL-4、muIL-13或muCombo免疫原性产品或CRM

并行地，通过口服管饲法用PBS或悬浮在250μl 0.1M碳酸氢钠(pH 8.0)中的23mg花生(PE)酱(对应于5mg花生蛋白)使小鼠致敏。用稀释在水中的450mg花生酱(100mg蛋白)的肠内推注攻毒小鼠(Burton等人，2014)。

在刚攻毒后，在一个小时内以及在腹泻发作后追踪核心体温(core bodytemperature)。

还确定了临床评分：0，无临床症状；1，重复的口/耳抓挠和用后肢挖耳道；2，活动减少，自我孤立，眼睛和/或嘴周围浮肿；3，不活动期超过一分钟，胃部俯卧(lying proneon stomach)；4，对须(whisker)刺激无应答，对戳刺的应答减少或无应答；5，震颤抽搐或死亡。

收集肠组织切片用于组织学分析(例如肥大细胞的定量)。

还收集血液以研究炎症水平(例如肥大细胞脱粒产物)、抗体水平(例如抗细胞因子滴度、中和能力、对变应原特异的IgG和对变应原特异的IgE以及总IgE)。

特应性皮炎(AD)是一种慢性或慢性复发性的瘙痒性炎症性皮肤病。在过去三十年中，AD的发病率在工业化国家中急剧上升。AD的免疫学异常的特征通常在于由各种变应原(例如食物、空气变应原、微生物和自体变应原)致敏，高血清IgE水平以及具有凋亡的角质形成细胞的皮肤损伤和分泌Th2细胞因子(例如IL-4、IL-5和IL-13)的免疫细胞的浸润。

通过使用动物模型来研究本发明的免疫原性产品在AD中的治疗功效，在该动物模型中，重复表皮施用房尘螨(HDM)提取物和葡萄球菌肠毒素B引起湿疹性皮肤损伤。

制备muIL-4/IL-13和muCombo免疫原性产品

如上文所述合成muIL-4、muIL-13和muCombo免疫原性产品。

小鼠免疫、特应性皮炎诱导、临床严重程度测量、组织学分析和血液采样

用均用角鲨烯基佐剂乳化的muIL-4、muIL-13或muCombo免疫原性产品或CRM

并行地，如先前在Ando等人(J Invest Dermatol.2013年12月；133(12):2695-2705)中描述地诱导特应性皮炎。简而言之，将500ng葡萄球菌肠毒素(SEB)和10μg美洲尘螨提取物(Der f是房尘螨，HDM)的溶液涂在放置于剃毛区域的纱布上。使用绷带用Tegaderm

由一名不知道小鼠身份的研究人员在去除最后一个周期的敷料后2天对临床严重程度进行评分。临床评分基于四种可能症状(发红、出血、发疹和脱屑)的严重程度(0，无症状；1，轻度；2，中度；3，严重)。最高可能得分为12。

评分后立即将小鼠安乐死，获得对应于所治疗区域的背部皮肤样本用于表皮厚度和嗜酸性粒细胞的组织学分析。还收集血液以研究炎症水平和抗体水平(例如抗细胞因子滴度、中和能力、对变应原特异的IgG和对变应原特异的IgE以及总IgE)。

COPD的特征在于通常与对吸入的刺激物的过度炎症性应答有关的进行性气流受限(progressive airflow limitation)，其导致慢性阻塞性支气管炎和肺实质的破坏，称为肺气肿。

已经建立了几种COPD动物模型以阐明COPD的开始和发展的潜在机制。在此，使用由蛋白酶诱导的模型以评估本发明的免疫原性产品在COPD中的治疗功效。

制备muIL-4/IL-13和muCombo免疫原性产品

如上文所述合成muIL-4、muIL-13和muCombo免疫原性产品。

小鼠免疫、特应性皮炎诱导、白细胞定量和组织学分析

用均用角鲨烯基佐剂乳化的muIL-4、muIL-13或muCombo免疫原性产品或CRM

并行地，使用例如猪胰弹性蛋白酶的弹性蛋白酶的鼻内滴注引发COPD样症状，例如肺气肿的形成。简而言之，用30μL PBS中的0.6U猪胰弹性蛋白酶对BALB/c小鼠进行鼻内处理(Shibata等人Proc Natl Acad Sci USA.2018年12月18日；115(51):13057-13062)。

在第一个实验中，在第5天将小鼠安乐死用于评估白细胞：通过流式细胞术定量支气管肺泡灌洗(BAL)液和肺细胞的单细胞悬浮液中的白细胞(例如单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、T细胞、B细胞和嗜酸性粒细胞)数量。通过对先前用苏木精和曙红(H&E)染色的肺组织进行组织学检查来进行对肺中白细胞浸润的额外评估。还收集血液以研究炎症水平和抗体水平(例如抗细胞因子滴度、中和能力)。

在第二个实验中，在弹性蛋白酶处理后的第21天处死小鼠以用于在H&E染色的肺组织切片中通过组织学评估肺气肿，其使用平均线性截距(MLI)作为肺空域扩大(lungairspace enlargement)的指标。还收集血液以研究炎症水平和抗体水平(例如抗细胞因子滴度、中和能力、对变应原特异的IgG和对变应原特异的IgE以及总IgE)。

肺纤维化代表了以不同程度的肺部炎症、肺成纤维细胞的过度增殖以及肺胶原含量增加为特征的广谱疾病。

使用动物模型研究本发明的免疫原性产品在肺纤维化中的治疗功效，其中在肺中施用博来霉素(BLM)导致促炎性细胞因子和趋化因子的分泌、白细胞的募集、增加的胶原蛋白产量、重塑和纤维化肺炎症。

制备muIL-4/IL-13和muCombo免疫原性产品

如上文所述合成muIL-4、muIL-13和muCombo免疫原性产品。

小鼠免疫、肺纤维化诱导、白细胞定量和组织学分析

用均用角鲨烯基佐剂乳化的muIL-4、muIL-13或muCombo免疫原性产品或CRM

并行地，如先前由Reber等人(J Immunol 2014年2月15日；192(4):1847-54)所述在C57BL/6小鼠中诱发肺纤维化。简而言之，通过鼻内(i.n.)施用BLM盐酸盐(0.1mg于25μlPBS中；12.5μl/鼻孔)来诱导肺纤维化。

每周监测体重5次直至实验结束，并在BLM处理后7天或14天将小鼠安乐死以评估肺纤维化。

通过流式细胞术定量支气管肺泡灌洗(BAL)液和肺细胞的单细胞悬浮液中的白细胞(例如单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、T细胞、B细胞和嗜酸性粒细胞)数量。

对用苏木精和曙红(用于评估白细胞浸润)、masson三色(masson trichrome)(用于评估纤维化)或甲苯胺蓝(用于评估肥大细胞数量)染色的肺组织进行组织学检查。

还收集血液以研究炎症水平和抗体水平(例如抗细胞因子滴度、中和能力)。

序列表

<110> 尼奥瓦克斯公司（NEOVACS）

法国国家健康和医学研究院（INSERM，Institut National de la Santé

et de la Recherche Médicale）

巴斯德研究院（INSTITUT PASTEUR）

G·格鲁阿德-沃格尔（Grouard-Vogel Géraldine）

E·康德加西亚（Conde García Eva）

R·伯特兰（Bertrand Romain）

N·凯洛特（Caillot Noémie）

L·勒贝（Reber Laurent

P·布鲁恩斯（Bruhns Pierre）

V·塞拉（Serra Vincent）

<120> 用于治疗与异常的IL-4和/或IL-13表达或活性相关的病症的包含IL-4和/或

IL-13的免疫原性产品

<130> CV-1058/PCT/2

<160> 8

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 535

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CRM197

<400> 1

Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn

1 5 10 15

Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln

20 25 30

Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp

35 40 45

Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly

50 55 60

Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val

65 70 75 80

Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val

85 90 95

Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu

100 105 110

Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly

115 120 125

Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser

130 135 140

Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser

145 150 155 160

Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp

165 170 175

Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg

180 185 190

Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val

195 200 205

Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly

210 215 220

Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu

225 230 235 240

Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu

245 250 255

His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val

260 265 270

Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val

275 280 285

Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu

290 295 300

Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala

305 310 315 320

Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser

325 330 335

Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp

340 345 350

Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe

355 360 365

Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His

370 375 380

Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr

385 390 395 400

Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His

405 410 415

Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val

420 425 430

Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr

435 440 445

His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile

450 455 460

Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly

465 470 475 480

Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser

485 490 495

Glu Lys Ile His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu

500 505 510

Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser

515 520 525

Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser

530 535

<210> 2

<211> 129

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> 人IL-4

<400> 2

His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser

1 5 10 15

Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile

20 25 30

Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala

35 40 45

Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg

50 55 60

Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile

65 70 75 80

Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu

85 90 95

Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe

100 105 110

Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser

115 120 125

Ser

<210> 3

<211> 22

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> 人IL-4的片段

<400> 3

Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg

1 5 10 15

Leu Asp Arg Asn Leu Trp

20

<210> 4

<211> 120

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<220>

<223> 鼠IL-4

<400> 4

His Ile His Gly Cys Asp Lys Asn His Leu Arg Glu Ile Ile Gly Ile

1 5 10 15

Leu Asn Glu Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Cys Thr Glu Met Asp Val

20 25 30

Pro Asn Val Leu Thr Ala Thr Lys Asn Thr Thr Glu Ser Glu Leu Val

35 40 45

Cys Arg Ala Ser Lys Val Leu Arg Ile Phe Tyr Leu Lys His Gly Lys

50 55 60

Thr Pro Cys Leu Lys Lys Asn Ser Ser Val Leu Met Glu Leu Gln Arg

65 70 75 80

Leu Phe Arg Ala Phe Arg Cys Leu Asp Ser Ser Ile Ser Cys Thr Met

85 90 95

Asn Glu Ser Lys Ser Thr Ser Leu Lys Asp Phe Leu Glu Ser Leu Lys

100 105 110

Ser Ile Met Gln Met Asp Tyr Ser

115 120

<210> 5

<211> 108

<212> PRT

<213> 犬（Canis）

<220>

<223> 犬IL-4

<400> 5

His Asn Phe Asn Ile Thr Ile Lys Glu Ile Ile Lys Met Leu Asn Ile

1 5 10 15

Leu Thr Ala Arg Asn Asp Ser Cys Met Glu Leu Thr Val Lys Asp Val

20 25 30

Phe Thr Ala Pro Lys Asn Thr Ser Asp Lys Glu Ile Phe Cys Arg Ala

35 40 45

Ala Thr Val Leu Arg Gln Ile Tyr Thr His Asn Cys Ser Asn Arg Tyr

50 55 60

Leu Arg Gly Leu Tyr Arg Asn Leu Ser Ser Met Ala Asn Lys Thr Cys

65 70 75 80

Ser Met Asn Glu Ile Lys Lys Ser Thr Leu Lys Asp Phe Leu Glu Arg

85 90 95

Leu Lys Val Ile Met Gln Lys Lys Tyr Tyr Arg His

100 105

<210> 6

<211> 122

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> 人IL-13

<400> 6

Leu Thr Cys Leu Gly Gly Phe Ala Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser

1 5 10 15

Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn

20 25 30

Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu

35 40 45

Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser

50 55 60

Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys

65 70 75 80

Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp

85 90 95

Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu

100 105 110

Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn

115 120

<210> 7

<211> 110

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<220>

<223> 鼠IL-13

<400> 7

Pro Val Pro Arg Ser Val Ser Leu Pro Leu Thr Leu Lys Glu Leu Ile

1 5 10 15

Glu Glu Leu Ser Asn Ile Thr Gln Asp Gln Thr Pro Leu Cys Asn Gly

20 25 30

Ser Met Val Trp Ser Val Asp Leu Ala Ala Gly Gly Phe Cys Val Ala

35 40 45

Leu Asp Ser Leu Thr Asn Ile Ser Asn Cys Asn Ala Ile Tyr Arg Thr

50 55 60

Gln Arg Ile Leu His Gly Leu Cys Asn Arg Lys Ala Pro Thr Thr Val

65 70 75 80

Ser Ser Leu Pro Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala His Phe Ile Thr Lys

85 90 95

Leu Leu Ser Tyr Thr Lys Gln Leu Phe Arg His Gly Pro Phe

100 105 110

<210> 8

<211> 113

<212> PRT

<213> 犬（Canis）

<220>

<223> 犬IL-13

<400> 8

Ser Pro Ser Pro Val Thr Pro Ser Pro Thr Leu Lys Glu Leu Ile Glu

1 5 10 15

Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Ala Ser Leu Cys Asn Gly Ser

20 25 30

Met Val Trp Ser Val Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu

35 40 45

Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Asp Cys Ser Ala Ile Gln Arg Thr Gln

50 55 60

Arg Met Leu Lys Ala Leu Cys Ser Gln Lys Pro Ala Ala Gly Gln Ile

65 70 75 80

Ser Ser Glu Arg Ser Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ile Gln Leu Val

85 90 95

Lys Asn Leu Leu Thr Tyr Val Arg Gly Val Tyr Arg His Gly Asn Phe

100 105 110

Arg