在无细胞体系中对DNA进行编辑的方法

摘要

一种在无细胞体系中对DNA进行编辑的方法，包括：(1)在无细胞体系中，在DNA的目标部位导入缺失、替换或添加的工序；以及(2)将在工序(1)中导入了缺失、替换或添加的DNA在无细胞体系中扩增的工序；其中，该DNA在以20℃～80℃范围的温度温育的温度条件下扩增。

说明书

技术领域

本发明涉及在无细胞体系中对DNA进行编辑的方法。

本申请基于2018年7月30日在日本提出的特愿2018-142274号主张优先权，此处援引其内容。

背景技术

基因组编辑是使用目标序列特异性核酸酶，如愿改变目标基因的技术。作为可利用的核酸酶，已知CRISPR-Cas9、ZFN、TALEN等核酸内切酶。利用基因组编辑技术，能够在从细菌到人的许多物种中，在细胞内对目标DNA序列进行编辑(非专利文献1～3)。目标序列特异性核酸内切酶是切割DNA双链的酶，因而为了获得作为经编辑的目的基因组，有必要在DNA双链切割后经过细胞内的DNA修复过程。在基因组中插入新的DNA序列的情况下，利用同源重组进行的修复过程发挥功能。通过使切割部位包含相同序列的DNA片段在DNA双链切割时存在于细胞内，能够通过利用同源序列的重组，使希望的DNA序列插入切割部位。此外，在缺失数个碱基的短序列的情况下，利用非同源末端连接(NHEJ)进行的修复过程发挥功能。这种情况下，切割部位通过NHEJ被修复时，会引起碱基的缺失、突变。

目标序列特异性核酸内切酶对DNA双链的切割不仅负责细胞内这些修复过程的触发，而且还负责作为使未经编辑而残留的DNA选择性失活的反向选择功能。即，编辑后的DNA不再受到目标序列特异性核酸内切酶的切割，因此在细胞内经过复制过程进行扩增，而编辑前的DNA持续受到双链切割的攻击，因此在细胞内的扩增受到抑制。

大肠杆菌中，也可以不使用目标序列特异性核酸内切酶，在细胞内对DNA序列进行改变。作为其例子，已知有使用原噬菌体的RecET重组酶的体系(非专利文献4)、使用λ噬菌体的Red重组酶的体系(非专利文献5和6)。这些体系中，导入大肠杆菌内的双链DNA片段的末端单链化，通过该部分与在DNA复制中基因组上露出的单链部分结合，诱导重组反应。即使不是双链DNA片段，将短的单链DNA即寡聚DNA导入大肠杆菌内，该寡聚DNA也能够与露出单链结合，在基因组中导入碱基替换(非专利文献7)。

在大肠杆菌中，这样的利用寡聚DNA的碱基替换效率很低，但最近也报道了通过使用CRISPR-Cas9的目标序列切割系统作为反向选择而使其效率上升的方法(非专利文献8)。

另一方面，作为在无细胞体系中对DNA进行编辑的技术，以往已知利用聚合酶链反应(PCR)的技术。例如，使用包含碱基替换、缺失或添加等突变的引物DNA，通过PCR法扩增模板DNA、或者通过PCR法扩增DNA片段彼此的连接产物，能够不使用细胞，制备对DNA序列进行了人为编辑的产物。

也可以将利用CRISPR-Cas9的目标序列切割系统在体外(in vitro)进行利用。例如，报道了利用CRISPR-Cas9将基因组的100kb区域克隆至大肠杆菌质粒(非专利文献9)。该报告中，利用CRISPR-Cas9进行的目标位置的基因组切割和切割片段与质粒的连接反应是在试管内进行的。

此外，作为在无细胞体系中使DNA片段彼此连接的技术，已知融合(In fusion)法(专利文献1)、Gibson组装(Gibson Assembly)法(专利文献2和3)、重组组装(Recombination Assembly)法(专利文献4)等。

作为在无细胞体系中扩增DNA的技术，广泛使用的是PCR法，但由于使用的酶的持续性，能够扩增的DNA的长度是有限制的。通常难以用PCR法扩增超过50kb的长链DNA。

作为在无细胞体系中对那样的长链DNA进行扩增的方法，报道了用于扩增具有复制起始序列oriC的环状DNA的in vitro重建体系(专利文献5～7)。该方法被称为复制周期反应(Replication Cycle Reaction，RCR)法，能够扩增难以通过PCR法扩增的50kb以上的长链DNA。

上述那样的使用细胞的DNA编辑方法中，在需要培养、反应所需的酶向细胞内的导入等先进技术的基础上，还需要大量的时间和劳力。此外，还会产生在编辑产生的DNA序列显示细胞毒性的情况下无法获得目的产物的问题。此外，DNA链越长则将DNA导入细胞本身越困难。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：美国专利第7,575,860号说明书

专利文献2：美国专利第7,776,532号说明书

专利文献3：美国专利第8,968,999号说明书

专利文献4：国际公开第2019/009361号

专利文献5：国际公开第2016/080424号

专利文献6：国际公开第2017/199991号

专利文献7：国际公开第2018/159669号

非专利文献

非专利文献1：Carroll,D.(2014)利用可靶向核酸酶的基因组工程(GenomeEngineering with Targetable Nucleases)。生物化学年度评论(Annual Review ofBiochemistry),83,409-439。

非专利文献2：Mougiakos,I.，Bosma,E.F.，de Vos,W.M.，van Kranenburg,R.和van der Oost,J.(2016)下一代原核工程：CRISPR-Cas工具包(Next GenerationProkaryotic Engineering:The CRISPR-Cas Toolkit)。生物技术趋势(Trends inBiotechnology),34,575-587。

非专利文献3：Mougiakos,I.，Bosma,E.F.，Ganguly,J.，van der Oost,J.和vanKranenburg,R.(2018)劫持CRISPR-Cas用于高通量细菌代谢工程：进展和前景(HijackingCRISPR-Cas for high-throughput bacterial metabolic engineering:advances andprospects)。生物技术最新观点(Current Opinion in Biotechnology),50,146-157。

非专利文献4：Zhang,Y.,Bu，chholz,F.，Muyrers,J.P.和Stewart,A.F.(1998)使用重组技术在大肠杆菌中进行DNA工程的新逻辑(A new logic for DNA engineeringusing recombination in Escherichia coli)。自然-遗传学(Nature genetics),20,123-128。

非专利文献5：Datsenko,K.A.和Wanner,B.L.(2000)使用PCR产物一步灭活大肠杆菌K-12中的染色体基因(One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichia coli K-12using PCR products)。美国科学院院刊(Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America),97,6640-6645。

非专利文献6：Yu,D.，Ellis,H.M.，Lee,E.C.，Jenkins,N.A.，Copeland,N.G.和Court,D.L.(2000)用于大肠杆菌中染色体工程的有效重组系统(An efficientrecombination system for chromosome engineering in Escherichia coli)。美国科学院院刊(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America),97,5978-5983。

非专利文献7：Ellis,H.M.，Yu,D.，DiTizio,T.和Court,D.L.(2001)使用单链寡核苷酸高效诱变、修复和改造染色体DNA(High efficiency mutagenesis,repair,andengineering of chromosomal DNA using single-stranded oligonucleotides)。美国科学院院刊(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America),98,6742-6746。

非专利文献8：Ronda,C.，Pedersen,L.E.，Sommer,M.O.A.和Nielsen,A.T.(2016)CRMAGE：CRISPR优化的MAGE重组(CRISPR Optimized MAGE Recombineering)。科学报告(Scientific Reports),6,1-11。

非专利文献9：Wang,H.，Li,Z.，Jia,R.，Yin,J.，Li,A.，Xia,L.，Yin,Y.，Muller,R.，Fu,J.，Stewart,A.F.和Zhang,Y.(2017)ExoCET：核酸外切酶体外组装与RecET重组相结合，可从复杂基因组进行高效直接DNA克隆(ExoCET:exonuclease in vitro assemblycombined with RecET recombination for highly efficient direct DNA cloningfrom complex genomes)。核酸研究(Nucleic Acids Research),10.1093/nar/gkx1296。

发明内容

发明所要解决的课题

本发明提供一种在无细胞体系中对DNA进行编辑的方法，在最终对DNA编辑产物进行选择性扩增的工序之前，可以不使用细胞地实施。

用于解决课题的方法

本发明人等进行了深入研究，结果发现，通过将在无细胞体系中等温扩增DNA或在无细胞体系中重复65℃以下的2个温度的温育而扩增DNA的技术、与可在无细胞体系中利用的DNA编辑(改变)技术组合，能够不使用细胞地扩增DNA编辑产物。进一步还发现，通过组合特异性切割未编辑的DNA的工序，可大幅改善DNA编辑产物的收率。基于这些见解，通过进一步的反复研究，完成了本发明。

即，本发明包括以下的方式。

〔1〕一种在无细胞体系中对DNA进行编辑的方法，包括以下的工序：

(1)在无细胞体系中，在DNA的目标部位导入缺失、替换或添加的工序；以及

(2)将在工序(1)中导入了缺失、替换或添加的DNA在无细胞体系中扩增的工序，其中，该DNA在以20℃～80℃范围的温度温育的温度条件下扩增。

〔2〕根据〔1〕所述的在无细胞体系中对DNA进行编辑的方法，包括以下的工序：

(1)在无细胞体系中，在DNA的目标部位导入缺失、替换或添加的工序；以及

(2)将在工序(1)中导入了缺失、替换或添加的DNA在无细胞体系中扩增的工序，其中，该DNA在等温温育、或者在以2个65℃以下的温度反复温育的温度循环下温育的温度条件下扩增。

〔3〕根据〔1〕或〔2〕所述的在无细胞体系中对DNA进行编辑的方法，包括以下的工序：

(1)在无细胞体系中，在DNA的目标部位导入缺失、替换或添加的工序；以及

(2)将在工序(1)中导入了缺失、替换或添加的DNA在无细胞体系中扩增的工序，其中，该DNA在处于20℃～80℃范围内的一定的温度温育、或者在以2个65℃以下的温度反复温育的温度循环下温育的温度条件下扩增。

〔4〕根据〔1〕～〔3〕中任一项所述的方法，在特异性切割未导入缺失、替换或添加的DNA的人工DNA切割酶的存在下进行工序(2)。

〔5〕根据〔4〕所述的方法，人工DNA切割酶为人工核酸酶或RNA引导性核酸酶。

〔6〕根据〔4〕所述的方法，人工DNA切割酶为CRISPR-Cas9。

〔7〕根据〔1〕～〔6〕中任一项所述的方法，DNA为环状DNA。

〔8〕根据〔7〕所述的方法，工序(2)包括以下的工序：

(2-1)制备含有(a)催化环状DNA的复制的第一酶群、(b)催化冈崎片段连接反应来合成形成环连体的2个姊妹环状DNA的第二酶群和(c)催化2个姊妹环状DNA的分离反应的第三酶群的反应溶液与在工序(1)中导入了缺失、替换或添加的环状DNA的反应混合物的工序；以及

(2-2)将工序(2-1)中制备的反应混合物在处于20℃～80℃范围内的一定的温度下温育、或者在以2个65℃以下的温度反复温育的温度循环下温育的工序。

〔9〕根据〔8〕所述的方法，环状DNA包含能够与具有DnaA活性的酶结合的复制起始序列。

〔10〕根据〔7〕所述的方法，工序(2)中，环状DNA是通过滚环扩增而扩增的。

〔11〕根据〔1〕～〔10〕中任一项所述的方法，工序(1)包括以下的工序：

(1-1)使人工DNA切割酶作用于DNA从而在目标部位对该DNA进行切割，制备至少一条直链DNA的工序；

(1-2)制备含有工序(1-1)中制备的直链DNA、1种以上DNA片段和具有RecA家族重组酶活性的蛋白的反应溶液的工序；以及

(1-3)使该直链DNA与该1种以上DNA片段在碱基序列相同的区域彼此或碱基序列互补的区域彼此互相连接，形成在模板DNA的目标部位插入有该1种以上DNA片段的DNA的工序。

〔12〕根据〔1〕～〔10〕中任一项所述的方法，工序(1)包括以下的工序：

在用于导入缺失、替换或添加的单链DNA存在下进行DNA的复制反应的工序，其中，该单链DNA能够在复制反应的条件下与该DNA的目标部位杂交。

〔13〕根据〔1〕～〔12〕中任一项所述的方法，工序(2)中，DNA在重复30℃以上的温育和27℃以下的温育的温度循环下进行温育的温度条件下扩增。

〔14〕根据〔1〕～〔13〕中任一项所述的方法，导入缺失、替换或添加的DNA的大小为50kb以上。

发明效果

根据上述方式的方法，可以提供不使用细胞的扩增DNA编辑产物、特别是长链DNA编辑产物的方法等。此外，上述方式的方法中，能够在比较低的温度条件下扩增DNA，因此能够与以往的难以与DNA扩增技术组合的技术、例如利用CRISPR-Cas9等人工DNA切割酶的序列特异性DNA切割技术等组合，高效扩增DNA编辑产物。

附图说明

图1为显示直链DNA向通过利用Cas9的序列特异性切割产生的长链oriC DNA的直链化、利用相同末端序列的DNA分子连接方法(Recombination Assembly，RA)直链化的环状DNA的插入、以及插入后的环状DNA的利用RCR(Replication Cycle Reaction，复制环反应)的扩增的模式图。

图2A为显示pOri8(9.5kb的环状DNA)的结构的图。

图2B为显示pOri8被CRISPR-Cas9序列特异性切割的图。

图3A为显示pMSR227(205kb的环状DNA)的结构的图。

图3B为显示pMSR227被CRISPR-Cas9序列特异性切割的图。

图4为显示通过在CRISPR-Cas9存在下进行RCR，能够抑制未改变的模板DNA的扩增、特异性扩增目的连接产物的模式图。

图5为显示通过在反应体系中添加切割模板DNA但不切割插入了lacZ的DNA的CRISPR-Cas9并进行RCR，能够以高的效率扩增插入了lacZ的环状DNA的图。

图6A为显示插入了lacZ(3.3kb)的pMSR227(205kb)的结构的图。

图6B为通过限制酶XhoI切割来确认插入了lacZ的pMSR227的结构的图。

图7为显示实施例3的将2个长链DNA片段彼此借助2个接头片段通过RA连接环化的工序的模式图。

图8为显示实施例3的利用RA-RCR的长链环状DNA的扩增的图。

图9为确认从实施例3的用183kb连接产物转化的大肠杆菌回收到的质粒的大小的图。

图10为确认实施例3中得到的183kb连接产物的结构的图。

图1 1A为显示实施例4中使用的lacZ突变pPKOZ(pPKOZins和pPKOZmis)的结构的图。

图11B为显示实施例4的实验体系的图。

图12为显示实施例4中使用的lacZ wt、lacZ ins和lacZ mis起始密码子下游的部分序列(将各碱基序列示于序列编号58～60。)、以及碱基替换导入用的寡聚核苷酸(30mer)的序列(序列编号17、SUE1355)的图。

图13A为显示研究碱基替换导入用的寡聚核苷酸的长度和浓度对于导入碱基替换的质粒的扩增效率(即蓝色菌落的比例)的影响的结果的图。显示的是电泳结果。

图13B为显示研究碱基替换导入用的寡聚核苷酸的长度和浓度对于导入碱基替换的质粒的扩增效率(即蓝色菌落的比例)的影响的结果的图。显示的是大肠杆菌转化菌落的蓝白判断结果。

图14A为显示研究碱基替换导入用的寡聚核苷酸的浓度对于导入碱基替换的质粒的扩增效率(即蓝色菌落的比例)的影响的结果的图。显示的是电泳结果。

图14B为显示研究碱基替换导入用的寡聚核苷酸的浓度对于导入碱基替换的质粒的扩增效率(即蓝色菌落的比例)的影响的结果的图。显示的是大肠杆菌转化菌落的蓝白判断结果。

图15A为显示通过在反应体系内添加特异性切割碱基替换导入前的质粒的CRISPR-Cas9进行RCR而得到接近100％的碱基替换导入率的图。是显示电泳的结果的图。

图15B为显示通过在反应体系内添加特异性切割碱基替换导入前的质粒的CRISPR-Cas9进行RCR而得到接近100％的碱基替换导入率的图。显示的是大肠杆菌转化菌落的蓝白判断结果。

图16A为显示p0ri93Zins的结构的图。

图16B为显示研究碱基替换导入用的寡聚核苷酸的浓度对于对长链DNA导入碱基替换的质粒的扩增效率(即蓝色菌落的比例)的影响的结果的图。显示的是电泳结果。

图16C为显示研究碱基替换导入用的寡聚核苷酸的浓度对于对长链DNA导入碱基替换的质粒的扩增效率(即蓝色菌落的比例)的影响的结果的图。显示的是大肠杆菌转化菌落的蓝白判断结果。

图17A为显示对于长链DNA，通过在反应体系内添加特异性切割碱基替换导入前的质粒的CRISPR-Cas9进行RCR而得到接近100％的碱基替换导入率的图。显示的是电泳结果。

图17B为显示对于长链DNA，通过在反应体系内添加特异性切割碱基替换导入前的质粒的CRISPR-Cas9进行RCR而得到接近100％的碱基替换导入率的图。显示的是大肠杆菌转化菌落的蓝白判断结果。

图18A为显示实施例9中使用的pPKOZins起始密码子附近的部分序列(序列编号61)和改变(3个碱基替换)用的寡聚核苷酸(60mer)的序列(序列编号56)的图。

图18B为显示实施例9中使用的pPKOZ起始密码子附近的部分序列(序列编号62)和改变(4个碱基插入)用的寡聚核苷酸(60mer)的序列(序列编号57)的图。

图18C为显示研究改变(3个碱基替换或4个碱基插入)用的寡聚核苷酸的浓度对于有3个碱基替换或4个碱基插入的质粒的扩增效率(3个碱基替换的情况下为蓝色菌落的比例，4个碱基插入的情况下为白色菌落的比例)的影响的结果的图。显示的是电泳结果。

图18D为显示研究改变(3个碱基替换)用的寡聚核苷酸的浓度对于有3个碱基替换的质粒的扩增效率(即蓝色菌落的比例)的影响的结果的图。显示的是大肠杆菌转化菌落的蓝白判断结果。

图18E为显示研究改变(4个碱基插入)用的寡聚核苷酸的浓度对于有4个碱基插入的质粒的扩增效率(即白色菌落的比例)的影响的结果的图。显示的是大肠杆菌转化菌落的蓝白判断结果。

图18F为显示pPKOZ(wt)的EcoRI切割部位的图。

图18G为显示pPKOZ4ins的EcoRI切割部位的图。

图18H为显示通过限制酶处理确认插入有4个碱基的质粒的结果的图。显示的是电泳结果。

图19A显示的是pK3OV_insAC的结构。

图19B为显示实施例10的实验体系的图。

图19C为显示实施例10中使用的pP3OV_insAC的vioA ins的序列(序列编号68)和碱基替换导入用的寡聚核苷酸(60mer)的序列(序列编号65、SUE4577)的图。

图19D为显示实施例10中使用的pP3OV_insAC的vioC ins的序列(序列编号69)和碱基替换导入用的寡聚核苷酸(60mer)的序列(序列编号66、SUE4381)的图。

图19E为显示研究与碱基替换导入用的寡聚核苷酸的反应时间对于2处同时有碱基替换的质粒的比例(即紫菌落的比例)的影响的结果的图。显示的是大肠杆菌转化菌落的颜色判断结果。

具体实施方式

I.在无细胞体系中对DNA进行编辑的方法

本发明提供一种在无细胞体系中对DNA进行编辑的方法，包括以下的工序：

(1)在无细胞体系中，在DNA的目标部位导入缺失、替换或添加的工序；以及

(2)将在工序(1)中导入了缺失、替换或添加的DNA在无细胞体系中扩增的工序，其中，该DNA在以20℃～80℃范围的温度温育的温度条件下扩增(本说明书中，有时称为本发明的方法。)。

本发明中，“在无细胞体系中对DNA进行编辑”是指不使用细胞，改变DNA中的目标部位，对得到的DNA进行扩增。需说明的是，本说明书中，有时将改变前的DNA称为模板DNA。以往的使用细胞的体系中，有必要将在细胞外改变的DNA导入细胞内或者为了改变存在于细胞内的DNA而将所需的酶等导入细胞内，存在在细胞的培养等中需要先进的技术的基础上还需要大量的时间和劳力的问题。本发明中，在改变DNA并扩增的过程中完全不使用细胞，因此可以高效制作有改变的DNA。

本发明中，模板DNA可以为单链或双链中的任一种。模板DNA为单链的情况下，在本发明的方法的工序(1)或(2)中形成双链。因此，通过本发明的方法，可以获得模板DNA中的目标部位被改变的双链DNA。此外，模板DNA可以为环状DNA或直链状DNA。

导入缺失、替换或添加的DNA的大小根据工序(1)和(2)中使用的技术的不同而不同，例如可以为1kb(1000个碱基长度)以上、5kb以上、8.8kb以上、9.5kb以上、10kb以上、20kb以上、30kb以上、40kb以上、50kb以上、60kb以上、70kb以上、80kb以上、90kb以上、100kb以上、101kb以上、183kb以上、200kb以上、205kb以上、300kb以上、500kb以上、1000kb以上、或2000kb以上。工序(2)中使用后述RCR法的情况下，可以获得通过以往的PCR法无法扩增的例如50kb以上、60kb以上、70kb以上、80kb以上、90kb以上、100kb以上、101kb以上、183kb以上、200kb以上、205kb以上、300kb以上、500kb以上、1000kb以上、或2000kb以上大小的有改变的DNA。另一方面，导入缺失、替换或添加的DNA的大小的上限没有特别限定，例如，可以设为10000kb左右。

I-1.工序(1)

本发明的方法中的工序(1)是在无细胞体系中改变DNA的工序。“无细胞体系”是不直接使用大肠杆菌等细胞，代之以利用存在于大肠杆菌等各细胞内的酶等的体系。本发明中，DNA的“改变”的意思是，DNA链上的某核苷酸被其他核苷酸替换、DNA链上的1个以上核苷酸的缺失、在DNA链上的核苷酸间有1个以上核苷酸的插入、或DNA链末端1个以上核苷酸的添加。本说明书中，将核苷酸的插入和添加统称为“添加”。此外，添加也包括在1条DNA片段上连接其他DNA片段。

缺失、替换或添加的核苷酸的数量只要是1个以上则可以为任意的数量。非限定性地，优选为1个核苷酸以上、2个核苷酸以上、3个核苷酸以上、4个核苷酸以上、5个核苷酸以上、8个核苷酸以上、10个核苷酸以上、12个核苷酸以上、15个核苷酸以上、18个核苷酸以上、20个核苷酸以上。此外，缺失、替换或添加的核苷酸的数量的上限可以根据模板DNA的大小的不同而不同，例如可以为5000个核苷酸以下、4000个核苷酸以下、3000个核苷酸以下、2000个核苷酸以下、1000个核苷酸以下、500个核苷酸以下、300个核苷酸以下、200个核苷酸以下、150个核苷酸以下、120个核苷酸以下、100个核苷酸以下、80个核苷酸以下、70个核苷酸以下、50个核苷酸以下、30个核苷酸以下。根据本发明的方法，例如，也可以对于模板DNA进行1个以上基因整体的缺失、替换或添加。还可以同时在1条DNA中的2处以上有核苷酸的缺失、替换或添加。

为了在无细胞体系中改变DNA，可以没有特别限制地利用本技术领域公知的位置特异性突变导入技术。此外，还可以利用RA法(参照专利文献4)等连接多条DNA的技术。作为RA法，具体地，例如，首先制备含有2种以上DNA片段和具有RecA家族重组酶活性的蛋白的反应溶液。接下来，在前述反应溶液中使前述2种以上DNA片段在碱基序列相同的区域彼此或碱基序列互补的区域彼此互相连接，得到直链状或环状的DNA。

作为位置特异性突变导入技术，可列举例如通过在包含希望的突变(例如替换、缺失或添加)的寡聚核苷酸等单链DNA存在下进行DNA的复制反应，制作导入了该突变的双链DNA的方法等。本发明中使用的单链DNA例如可以通过化学合成等常规方法来制造。此外，也可以使用2条以上单链DNA，同时在1条DNA中的2处以上导入突变。需说明的是，本说明书中，将为了导入突变而使用的包含突变的单链DNA也称为突变导入用单链DNA。

例如，在突变导入用单链DNA存在下进行DNA的复制反应的方法中，以包含希望的突变的方式设计的单链DNA在模板DNA在复制反应中露出的单链区域退火，插入互补链中。以得到的双链DNA为模板，通过进一步进行DNA复制反应，得到在两条链中包含突变的双链DNA。

DNA复制反应可以使用在工序(2)的说明中列举的、用于在无细胞体系中扩增DNA的技术。优选的实施方式中，通过将DNA复制反应设为与后述工序(2)中的扩增反应为同一反应，还能够使工序(1)的突变导入与工序(2)的DNA扩增结合(日文：共役)进行。通过使无细胞体系中的突变导入与DNA扩增结合进行，可以通过一步反应进行向DNA的突变导入与扩增。迄今为止，在无细胞体系中的DNA复制反应、特别是RCR法中可以使包含突变的单链DNA插入DNA而导入位置特异性突变是未知的。

以往的使用引物的DNA扩增方法中，引物规定了扩增区域，如果在反应体系中补加突变导入用单链DNA，则其也可作为疑似引物发挥功能。结果，DNA链也会从包含突变的单链DNA合成，在该DNA链与从本来的引物进行至包含突变的单链DNA前面的DNA合成链之间存在缺口，无法获得全长目的产物。为了将缺口连接，有必要使包含突变的单链DNA的5’末端磷酸化、使连接酶发挥作用，从而工序增加。因此，本发明的方法中使用突变导入用单链DNA的情况下，DNA复制反应优选使用RCR法等不用引物的DNA扩增技术来进行。

位点特异性突变导入中使用的单链DNA的长度只要是在DNA复制反应条件下该单链DNA可与目标部位杂交，就没有特别限定。可以根据DNA复制反应中使用的方法适当设定，例如，可以设为10个碱基以上、15个碱基以上、20个碱基以上、30个碱基以上、40个碱基以上、50个碱基以上、或60个碱基以上、且为5000个碱基以下、4000个碱基以下、3000个碱基以下、2000个碱基以下、1000个碱基以下、500个碱基以下、100个碱基以下、80个碱基以下、75个碱基以下、70个碱基以下、或65个碱基以下。突变导入用单链DNA的长度例如可以设为40个碱基～75个碱基、50个碱基～70个碱基、或55个碱基～65个碱基。需说明的是，突变导入用单链DNA与目标部位杂交的情况下，因为突变导入用单链DNA的序列与目标部位的序列不完全一致，所以只要突变导入用单链DNA的至少一部分区域与目标部位杂交即可。突变导入用单链DNA优选两个末端与模板DNA的目标部位退火。与模板DNA退火的长度可以根据单链DNA长度的不同而不同，例如，可以为距离末端5个碱基以上、10个碱基以上、20个碱基以上、30个碱基以上、40个碱基以上、50个碱基以上、60个碱基以上、或100个碱基以上。

关于突变导入用单链DNA在反应体系内的浓度，只要DNA复制反应可以进行，就没有特别限定。可以根据DNA复制反应中使用的方法适当设定，例如，相对于DNA复制反应溶液的总体积，可以设为0.1μM(μmol/L)以上、0.15μM以上、0.2μM以上、0.25μM以上、或0.3μM以上、且为3μM以下、2.5μM以下、2.0μM以下、1.5μM以下、1.0μM以下、或0.6μM以下。使用RCR法作为DNA复制反应的情况下，突变导入用单链DNA在反应体系内的浓度例如相对于DNA复制反应溶液的总体积可以设为0.1μM～1.5μM、0.15μM～1.0μM、0.2μM～0.6μM、或0.3μM～0.6μM。

关于将多条DNA连接的技术，在本技术领域中，已知有各种技术。本发明的一个方式中，可以利用重组组装(Recombination Assembly)法(以下的RA法。参照专利文献4。)将多条DNA连接。

以下对通过RA法将多条DNA连接的实施方式进行说明。

＜RA法＞

RA法是，使具有互相碱基序列相同的区域(以下有时简单地称为“同源区域”。)或互相碱基序列互补的区域(以下有时简单地称为“互补区域”。)的DNA片段彼此在同源区域彼此或互补区域彼此互相连接，从而产生直链状或环状DNA的方法。RA法是在RecA家族重组酶蛋白存在下进行连接反应的，因此连接效率非常优异。

需说明的是，本说明书中，“碱基序列相同”的意思是“碱基序列同一”，“碱基序列互补”的意思是“碱基序列是互相互补的”。

具体地，RA法中，制备含有2种以上DNA片段、以及具有RecA家族重组酶活性的蛋白(以下有时称为“RecA家族重组酶蛋白”。)的反应溶液，在前述反应溶液中使前述2种以上DNA片段在碱基序列相同的区域彼此或互补区域互相连接。利用该方法，得到直链状或环状DNA。需说明的是，下文中，有时将2个以上DNA片段连接而成的直链状或环状的DNA称为“连接体”。

RA法中，连接而成的DNA片段可以为直链状双链DNA片段，也可以为单链DNA片段。即，可以使直链状双链DNA片段彼此连接，可以使直链状双链DNA片段与单链DNA片段连接，也可以使单链DNA片段彼此连接。还可以使1种以上直链状双链DNA片段与1种以上单链DNA片段连接。使直链状双链DNA片段彼此或直链状双链DNA片段与单链DNA片段连接的情况下，两者在同源区域互相连接。使单链DNA片段彼此连接的情况下，两者在互补区域互相连接。

RA法中连接的DNA片段的至少1种为直链状双链DNA片段的情况下，前述反应溶液进一步含有核酸外切酶。

通过RA法使直链状双链DNA片段彼此连接的情况下，首先，3’→5’核酸外切酶作用于具有同源区域的第一直链状双链DNA片段和第二直链状双链DNA片段，使同源区域形成单链。RecA家族重组酶蛋白作用于该呈单链的同源区域，通过互相互补的同源区域彼此结合，从而第一直链状双链DNA片段与第二直链状双链DNA片段连接。3’→5’核酸外切酶对DNA链的切割可以仅对第一直链状双链DNA片段和第二直链状双链DNA片段中的任一方进行。例如，呈单链状态的第一直链状双链DNA片段的同源区域在RecA家族重组酶蛋白存在下作用于双链状态的第二直链状双链DNA片段的同源区域，而两者连接。

RA法中，使直链状双链DNA片段彼此或直链状双链DNA片段与单链DNA片段连接的情况下，首先用核酸外切酶对双链DNA片段进行切割，使同源区域单链化，进一步在RecA家族重组酶蛋白存在下进行连接反应，因此连接效率非常优异。因此，RA法中，能够通过一步反应使多个直链状双链DNA片段连接，这在以往是非常困难的。

RA法中，使单链DNA片段彼此连接的情况下，由于RecA家族重组酶蛋白迅速在各单链DNA片段上形成纤丝，利用核酸外切酶进行的消化受到抑制。然后，通过该RecA家族重组酶蛋白的作用，互相互补的同源区域彼此结合，从而单链DNA片段彼此连接。

通过RA法连接的DNA片段的数量可以为2个(2个片段)以上，例如4个(4个片段)以上、5个(5个片段)以上、7个(7个片段)以上、10个(10个片段)以上、20个(20个片段)以上。通过RA法连接的DNA片段的数量没有特别的上限，例如，可以将100个(100个片段)以下的数量连接。RA法中，通过对反应条件等进行优化，例如也可以将50个片段左右的直链状双链DNA片段连接。需说明的是，RA法中连接的DNA片段可以是将全部为不同种的DNA片段彼此连接，也可以将同种DNA片段以包含2个片段以上的方式连接。

RA法中连接的2种以上DNA片段分别包含用于与其他DNA片段中的至少1种连接的同源区域或互补区域。RA法中，使直链状双链DNA片段彼此或直链状双链DNA片段与单链DNA片段连接的情况下，首先，用核酸外切酶对直链状双链DNA片段中的单链进行切割，使同源区域呈单链状态。因此，优选同源区域存在于直链状双链DNA片段的末端，但也可以在末端附近。例如，同源区域的端部中直链状双链DNA片段的末端侧的碱基优选距离该末端在300个碱基以内，更优选在100个碱基以内，进一步优选在30个碱基以内，更进一步优选在10个碱基以内。另一方面，使单链DNA片段彼此连接的情况下，由于RecA家族重组酶蛋白的纤丝，利用核酸外切酶进行的消化受到抑制，因此互补区域可以存在于单链DNA片段的任意部位。

同源区域或互补区域的碱基序列在连接的全部DNA片段中可以设为同一碱基序列，为了按希望的顺序连接，优选连接的DNA片段的每个种类分别设为不同碱基序列。例如，为了使双链DNA片段A、双链DNA片段B和双链DNA片段C按该顺序连接，在双链DNA片段A的下游末端和双链DNA片段B的上游末端设置同源区域a，在双链DNA片段B的下游末端和双链DNA片段C的上游末端设置同源区域b。由此，双链DNA片段A与双链DNA片段B通过同源区域a连接，双链DNA片段B与双链DNA片段C通过同源区域b连接，可以获得双链DNA片段A、双链DNA片段B和双链DNA片段C按该顺序连接的直链状的DNA。这种情况下，通过进一步在双链DNA片段C的下游末端和双链DNA片段A的上游末端设置同源区域c，双链DNA片段A与双链DNA片段B通过同源区域a连接，双链DNA片段B与双链DNA片段C通过同源区域b连接，双链DNA片段C与双链DNA片段A通过同源区域c连接，可以获得双链DNA片段A、双链DNA片段B和双链DNA片段C按该顺序连接的环状的DNA。

同源区域和互补区域只要是在连接反应的反应溶液中单链彼此能够特异性杂交程度的碱基序列即可，碱基对长度、GC率等一般可以参考探针、引物的设计方法适当确定。一般而言，为了抑制非特异性杂交、使目的直链状双链DNA片段彼此正确连接，同源区域的碱基长度有必要为一定程度的长度，但如果同源区域的碱基对长度过长，则存在连接效率下降的担忧。RA法中，作为同源区域或互补区域的碱基对长度，优选为10个碱基对(bp)以上，更优选为15bp以上，进一步优选为20bp以上，特别优选为60bp以上。此外，作为该同源区域或互补区域的碱基对长度，优选为500bp以下，更优选为300bp以下，进一步优选为200bp以下。

RA法中，互相连接的DNA片段的长度没有特别限定，例如，为直链状双链DNA片段的情况下，优选为50bp以上，更优选为100bp以上，进一步优选为200bp以上。为单链DNA片段的情况下，优选为50b以上，更优选为100b以上，进一步优选为200b以上。RA法中也可以连接325kbp的双链DNA片段。此外，连接的DNA片段的长度可以每个种类是不同的。

RA法中，互相连接的直链状双链DNA片段只要同源区域的整个区域或其一部分区域是两条单链DNA杂交的双链结构即可。即，该直链状双链DNA片段可以为没有间隙、缺口的完整直链状双链DNA片段，也可以为1处或多处为单链结构的直链状DNA片段。例如，连接的直链状双链DNA片段可以为平滑末端，也可以为粘性末端。通过RA法，也能够使平滑末端的直链状双链DNA片段与粘性末端的直链状双链DNA片段连接。

反应溶液内所含的各DNA片段的摩尔比优选与构成目的连接体的各DNA片段的分子数之比一致。通过使连接反应开始时反应体系内DNA片段的分子数一致，能够更高效地进行连接反应。例如，使全部为不同种的DNA片段彼此连接的情况下，优选反应溶液所含的各DNA片段的摩尔浓度彼此相等。

反应溶液内所含的DNA片段的总量没有特别限定。从容易获得充分量的连接体出发，在连接反应开始的时刻，反应溶液内所含的DNA片段的总浓度相对于反应溶液的总体积优选为0.01nM(nmol/L)以上，更优选为0.1nM以上，进一步优选为0.3nM以上，特别优选为5.09nM以上，最优选为6.7nM以上。从连接效率更高、适合多片段的连接出发，在连接反应开始的时刻，反应溶液内所含的DNA片段的总浓度优选为100nM以下，更优选为96.027nM以下，进一步优选为50nM以下，特别优选为25nM以下，最优选为20nM以下。

RA法中，作为通过连接反应得到的连接体的大小没有特别限定。作为得到的连接体的大小，例如优选为1kb(1000个碱基长度)以上，更优选为5kb以上，进一步优选为10kb以上，特别优选为13kb以上，最优选为20kb以上。利用RA法，还能够获得长度183kb以上、优选为208kb以上、更优选为300kb以上、进一步优选为500kb以上、特别优选为2000kb以上的连接体。另一方面，通过连接反应得到的连接体的大小的上限没有特别限定，例如，可以设为10000kb左右。

RA法中使用的核酸外切酶是从直链状DNA的3’末端或5’末端开始依次进行水解的酶。作为RA法中使用的核酸外切酶，只要是具有从直链状DNA的3’末端或5’末端开始依次进行水解的酶活性的酶，则对其种类、生物学来源没有特别限制。例如，作为从3’末端开始依次进行水解的酶(3’→5’核酸外切酶)，可列举核酸外切酶III家族型的AP(apurinic/apyrimidinic，无嘌呤无嘧啶)核酸内切酶等直链状双链DNA特异性3’→5’核酸外切酶和DnaQ超家族蛋白等单链DNA特异性3’→5’核酸外切酶。作为核酸外切酶III家族型的AP核酸内切酶，可列举例如核酸外切酶III(大肠杆菌来源)、ExoA(核酸外切酶III的枯草芽孢杆菌同系物)、Mth212(核酸外切酶III的古细菌同系物)、AP核酸内切酶I(核酸外切酶III的人同系物)。作为DnaQ超家族蛋白，可列举例如核酸外切酶I(大肠杆菌来源)、核酸外切酶T(RNase T)、核酸外切酶X、DNA聚合酶IIIε亚基(DNA polymerase III epsilon subunit)、DNA聚合酶I、DNA聚合酶II、T7DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶5、Phi29DNA聚合酶、核糖核酸酶III(RNase D)、寡聚核糖核酸酶(ORN)等。作为从5’末端开始依次进行水解的酶(5’→3’核酸外切酶)，可以使用λ核酸外切酶、核酸外切酶VIII、T5核酸外切酶、T7核酸外切酶和RecJ核酸外切酶等。

作为RA法中使用的核酸外切酶，从直链状双链DNA片段的切割的持续性与RecA家族重组酶蛋白存在下的连接效率的平衡良好一点出发，3’→5’核酸外切酶是优选的。其中，更优选为直链状双链DNA特异性3’→5’核酸外切酶，进一步优选为核酸外切酶III家族型的AP核酸内切酶，特别优选为核酸外切酶III。

作为RA法中反应溶液内所含的核酸外切酶，优选为直链状双链DNA特异性3’→5’核酸外切酶和单链DNA特异性3’→5’核酸外切酶两者。通过在直链状双链DNA特异性3’→5’核酸外切酶中组合单链DNA特异性3’→5’核酸外切酶，从而与单独使用直链状双链DNA特异性3’→5’核酸外切酶时相比，能够进一步改善连接效率。通过并用两种3’→5’核酸外切酶连接效率得以改善的理由尚不明确，推测是因为，直链状双链DNA特异性3’→5’核酸外切酶很多情况下很难以3’突出末端为目标，该3’突出末端被单链DNA特异性3’→5’核酸外切酶消化，结果，促进了利用直链状双链DNA特异性3’→5’核酸外切酶和RecA进行的连接反应。此外，连接的直链状DNA片段为平滑末端、5’突出末端时，通过单链DNA特异性3’→5’核酸外切酶的并用，连接效率也得以改善，推测这是因为，由直链状双链DNA特异性3’→5’核酸外切酶和RecA形成的连接体中次生形成的3’突端被单链DNA特异性3’核酸外切酶消化，结果，连接效率进一步改善。

RA法中，作为进行连接反应的反应溶液中核酸外切酶的浓度，在连接反应开始的时刻，例如相对于反应溶液的总体积优选为1～1000mU/μL，更优选为5～1000mU/μL，进一步优选为5～500mU/μL，特别优选为10～150mU/μL，最优选为80～150mU/μL。特别在核酸外切酶为直链状双链DNA特异性3’→5’核酸外切酶的情况下，在连接反应开始的时刻，反应溶液中直链状双链DNA特异性3’→5’核酸外切酶的浓度例如相对于反应溶液的总体积优选为5mU/μL～500mU/μL，更优选为5mU/μL～250mU/μL，进一步优选为5mU/μL～150mU/μL，特别优选为10mU/μL～150mU/μL，最优选为80～150mU/μL。此外，核酸外切酶为直链状单链DNA特异性3’→5’核酸外切酶的情况下，在连接反应开始的时刻，反应溶液中直链状单链DNA特异性3’→5’核酸外切酶的浓度相对于反应溶液的总体积优选为1mU/μL～1000mU/μL，更优选为100mU/μL～1000mU/μL，进一步优选为200mU/μL～1000mU/μL。并用直链状双链DNA特异性3’→5’核酸外切酶和单链DNA特异性3’→5’核酸外切酶的情况下，在连接反应开始的时刻，反应溶液中各核酸外切酶的浓度可以分别设为前述各核酸外切酶的优选浓度。

本说明书中，RecA家族重组酶蛋白的意思是，在单链状态或双链状态的DNA上重合，形成纤丝，对ATP(三磷酸腺苷)等三磷酸核苷具有水解活性，具有寻找同源区域进行同源重组的功能(RecA家族重组酶活性)的蛋白。作为RecA家族重组酶蛋白，可列举原核生物RecA同系物、细菌噬菌体RecA同系物、古细菌RecA同系物、真核生物RecA同系物等。作为原核生物RecA同系物，可列举：大肠杆菌RecA，嗜热栖热菌(Thermus thermophiles)、水生栖热菌(Thermus aquaticus)等栖热属(Thermus属)菌、热球菌属(Thermococcus属)菌、火球菌属(Pyrococcus属)菌、热袍菌属(Thermotoga属)菌等高度好热菌来源的RecA，耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)等放射线抗性菌来源的RecA等。作为细菌噬菌体RecA同系物，可列举T4噬菌体UvsX等；作为古细菌RecA同系物，可列举RadA等；作为真核生物RecA同系物，可列举Rad51和其旁系同源物、Dcm1等。需说明的是，这些RecA同系物的氨基酸序列可以从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等数据库获得。

作为RA法中使用的RecA家族重组酶蛋白，可以为野生型蛋白，也可以为在野生型蛋白中导入了1～30个氨基酸的缺失、添加或替换的突变的、保持RecA家族重组酶活性的突变体。作为该突变体，可列举导入增强了野生型蛋白中对同源区域进行搜索的功能的氨基酸替换突变的突变体、在野生型蛋白的N末端或C末端添加有各种标签的突变体、提高了耐热性的突变体(国际公开第2016/013592号)等。作为该标签，例如可以使用His标签、HA(hemagglutinin，血凝素)标签、Myc标签和Flag标签等重组蛋白的表达或纯化中通用的标签。需说明的是，野生型RecA家族重组酶蛋白的意思是包含与从自然界分离到的生物中保持的RecA家族重组酶蛋白的氨基酸序列相同的氨基酸序列的蛋白。

作为RA法中使用的RecA家族重组酶蛋白，保持RecA家族重组酶活性的突变体是优选的。作为该突变体，可列举例如将大肠杆菌RecA第203位的氨基酸残基苯丙氨酸替换为色氨酸的F203W突变体、将各种RecA同系物中相当于大肠杆菌RecA第203位的苯丙氨酸的苯丙氨酸替换为色氨酸的突变体。

RA法中，进行连接反应的反应溶液中RecA家族重组酶蛋白的量没有特别限定。RA法中，作为进行连接反应的反应溶液中RecA家族重组酶蛋白的浓度，在连接反应开始的时刻，例如相对于反应溶液的总体积优选为0.01μM～100μM(μmol/L)，更优选为0.1μM～100μM，进一步优选为0.1μM～50μM，更进一步优选为0.5μM～10μM，特别优选为1.0μM～5.0μM。

RecA家族重组酶蛋白为了发挥RecA家族重组酶活性，需要三磷酸核苷或三磷酸脱氧核苷。因此，本发明中进行连接反应的反应溶液含有三磷酸核苷和三磷酸脱氧核苷中的至少一方。RA法中，作为连接反应的反应溶液中含有的三磷酸核苷，优选使用选自由ATP、GTP(三磷酸鸟苷)、CTP(三磷酸胞苷)、UTP(三磷酸尿苷)、m5UTP(三磷酸5-甲基尿苷)组成的组的1种以上，特别优选使用ATP。RA法中，作为连接反应的反应溶液中所含有的三磷酸脱氧核苷，优选使用选自由dATP(三磷酸脱氧腺苷)、dGTP(三磷酸脱氧鸟苷)、dCTP(三磷酸脱氧胞苷)和dTTP(三磷酸脱氧胸苷)组成的组的1种以上，特别优选使用dATP。关于反应溶液所含的三磷酸核苷和三磷酸脱氧核苷的总量，只要是足以使RecA家族重组酶蛋白发挥RecA家族重组酶活性的量，就没有特别限定。RA法中，作为进行连接反应的反应溶液中三磷酸核苷浓度或三磷酸脱氧核苷浓度，在连接反应开始的时刻，例如相对于反应溶液的总体积优选为1μM(μmol/L)以上，更优选为10μM以上，进一步优选为30μM以上，特别优选为100μM以上。另一方面，反应溶液的三磷酸核苷浓度过高的情况下，存在多片段的连接效率反而下降的担忧。因此，在连接反应开始的时刻，作为反应溶液的三磷酸核苷浓度或三磷酸脱氧核苷浓度，相对于反应溶液的总体积，优选为1000μM以下，更优选为500μM以下，进一步优选为300μM以下。

为了使RecA家族重组酶蛋白发挥RecA家族重组酶活性，并且为了使核酸外切酶发挥核酸外切酶活性，镁离子(Mg

关于RA法中进行连接反应的反应溶液的镁离子源浓度，只要是能够使RecA家族重组酶蛋白发挥RecA家族重组酶活性、且能够使核酸外切酶发挥核酸外切酶活性的浓度，就没有特别限定。在连接反应开始的时刻，作为反应溶液的镁离子源浓度，例如相对于反应溶液的总体积，优选为0.5mM(mmol/L)以上，更优选为1mM以上。另一方面，反应溶液的镁离子源浓度过高的情况下，核酸外切酶活性变得过强，存在多片段的连接效率反而下降的担忧。因此，在连接反应开始的时刻，作为反应溶液的镁离子源浓度，例如相对于反应溶液的总体积优选为20mM以下，更优选为15mM以下，进一步优选为12mM以下，更进一步优选为10mM以下。

RA法中，进行连接反应的反应溶液例如通过在缓冲液中添加DNA片段、RecA家族重组酶蛋白、核酸外切酶、三磷酸核苷和三磷酸脱氧核苷中的至少一方、以及镁离子源来制备。作为该缓冲液，只要是适合在pH7～9、优选为pH8使用的缓冲液，就没有特别限制。可列举例如Tris-HCl、Tris-乙酸(Tris-OAc)、Hepes-KOH、磷酸缓冲液、MOPS-NaOH、Tricine-HCl等。优选的缓冲液为Tris-HCl或Tris-OAc。本领域技术人员可以适当选择缓冲液的浓度，没有特别限定，为Tris-HCl或Tris-OAc的情况下，例如相对于反应溶液的总体积可以选择10mM(mmol/L)～100mM、优选为10mM～50mM、更优选为20mM的浓度。

RA法中，进行连接反应的反应溶液中优选除了含有DNA片段、RecA家族重组酶蛋白、核酸外切酶、三磷酸核苷和三磷酸脱氧核苷中的至少一方以及镁离子源以外还进一步含有三磷酸核苷或三磷酸脱氧核苷的再生酶与其底物。通过能够在反应溶液中使三磷酸核苷或三磷酸脱氧核苷再生，能够使大量DNA片段更高效地连接。作为用于使三磷酸核苷或三磷酸脱氧核苷再生的再生酶与其底物的组合，可列举肌酸激酶与磷酸肌酸的组合、丙酮酸激酶与磷酸烯醇丙酮酸的组合、乙酸激酶与乙酰磷酸的组合、聚磷酸激酶与聚磷酸的组合、核苷二磷酸激酶与三磷酸核苷的组合。作为核苷二磷酸激酶的底物(磷酸供应源)的三磷酸核苷可以为ATP、GTP、CTP、UTP中的任一种。此外，作为再生酶，可列举肌激酶。

RA法中，关于进行连接反应的反应溶液中三磷酸核苷再生酶及其底物的浓度，只要是在该反应溶液中进行连接反应时三磷酸核苷可以再生的充分的浓度，就没有特别限定。例如，使用肌酸激酶和磷酸肌酸的情况下，相对于反应溶液的总体积，可以将本发明中进行连接反应的反应溶液中含有的肌酸激酶的浓度优选设为1ng/μL～1000ng/μL、更优选设为5ng/μL～1000ng/μL、进一步优选设为5ng/μL～500ng/μL、特别优选设为5ng/μL～250ng/μL、最优选设为20ng/μL～250ng/μL；相对于反应溶液的总体积，可以将磷酸肌酸的浓度优选设为0.4mM～20mM(mmol/L)、更优选设为0.4mM～10mM、进一步优选设为1mM～7mM、特别优选设为4mM～7mM。

将多个片段按目的顺序连接的情况下，优选同源区域或互补区域的碱基序列在各个连接的DNA片段的组合中是不同的。但在同一温度条件下，G(鸟嘌呤碱基)和C(胞嘧啶碱基)含有率高的同源区域容易在单链中形成二级结构，而在A(腺嘌呤碱基)和T(胸腺嘧啶碱基)含有率高的同源区域，杂交效率降低，因此存在连接效率也降低的担忧。通过抑制单链DNA二级结构的形成、促进特异性杂交，能够促进DNA片段的连接。

因此，RA法中，优选在进行连接反应的反应溶液中添加抑制单链DNA二级结构的形成、促进特异性杂交的物质。作为该物质，可列举二甲基亚砜(DMSO)、四甲基氯化铵(TMAC)。DMSO具有抑制富GC的碱基对二级结构的形成的作用。TMAC具有促进特异性杂交的作用。RA法中，进行连接反应的反应溶液中含有抑制单链DNA二级结构的形成、促进特异性杂交的物质的情况下，关于该物质的浓度，只要是可获得该物质带来的DNA片段连接促进效果的浓度，就没有特别限定。例如，使用DMSO作为该物质的情况下，RA法中，作为进行连接反应的反应溶液中所含有的DMSO的浓度，相对于反应溶液的总体积，优选为5体积(v/v)％～30体积(v/v)％，更优选为8体积％～25体积％，进一步优选为8体积％～20体积％。使用TMAC作为该物质的情况下，RA法中，作为进行连接反应的反应溶液中含有的TMAC的浓度，相对于反应溶液的总体积，优选为60mM～300mM，更优选为100mM～250mM，进一步优选为100mM～200mM，特别优选为150mM。

RA法中，优选在进行连接反应的反应溶液中进一步添加具有高分子混合效果的物质。高分子混合效果可以增强DNA分子彼此的相互作用、促进DNA片段的连接。作为该物质，可列举聚乙二醇(PEG)200～20000、聚乙烯醇(PVA)200～20000、葡聚糖40～70、Ficoll 70、牛血清白蛋白(BSA)。RA法中，进行连接反应的反应溶液中含有具有高分子混合效果的物质的情况下，关于该物质的浓度，只要是可获得该物质带来的DNA片段连接促进效果的浓度，就没有特别限定。例如，使用PEG8000作为该物质的情况下，RA法中，作为进行连接反应的反应溶液中含有的PEG8000的浓度，相对于反应溶液的总质量，优选为2质量(w/w)％～20质量(w/w)％，更优选为2质量％～10质量％，进一步优选为4质量％～6质量％。

RA法中，进行连接反应的反应溶液中可以进一步含有碱金属离子源。碱金属离子源是在反应溶液中产生碱金属离子的物质。RA法中，作为进行连接反应的反应溶液中所含有的碱金属离子，钠离子(Na

RA法中，进行连接反应的反应溶液中可以进一步含有还原剂。作为还原剂，可列举例如二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇(2-巯基乙醇)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)和谷胱甘肽。优选的还原剂为DTT。反应溶液中，相对于反应溶液的总体积，还原剂可以含有1.0mM(mmol/L)～15.0mM(mmol/L)、优选含有2.0mM～10.0mM、更优选含有4.0mM～10.0mM。

RA法中，连接反应可以通过下述方法进行：将使缓冲液中含有2种以上DNA片段、RecA家族重组酶蛋白、三磷酸核苷、镁离子源、并根据需要含有选自由核酸外切酶、三磷酸核苷再生酶及其底物的组合、抑制单链DNA二级结构的形成而促进特异性杂交的物质、具有高分子混合效果的物质、碱金属离子源和还原剂组成的组的1种以上而制备的反应溶液，在该反应溶液中的RecA家族重组酶蛋白和核酸外切酶可发挥各自的酶活性的温度等温条件下，温育规定时间。作为连接反应的反应温度，优选在25℃～48℃的温度范围内，更优选在27℃～45℃的温度范围内。特别是同源区域或互补区域的长度为50个碱基以上的情况下，连接反应的反应温度优选在30℃～45℃的温度范围内，更优选在37℃～45℃的温度范围内，进一步优选在40℃～43℃的温度范围内，特别优选为42℃。另一方面，同源区域或互补区域的长度为50个碱基以下的情况下，连接反应的反应温度优选在27℃～43℃的温度范围内，更优选在27℃～37℃的温度范围内，进一步优选在27℃～33℃的温度范围内。需说明的是，关于RA法，“等温条件下”的意思是，保持在相对于反应中设定的温度±3℃或±1℃的温度范围内。连接反应的反应时间没有特别限定，例如，可以设为15分钟～6小时，优选设为15分钟～3小时，更优选设为1小时～3小时。

通过连接反应得到的连接体(直链状或环状的DNA)中存在间隙、缺口。间隙是双链DNA中缺少1个或多个连续的核苷酸的状态，缺口是双链DNA中相邻核苷酸间的磷酸二酯键被切断的状态。因此，RA法中，优选在连接反应后用间隙修复酶群和dNTP对得到的连接体中的间隙和缺口进行修复。通过对间隙和缺口进行修复，可以使连接体形成完整的双链DNA。

具体地，通过在连接反应后的反应溶液中添加间隙修复酶群和dNTP，在间隙修复酶群可发挥酶活性的温度等温条件下温育规定时间，可以对连接体的间隙和缺口进行修复。组成间隙修复酶群的酶只要是能够修复双链DNA的间隙和缺口的酶群，则对其种类、生物学来源没有特别限制。作为间隙修复酶群，例如可以组合使用具有DNA聚合酶活性的酶和具有DNA连接酶活性的酶。使用大肠杆菌来源的DNA连接酶作为DNA连接酶的情况下，在反应溶液中，相对于反应溶液的总体积在0.01mM～1.0mM(mmol/L)、优选为0.25mM的范围内含有作为其辅因子的NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)。利用间隙修复酶群进行的处理例如在25℃～40℃、优选在30℃进行5分钟～120分钟、优选进行10分钟～60分钟、更优选进行30分钟。

dNTP是dATP、dGTP、dCTP和dTTP的统称。修复反应的反应开始时，反应溶液中所含的dNTP的浓度例如相对于反应溶液的总体积可以在0.01mM(mmol/L)～1mM(mmol/L)的范围，优选在0.05mM～1mM的范围，更优选在0.25mM～1mM的范围。

用于RA法的DNA片段的制备中，可以使用限制酶、人工DNA切割酶等序列特异性DNA切割酶。即使在模板DNA变长、难以选择适当的限制酶的情况下，利用人工DNA切割酶，也能够在希望的目标部位对DNA进行特异性切割。

本说明书中，人工DNA切割酶是特异性识别希望的序列并对DNA进行切割的、人工制作的酶，包括人工核酸酶和RNA引导性核酸酶。人工核酸酶是将与DNA特异性结合的结构域和切割DNA的结构域连接而成的人工酶，例如，已知有锌指核酸酶(ZFN)、TALE核酸酶(TALEN)等。此外，RNA引导性核酸酶是识别目标序列的被称为向导RNA(gRNA)的短RNA和切割DNA的酶的复合体，已知有CRISPR-Cas9等。本发明中，利用任意人工DNA切割酶均可，优选利用人工核酸酶或RNA引导性核酸酶，更优选利用CRISPR-Cas9。

RA法中使用人工DNA切割酶的一个实施方式中，工序(1)例如可以包括以下的工序：

(1-1)使人工DNA切割酶作用于DNA从而在目标部位对该DNA进行切割、制备至少一条直链DNA的工序，

(1-2)制备含有工序(1-1)中制备的直链DNA、1种以上DNA片段和具有RecA家族重组酶活性的蛋白的反应溶液的工序，以及

(1-3)使该直链DNA与该1种以上DNA片段在碱基序列相同的区域彼此或碱基序列互补的区域彼此互相连接，形成在模板DNA的目标部位插入有该1种以上DNA片段的DNA的工序。

工序(1-1)中用人工DNA切割酶处理的DNA(即模板DNA)可以为直链状也可以为环状。通过利用人工DNA切割酶，能够在希望的目标部位对模板DNA进行切割。工序(1-2)的1种以上DNA片段包含用于与工序(1-1)中制备的直链DNA在人工DNA切割酶产生的切割部位连接的同源区域或互补区域。通过同源区域或互补区域彼此连接，工序(1-3)中得到的连接后的DNA成为在切割部位对模板DNA插入了其他DNA序列的形式。关于工序(1-2)和(1-3)，可以与上述通常的RA法同样地进行。

另一实施方式中，本发明的工序(1)可以为通过In fusion法使多条DNA连接的工序。

In fusion法是使用具有识别各双链DNA片段末端15个碱基的同源序列使其融合的功能的In fusion酶进行连接反应的方法。具体地，首先，利用PCR，在连接的目的双链DNA片段的末端添加由同一碱基序列构成的同源区域。通过将两个末端添加有15个碱基的同源区域的2个双链DNA片段与In fusion酶混合温育而彼此连接。In fusion法的原理例如在核酸研究(Nucleic Acids Research),2007年第35卷第1期143-151中有说明。也可以使用由宝生物株式会社等出售的试剂来进行。

此外，另一实施方式中，本发明的工序(1)可以为通过Gibson Assembly法使多条DNA连接的工序。

Gibson Assembly法是下述方法：利用具有核酸外切酶活性的酶将第一DNA分子的远位区域和第二DNA分子的近位区域消化，使各同源区域(长度足以相互特异性杂交的序列同源性区域)形成单链状态后，使两者特异性退火将其连接，然后对间隙、缺口进行修复，从而得到完整的双链DNA连接体。即，Gibson Assembly法包括：利用核酸外切酶形成单链3’突出和片段间的退火，利用DNA聚合酶进行退火的片段间的间隙修复和利用DNA连接酶对缺口的修补。也可以使用由New England Biolabs公司等出售的试剂来进行。

I-2.工序(2)

本发明的方法中的工序(2)是在无细胞体系中扩增工序(1)中被改变的DNA的工序，该DNA在以20℃～80℃范围的温度温育的温度条件下扩增。其中，该DNA优选在等温温育或在以2个65℃以下的温度反复温育的温度循环下温育的温度条件下扩增，更优选在处于20℃～80℃范围内的一定的温度下温育或在以2个65℃以下的温度反复温育的温度循环下温育的温度条件下扩增。

为了在无细胞体系中扩增DNA，可以利用本技术领域公知的技术。本技术领域中，已知等温扩增DNA的各种技术(例如参照J.Li和J.Macdonald,生物传感器和生物电子学(Biosensors and Bioelectronics),第64卷第196-211页(2015))。一个方式中，可以利用Replication Cycle Reaction法(以下的RCR法。参照专利文献5～7)扩增DNA。通过RCR法进行工序(2)的情况下，模板DNA为环状DNA。

除了RCR以外，作为本发明中可使用的技术，例如可列举解旋酶依赖性扩增(Helicase-dependent amplification)(HDA)(Vincent,M.，Xu,Y.，Kong,H.，2004.EMBORep.5(8),795-800)、重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification)(RPA)(Piepenburg,O.，Williams,C.H.，Stemple,D.L.，Armes,N.A.，2006.PLoS.Biol.4(7),e204)、滚环扩增(Rolling circle amplification)(RCA)(Fire,A.，Xu,S.Q.，1995.Proc.Natl.Acad.Sci.92(10),4641-4645)、分枝扩增(Ramificationamplification)(RAM)(Zhang,D.Y.，Brandwein,M.，Hsuih,T.，Li,H.B.，2001.Mol.Diagn.6(2),141-150)、多重置换扩增(Multiple displacement amplifcation)(MDA)(Dean,F.B.，Nelson,J.R.，Giesler,T.L.，Lasken,R.S.，2001.Genome Res.11(6),1095-1099和Spits,C.，Le Caignec,C.，De Rycke,M.，Van Haute,L.，Van Steirteghem,A.，Liebaers,I.，Sermon,K.，2006.Nat.Protoc.1(4)，1965-1970)、环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermal amplification)(LAMP)(Notomi,T.，Okayama,H.，Masubuchi,H.，Yonekawa,T.，Watanabe,K.，Amino,N.，Hase,T.，2000.Nucleic Acids Res.28(12),E63)等。任一方法均可通过常规方法来进行。使用何种方法可以根据扩增的DNA的形状(直链状或环状)等适当选择。

工序(2)中，将导入缺失、替换或添加的DNA在等温温育的温度条件下扩增的情况下，作为等温条件，只要是DNA扩增反应或DNA复制反应能够进行的条件，就没有特别限制，例如为处于DNA聚合酶的最适温度中的一定的温度。作为等温条件，可列举例如20℃以上、25℃以上、或30℃以上的一定的温度和80℃以下、65℃以下、60℃以下、50℃以下、45℃以下、40℃以下、35℃以下、或33℃以下的一定的温度。此外，等温条件例如可以为处于20℃～80℃范围内的一定的温度、处于20℃～65℃的范围内的一定的温度、处于25℃～50℃的范围内的一定的温度、处于25℃～40℃的范围内的一定的温度、处于30℃～33℃的范围内的一定的温度、或30℃左右。本说明书中，“等温温育”、“在等温条件下保温”、“等温反应”等术语的意思是相对于反应中设定的温度保持在±7℃、±5℃、±3℃或±1℃的温度范围内。保温时间可以根据环状DNA的扩增产物的目的量适当设定，例如可以设为1小时～24小时、优选为18小时～21小时。

工序(2)中，将导入缺失、替换或添加的DNA在重复65℃以下的2个温度下的温育的温度循环下进行温育的温度条件下扩增的情况下，第一温度是可以开始环状DNA的复制的温度，第二温度是复制起始受到抑制、进行DNA的延伸反应的温度。第一温度可以为30℃以上、例如30℃～80℃、30℃～50℃、30℃～40℃、或37℃。第一温度下的温育没有特别限定，每个循环可以为10秒～10分钟，优选为1分钟。第二温度可以为27℃以下、例如10℃～27℃、16℃～25℃、或24℃。第二温度下的温育没有特别限定，优选根据扩增的环状DNA的长度来设定，例如，每个循环可以为每1000个碱基位1秒～10秒。温度循环的循环数没有特别限定，可以为10个循环～50个循环、20个循环～45个循环、25个循环～45个循环、40个循环。

本发明的方法中，可以在工序(1)之后包括利用人工DNA切割酶对未导入缺失、替换或添加的DNA进行特异性切割的工序。如果未导入缺失、替换或添加的DNA被切割，则在上述DNA扩增技术中，该DNA不被扩增，因此能够大幅改善导入缺失、替换或添加的DNA的收率。一个实施方式中，可以使用切割不同序列的2种以上人工DNA切割酶。例如，工序(1)中使用2种以上模板DNA的情况下，可以使用对各模板DNA进行特异性切割的2种以上人工DNA切割酶。或者，在工序(1)中使用1种模板DNA导入了2处以上突变的情况下，可以使用对于各突变导入部位，对未导入突变的序列进行特异性切割的2种以上人工DNA切割酶。

其中，“对未导入缺失、替换或添加的DNA进行特异性切割”的意思是，切割未导入缺失、替换或添加的DNA而不切割导入了缺失、替换或添加的DNA。这样的人工DNA切割酶可以通过常规方法来制备。例如，使用CRISPR-Cas9作为人工DNA切割酶的情况下，通过以与包含缺失、替换或添加前的序列的区域结合的方式设计向导RNA，能够对未导入缺失、替换或添加的DNA进行特异性切割。

利用这样的人工DNA切割酶对于未导入缺失、替换或添加的DNA的特异性切割可以在工序(1)之后且在工序(2)之前进行。

此外，人工DNA切割酶通常容易由于热处理而失活，有时在PCR反应那样需要在94℃以上高温下温育的DNA扩增反应体系中无法发挥功能。本发明的方法中的工序(2)不包括在94℃以上的高温下的温育，因此能够在DNA扩增反应的同时，利用人工DNA切割酶进行处理。因此，优选的实施方式中，可以将工序(2)在特异性切割未导入缺失、替换或添加的DNA的人工DNA切割酶的存在下进行。这种情况下，能够不增加反应工序，大幅改善导入了缺失、替换或添加的DNA的收率。

以下，作为本发明的一个方式，对通过RCR法扩增DNA的实施方式进行说明。

＜RCR法＞

一个实施方式中，本发明的方法的工序(2)可以通过RCR法来进行。RCR法是包括以下工序的环状DNA扩增方法：

(2-1)制备含有(a)催化环状DNA的复制的第一酶群、(b)催化冈崎片段连接反应、合成形成环连体的2个姊妹环状DNA的第二酶群和(c)催化2个姊妹环状DNA的分离反应的第三酶群的反应溶液与在工序(1)中导入了缺失、替换或添加的环状DNA的反应混合物的工序，

(2-2)将工序(2-1)中制备的反应混合物等温、即在处于20℃～80℃范围内的一定的温度下温育、或在以2个65℃以下的温度反复温育的温度循环下温育的工序。

1.环状DNA

RCR法中，作为模板使用的环状DNA优选为双链。作为用作模板的环状DNA，可以例示微生物的环状染色体等天然环状DNA、在通过酶处理等对天然环状DNA进行切割而得的DNA等中连接另一DNA片段并使其环化的环状DNA、对在自然中以直链状存在的DNA进行环化处理而得的环状DNA、完全人工合成的环状DNA等。环状DNA可以包含复制起始蛋白可结合的复制起始序列，也可以不包含该序列，优选包含复制起始蛋白可结合的复制起始序列，更优选包含可与具有DnaA活性的酶结合的复制起始序列(oriC)。

复制起始序列和可与之结合的复制起始蛋白的组合在本技术领域是公知的(例如参照细胞(Cell)第54卷第7期第915-918页(1988))，本发明中，可以使用它们中的任一种。作为这样的组合的例子，可列举oriC与具有DnaA活性的酶(例如存在于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等细菌中的复制起始序列与DnaA蛋白)、pSC101的复制起始序列与pSC101 repA、P1的复制起始序列与P1 repA、F的复制起始序列与E蛋白、R1的复制起始序列与R1 repA、R6Koriγ与π蛋白、λ的复制起始序列与λO蛋白、

复制起始蛋白和复制起始序列可以基于NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等公共数据库中登记的序列信息获得。此外，复制起始序列也可以通过下述方法获得：克隆可与复制起始蛋白结合的DNA片段，对其碱基序列进行分析。

本发明中，作为模板使用的环状DNA可以为原本就包含复制起始序列的环状DNA，也可以为在原本不含复制起始序列的环状DNA中导入复制起始序列而得的DNA。

作为模板使用的环状DNA不含复制起始蛋白可结合的复制起始序列的情况下，通过DNA重组中间体(D-loop)的形成或转录中间体(R-loop)的形成，DNA的复制开始进行。

本发明中，作为模板使用的环状DNA可以根据目的包含卡那霉素、氨苄青霉素、四环素等抗性标记基因序列。

本发明中，作为模板使用的环状DNA可以是经过纯化的，也可以是含有环状DNA的菌体提取物等悬浮液的形态。此外，可以使用1种环状DNA作为模板，例如，也可以在1个试管内，使用DNA文库那样的多种环状DNA的混合物作为模板。

每个反应中使用的模板DNA的量没有特别限制，可以每个反应使用1分子环状DNA作为模板。

本发明中，作为模板使用的环状DNA的长度没有限制，例如可以设为1kb(1000个碱基长度)以上、5kb(5000个碱基长度)以上、8kb(8,000个碱基长度)以上、8.8kb(8,800个碱基长度)以上、9.5kb(9,500个碱基长度)以上、10kb(10,000个碱基长度)以上、50kb(50,000个碱基长度)以上、100kb(100,000个碱基长度)以上、101kb(101,000个碱基长度)以上、183kb(183,000个碱基长度)以上、200kb(200,000个碱基长度)以上、205kb(205,000个碱基长度)以上、500kb(500,000个碱基长度)以上、1000kb(1,000,000个碱基长度)以上、或2000kb(2,000,000个碱基长度)以上长度。另一方面，环状DNA长度的上限没有特别限定，例如，可以设为10000kb左右。

本发明中，可以使用上述环状DNA作为模板，将其扩增至少10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍或10000倍。

2.第一、第二和第三酶群

2-1.第一酶群

本说明书中，第一酶群的意思是催化环状DNA的复制的酶群。

2-1-1.环状DNA包含复制起始序列的情况

作为催化环状DNA的复制的第一酶群，例如可以使用Kaguni JM&KornbergA.Cell.1984,38:183-90中记载的酶群。具体地，作为第一酶群，可以例示以下：选自由复制起始蛋白(例如具有DnaA活性的酶)、1种以上拟核蛋白、具有DNA旋转酶活性的酶或酶群、单链DNA结合蛋白(single-strand binding protein(SSB))、具有DNA解旋酶活性的酶(例如具有DnaB型解旋酶活性的酶)、具有DNA解旋酶载体(loader)活性的酶、具有DNA引物酶活性的酶、具有DNA夹活性的酶和具有DNA聚合酶III*活性(从DNA聚合酶III全酶将夹除去后的蛋白)的酶或酶群组成的组的酶或酶群的1种以上、或者该酶或酶群的所有组合。

复制起始蛋白只要是对于存在于环状DNA中的复制起始序列具有起始子活性的蛋白，则对其生物学来源没有特别限制。此外，具有DnaA活性的酶只要是具有与作为大肠杆菌的起始子蛋白的DnaA同样的起始子活性的酶，则对其生物学来源没有特别限制，例如，可以适当使用大肠杆菌来源的DnaA。复制起始蛋白作为单体在反应溶液中，相对于反应溶液的总体积，可以在1nM(nmol/L)～10μM(μmol/L)的范围内含有，可以优选在1nM～5μM、1nM～3μM、1nM～1.5μM、1nM～1.0μM、1nM～500nM、50nM～200nM、50nM～150nM的范围内含有，可以更优选含有100nM，但不限定于此。

拟核蛋白是指拟核所含的蛋白。本发明中使用的1种以上拟核蛋白只要是具有与大肠杆菌的拟核蛋白同样的活性的酶，则对其生物学来源没有特别限制，例如，可以适当使用大肠杆菌来源的IHF即选自由IhfA和IhfB组成的组的1种以上复合体(异源二聚体或同源二聚体)、大肠杆菌来源的HU即hupA和hupB的复合体。大肠杆菌来源的IHF作为异源/同源二聚体在反应溶液中，相对于反应溶液的总体积，可以在5nM(nmol/L)～400nM的范围内含有，可以优选在5nM～200nM、5nM～100nM、5nM～50nM、10nM～50nM、10nM～40nM、10nM～30nM的范围内含有，可以更优选含有20nM，但不限定于此。在反应溶液中，大肠杆菌来源的HU可以在1nM～50nM的范围内含有，可以优选在5nM～50nM、5nM～25nM的范围内含有，但不限定于此。

作为具有DNA旋转酶活性的酶或酶群，只要是具有与大肠杆菌的DNA旋转酶同样的活性的酶，则对其生物学来源没有特别限制，例如，可以适当使用由大肠杆菌来源的GyrA和GyrB构成的复合体。由大肠杆菌来源的GyrA和GyrB构成的复合体作为异源四聚体在反应溶液中，相对于反应溶液的总体积，可以在20nM(nmol/L)～500nM的范围内含有，可以优选在20nM～400nM、20nM～300nM、20nM～200nM、50nM～200nM、50nM～100nM的范围内含有，可以更优选含有50nM，但不限定于此。

作为单链DNA结合蛋白(single-strand binding protein(SSB))，只要是具有与大肠杆菌的单链DNA结合蛋白同样的活性的酶，则对其生物学来源没有特别限制，例如，可以适当使用大肠杆菌来源的SSB。大肠杆菌来源的SSB作为同源四聚体在反应溶液中，相对于反应溶液的总体积，可以在20nM(nmol/L)～1000nM的范围内含有，可以优选在20nM～500nM、20nM～300nM、20nM～200nM、50nM～500nM、50nM～400nM、50nM～300nM、50nM～200nM、50nM～150nM、100nM～500nM、100nM～400nM的范围内含有，可以更优选含有400nM，但不限定于此。

作为具有DnaB型解旋酶活性的酶，只要是具有与大肠杆菌的DnaB同样的活性的酶，则对其生物学来源没有特别限制，例如，可以适当使用大肠杆菌来源的DnaB。大肠杆菌来源的DnaB作为同源六聚体在反应溶液中，相对于反应溶液的总体积，可以在5nM(nmol/L)～200nM的范围内含有，可以优选在5nM～100nM、5nM～50nM、5nM～30nM的范围内含有，可以更优选含有20nM，但不限定于此。

作为具有DNA解旋酶载体(loader)活性的酶，只要是具有与大肠杆菌的DnaC同样的活性的酶，则对其生物学来源没有特别限制，例如，可以适当使用大肠杆菌来源的DnaC。大肠杆菌来源的DnaC作为同源六聚体在反应溶液中，相对于反应溶液的总体积，可以在5nM(nmol/L)～200nM的范围内含有，可以优选在5nM～100nM、5nM～50nM、5nM～30nM的范围内含有，可以更优选含有20nM，但不限定于此。

作为具有DNA引物酶活性的酶，只要是具有与大肠杆菌的DnaG同样的活性的酶，则对其生物学来源没有特别限制，例如，可以适当使用大肠杆菌来源的DnaG。大肠杆菌来源的DnaG作为单体在反应溶液中，相对于反应溶液的总体积，可以在20nM(nmol/L)～1000nM的范围内含有，可以优选在20nM～800nM、50nM～800nM、100nM～800nM、200nM～800nM、250nM～800nM、250nM～500nM、300nM～500nM的范围内含有，可以更优选含有400nM，但不限定于此。

作为具有DNA夹活性的酶，只要是具有与大肠杆菌的DnaN同样的活性的酶，则对其生物学来源没有特别限制，例如，可以适当使用大肠杆菌来源的DnaN。大肠杆菌来源的DnaN作为同源二聚体在反应溶液中，相对于反应溶液的总体积，可以在10nM(nmol/L)～1000nM的范围内含有，可以优选在10nM～800nM、10nM～500nM、20nM～500nM、20nM～200nM、30nM～200nM、30nM～100nM的范围内含有，但不限定于此。

作为具有DNA聚合酶III*活性的酶或酶群，只要是具有与大肠杆菌的DNA聚合酶III*复合体同样的活性的酶或酶群，则对其生物学来源没有特别限制，例如，可以适当使用包含大肠杆菌来源的DnaX、HolA、HolB、HolC、HolD、DnaE、DnaQ和HolE中的任意个的酶群、优选为包含大肠杆菌来源的DnaX、HolA、HolB和DnaE的复合体的酶群、进一步优选为包含大肠杆菌来源的DnaX、HolA、HolB、HolC、HolD、DnaE、DnaQ和HolE的复合体的酶群。大肠杆菌来源的DNA聚合酶III*复合体作为异源多聚体在反应溶液中，相对于反应溶液的总体积，可以在2nM(nmol/L)～50nM(nmol/L)的范围内含有，可以优选在2nM～40nM、2nM～30nM、2nM～20nM、5nM～40nM、5nM～30nM、5nM～20nM的范围内含有，可以更优选含有5nM，但不限定于此。

2-1-2.环状DNA不含复制起始序列的情况

环状DNA不含复制起始序列、复制起始利用D-loop的情况下，作为第一酶群，例如可以使用重组酶(例如RecA或其同系物(例如T4噬菌体的UvsX))、在重组酶向DNA的导入中发挥功能的酶(例如RecO和RecR或它们的同系物(例如对于UvsX而言是UvsY)、在解旋酶向D-loop的导入中发挥功能的引发体蛋白群(例如PriA、PriB、PriC和DnaT)。

环状DNA不含复制起始序列、复制起始利用R-loop的情况下，作为第一酶群，例如可以使用RNA聚合酶、在解旋酶向R-loop的导入中发挥功能的引发体蛋白群(例如PriA、PriB、PriC和DnaT)。

2-2.第二酶群

本说明书中第二酶群的意思是催化冈崎片段连接反应、合成形成环连体的2个姊妹环状DNA的酶群。

本发明中，形成环连体的2个姊妹环状DNA是指通过DNA复制反应合成的2个环状DNA处于相连接的状态的化合物。

作为催化冈崎片段连接反应、合成形成环连体的2个姊妹环状DNA的第二酶群，可以例示例如选自由具有DNA聚合酶I活性的酶、具有DNA连接酶活性的酶和具有RNaseH活性的酶组成的组的1个以上的酶或这些酶的组合。

作为具有DNA聚合酶I活性的酶，只要是具有与大肠杆菌的DNA聚合酶I同样的活性的酶，则对其生物学来源没有特别限制，例如，可以适当使用大肠杆菌来源的DNA聚合酶I。大肠杆菌来源的DNA聚合酶I作为单体在反应溶液中，相对于反应溶液的总体积，可以在10nM(nmol/L)～200nM(nmol/L)的范围内含有，可以优选在20nM～200nM、20nM～150nM、20nM～100nM、40nM～150nM、40nM～100nM、40nM～80nM的范围内含有，可以更优选含有50nM，但不限定于此。

作为具有DNA连接酶活性的酶，只要是具有与大肠杆菌的DNA连接酶同样的活性的酶，则对其生物学来源没有特别限制，例如，可以适当使用大肠杆菌来源的DNA连接酶或T4噬菌体的DNA连接酶。大肠杆菌来源的DNA连接酶作为单体在反应溶液中，相对于反应溶液的总体积，可以在10nM(nmol/L)～200nM(nmol/L)的范围内含有，可以优选在15nM～200nM、20nM～200nM、20nM～150nM、20nM～100nM、20nM～80nM的范围内含有，可以更优选含有50nM，但不限定于此。

作为具有RNaseH活性的酶，只要是具有使RNA:DNA杂交的RNA链分解的活性的酶，则对其生物学来源没有特别限制，例如，可以适当使用大肠杆菌来源的RNaseH。大肠杆菌来源的RNaseH作为单体在反应溶液中，相对于反应溶液的总体积，可以在0.2nM(nmol/L)～200nM(nmol/L)的范围内含有，可以优选在0.2nM～200nM、0.2nM～100nM、0.2nM～50nM、1nM～200nM、1nM～100nM、1nM～50nM、10nM～50nM的范围内含有，可以更优选含有10nM，但不限定于此。

2-3.第三酶群

本说明书中，第三酶群的意思是催化2个姊妹环状DNA的分离反应的酶群。

作为催化2个姊妹环状DNA的分离反应的第三酶群，例如可以使用Peng H&MariansKJ.PNAS.1993,90:8571-8575中记载的酶群。具体地，作为第三酶群，可以例示选自由具有拓扑异构酶IV活性的酶、具有拓扑异构酶III活性的酶和具有RecQ型解旋酶活性的酶组成的组的1个以上的酶或该酶的组合。

作为具有拓扑异构酶III活性的酶，只要是具有与大肠杆菌的拓扑异构酶III同样的活性的酶，则对其生物学来源没有特别限制，例如，可以适当使用大肠杆菌来源的拓扑异构酶III。大肠杆菌来源的拓扑异构酶III作为单体在反应溶液中，相对于反应溶液的总体积，可以在20nM(nmol/L)～500nM(nmol/L)的范围内含有，可以优选在20nM～400nM、20nM～300nM、20nM～200nM、20nM～100nM、30nM～80nM的范围内含有，可以更优选含有50nM，但不限定于此。

作为具有RecQ型解旋酶活性的酶，只要是具有与大肠杆菌的RecQ同样的活性的酶，则对其生物学来源没有特别限制，例如，可以适当使用大肠杆菌来源的RecQ。大肠杆菌来源的RecQ作为单体在反应溶液中，相对于反应溶液的总体积，可以在20nM(nmol/L)～500nM(nmol/L)的范围内含有，可以优选在20nM～400nM、20nM～300nM、20nM～200nM、20nM～100nM、30nM～80nM的范围内含有，可以更优选含有50nM，但不限定于此。

作为具有拓扑异构酶IV活性的酶，只要是具有与大肠杆菌的拓扑异构酶IV同样的活性的酶，则对其生物学来源没有特别限制，例如，可以适当使用作为ParC与ParE的复合体的大肠杆菌来源的拓扑异构酶IV。大肠杆菌来源的拓扑异构酶IV作为异源四聚体在反应溶液中，相对于反应溶液的总体积，可以在0.1nM(nmol/L)～50nM(nmol/L)的范围内含有，可以优选在0.1nM～40nM、0.1nM～30nM、0.1nM～20nM、1nM～40nM、1nM～30nM、1nM～20nM、1nM～10nM、1nM～5nM的范围内含有，可以更优选含有5nM，但不限定于此。

上述第一、第二和第三酶群可以使用市售产品，也可以使用从微生物等提取并根据需要纯化而得的物质。酶从微生物的提取和纯化可以使用本领域技术人员可利用的方法适当实施。

使用上述所示大肠杆菌来源的酶以外的酶作为上述第一、第二和第三酶群的情况下，可以在相对于对上述大肠杆菌来源的酶确定的浓度范围，酶活单位相当的浓度范围内使用。

也可以将含有上述酶的无细胞蛋白表达体系的反应溶液直接与作为模板的环状DNA混合，形成用于环状DNA的复制或扩增的反应混合液。无细胞蛋白表达体系可以是以含有由与编码上述酶的基因的碱基序列互补的序列构成的RNA的总RNA(total RNA)、mRNA或in vitro转录产物等为模板RNA的无细胞翻译体系，也可以是以编码各酶的基因或包含编码各酶的基因的表达载体等为模板DNA的无细胞转录翻译体系。

以下，作为RCR法I～V，对通过RCR法扩增环状DNA的实施方式进行说明。需说明的是，RCR法I～V中，“可与具有DnaA活性的酶结合的复制起始序列”和“oriC”也可称为“复制起始序列”，“具有DnaA活性的酶”也可称为“可与复制起始序列结合的复制起始蛋白”。

＜RCR法I＞

一个实施方式中，本发明中的RCR法包括形成含有上述第一至第三酶群的反应溶液与作为模板的环状DNA的反应混合物的工序(参照专利文献5)。

含有第一至第三酶群的反应溶液的组成只要是DNA复制反应能够进行的组成，就没有特别限制，例如，可以使用在Tris盐酸缓冲液等缓冲液中添加有rNTP、dNTP、镁离子源、ATP源等的溶液中添加第一至第三酶群而得的溶液等。此外，上述反应溶液也可以进一步含有抑制副产物生成的成分等补加成分。作为具体的反应溶液，可以例示后述实施例中记载的溶液。

RCR法I进一步包括将上述反应混合物在等温条件下保温的工序。作为等温条件，只要是DNA复制反应能够进行的条件，就没有特别限制，例如，可以设为处于作为DNA聚合酶的最适温度的20～80℃的范围内的一定的温度，可以设为处于25℃～50℃的范围内的一定的温度，可以设为30℃～33℃左右。保温时间可以根据目的环状DNA的扩增产物的量适当设定，例如，可以设为1小时～24小时，也可以设为16小时～21小时。

RCR法I可以在将上述反应混合物在等温条件下保温的工序之后，包括根据目的对环状DNA的扩增产物进行纯化的工序。环状DNA的纯化可以使用本领域技术人员可利用的方法适当实施。

使用RCR法I扩增的环状DNA可以将反应后的反应混合物直接、或者适当纯化后用于转化等后续目的。

＜RCR法II＞

一个实施方式中，本发明中的RCR法包括以下的工序：

工序(II-1)：形成作为模板的环状DNA与反应溶液的反应混合物，所述反应溶液含有：

催化环状DNA的复制的第一酶群，

催化冈崎片段连接反应而合成形成环连体的2个姊妹环状DNA的第二酶群，

催化2个姊妹环状DNA的分离反应的第三酶群，

缓冲液，

ATP，

GTP、CTP和UTP，

dNTP，

镁离子源，和

碱金属离子源，

其中，该环状DNA包含可与具有DnaA活性的酶结合的复制起始序列(origin ofchromosome(oriC))(参照专利文献6)。

本实施方式中，本发明的方法在上述工序(II-1)之前可以进一步包括对反应溶液进行预温育的工序。即，本发明的方法可以包括以下的工序：

工序(II-1-1)：对反应溶液进行预温育，所述反应溶液含有：

催化环状DNA的复制的第一酶群，

催化冈崎片段连接反应而合成形成双环化合物的2个姐妹环状DNA的第二酶群，

催化2个姐妹环状DNA的分离反应的第三酶群，

缓冲液，

ATP，

GTP、CTP和UTP，

dNTP，

镁离子源，和

碱金属离子源；以及

工序(II-1-2)：形成该反应溶液与作为模板的环状DNA的反应混合物，其中，该环状DNA包含可与具有DnaA活性的酶结合的复制起始序列(origin of chromosome(oriC))。

预温育例如可以通过在0℃～40℃、10℃～40℃、15℃～37℃或16℃～30℃的范围内保温5分钟～60分钟、5分钟～45分钟、5分钟～30分钟、15分钟～60分钟、15分钟～45分钟、15分钟～30分钟来进行。预温育只要是反应溶液的温度保持在上述温度范围内，则在预温育中可以略有变动。

不受理论限制，RCR法II中，复制循环重复进行，环状DNA指数扩增。本发明的方法中，可以使用上述环状DNA为模板，将其扩增至少10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍或10000倍。

关于与反应溶液混合的环状DNA，如上述“1.环状DNA”一项中所述。每个反应中使用的模板DNA的量没有特别限制，例如，反应开始时，相对于反应溶液的总体积，可以以10ng/μL以下、5ng/μL以下、1ng/μL以下、0.8ng/μL以下、0.5ng/μL以下、0.3ng/μL以下的浓度存在于反应溶液中。另一方面，每个反应中使用的模板DNA的量的下限没有特别限定，例如，可以设为7.5fg/μL、0.67pg/μL、1pg/μL、10pg/μL、14pg/μL、50pg/μL或75pg/μL。进一步，也可以在反应开始时每个反应以1分子环状DNA为模板而存在，用于扩增。

反应溶液所含的缓冲液只要是适合在pH7～9、优选为pH8使用的缓冲液，就没有特别限制。可列举例如Tris-HCl、Tris-OAc、Hepes-KOH、磷酸缓冲液、MOPS-NaOH、Tricine-HCl等。优选的缓冲液为Tris-HCl或Tris-OAc。本领域技术人员可以适当选择缓冲液的浓度，没有特别限定，为Tris-HCl或Tris-OAc的情况下，例如，相对于反应溶液的总体积，可以选择10mM(mmol/L)～100mM(mmol/L)、10mM～50mM、20mM的浓度。

ATP的意思是三磷酸腺苷。反应开始时，反应溶液中所含的ATP的浓度例如相对于反应溶液的总体积可以在0.1mM(mmol/L)～3mM(mmol/L)的范围，可以优选在0.1mM～2mM、0.1mM～1.5mM、0.5mM～1.5mM的范围，可以更优选为1mM。

GTP、CTP和UTP的意思分别是三磷酸鸟苷、三磷酸胞苷和三磷酸尿苷。反应开始时，反应溶液中所含的GTP、CTP和UTP的浓度各自独立地例如相对于反应溶液的总体积在0.1mM(mmol/L)～3.0mM(mmol/L)的范围，可以优选在0.5mM～3.0mM、0.5mM～2.0mM的范围。

dNTP是三磷酸脱氧腺苷(dATP)、三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)、三磷酸脱氧胞苷(dCTP)和三磷酸脱氧胸苷(dTTP)的总称。反应开始时，反应溶液中所含的dNTP的浓度例如相对于反应溶液的总体积可以在0.01mM(mmol/L)～1mM(mmol/L)的范围，可以优选在0.05mM～1mM、0.1mM～1mM的范围，可以更优选在0.25mM～1mM的范围。

镁离子源是在反应溶液中产生镁离子(Mg

碱金属离子源是在反应溶液中产生碱金属离子的物质。作为碱金属离子，可列举例如钠离子(Na

RCR法II中使用的反应溶液可以进一步含有蛋白的非特异性吸附抑制剂或核酸的非特异性吸附抑制剂。优选反应溶液可以进一步含有蛋白的非特异性吸附抑制剂和核酸的非特异性吸附抑制剂。通过在反应溶液中存在选自由蛋白的非特异性吸附抑制剂和核酸的非特异性吸附抑制剂组成的组的1种以上非特异性吸附抑制剂，从而反应效率提高。选自由蛋白的非特异性吸附抑制剂和核酸的非特异性吸附抑制剂组成的组的1种以上非特异性吸附抑制剂被认为通过抑制选自由蛋白彼此和蛋白与环状DNA组成的组的1种以上非特异性吸附、蛋白和环状DNA对容器表面的附着而提高反应效率。

蛋白的非特异性吸附抑制剂是与本发明的方法中的扩增反应没有关系的蛋白。作为这样的蛋白，可列举例如牛血清白蛋白(BSA)、溶菌酶、明胶、肝素和酪蛋白等。在反应溶液中，蛋白的非特异性吸附抑制剂相对于反应溶液的总体积可以在0.02mg/mL～2.0mg/mL的范围、优选在0.1mg/mL～2.0mg/mL、0.2mg/mL～2.0mg/mL、0.5mg/mL～2.0mg/mL的范围内含有，可以更优选含有0.5mg/mL，但不限定于此。

核酸的非特异性吸附抑制剂是与本发明的方法中的扩增反应没有关系的核酸分子或核酸类似因子。作为这样的核酸分子或核酸类似因子，可列举例如tRNA(转运RNA)、rRNA(核糖体RNA)、mRNA(信使RNA)、糖原、肝素、寡聚DNA、poly(I-C)(聚肌苷-聚胞苷)、poly(dI-dC)(聚脱氧肌苷-聚脱氧胞苷)、poly(A)(聚腺嘌呤)和poly(dA)(聚脱氧腺嘌呤)等。在反应溶液中，核酸的非特异性吸附抑制剂相对于反应溶液的总体积可以在1ng/μL～500ng/μL的范围、优选在10ng/μL～500ng/μL、10ng/μL～200ng/μL、10ng/μL～100ng/μL的范围内含有，可以更优选含有50ng/μL，但不限定于此。兼顾在先申请，选择tRNA作为核酸的非特异性吸附抑制剂的情况下，可以从tRNA的浓度中将50ng/μL排除。

本发明的方法中使用的反应溶液可以进一步含有DNA稳定化因子。认为通过DNA稳定化因子存在于反应溶液中，DNA的切割受到抑制，能够保护模板DNA和扩增产物。通过DNA稳定化因子的添加，带来目的产物收率的提高。特别是在模板DNA为长链环状DNA的情况下，模板DNA和扩增产物容易分解，因此DNA稳定化因子的添加是有益的。DNA稳定化因子没有特别限定，例如可以为选自由葡萄糖、蔗糖、二甲基亚砜(DMSO)、牛血清白蛋白(BSA)、乙二醇醚二胺四乙酸(EGTA)、浴铜灵二磺酸二钠(BDA)、青霉胺、试钛灵(Tiron，1,2-二羟基苯-3,5-磺酸盐)、二乙三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺四乙酸(EDTA)和Dps蛋白(大肠杆菌来源)、金属硫蛋白(人源)组成的组的物质。其中，DTPA、Tiron、BDA、Dps蛋白和BSA还具有使环状DNA扩增反应高效化的作用，因而特别优选。在反应溶液中，DTPA或Tiron相对于反应溶液的总体积可以在0.01mM(mmol/mL)～0.3mM(mmol/mL)、优选在0.05mM～0.25mM的范围内含有，可以更优选含有0.25mM，但不限定于此。在反应溶液中，BDA相对于反应溶液的总体积可以在0.01mM(mmol/mL)～0.5mM(mmol/mL)、优选在0.05mM～0.3mM的范围内含有，但不限定于此。在反应溶液中，Dps蛋白相对于反应溶液的总体积可以在0.3μM(μmol/mL)～3.0μM(μmol/mL)、优选在0.3μM～1.5μM的范围内含有，但不限定于此。在反应溶液中，BSA相对于反应溶液的总体积可以在0.02mg/mL～2.0mg/mL的范围、优选在0.1mg/mL～2.0mg/mL、0.2mg/mL～2.0mg/mL、0.5mg/mL～2.0mg/mL的范围内含有，可以更优选含有0.5mg/mL，但不限定于此。

RCR法II中使用的反应溶液可以进一步含有直链状DNA特异性核酸外切酶或RecG型解旋酶。优选反应溶液可以进一步含有直链状DNA特异性核酸外切酶和RecG型解旋酶。通过反应溶液中存在选自由直链状DNA特异性核酸外切酶和RecG型解旋酶组成的组的1种以上，具有减少扩增反应中由于双链切割等而产生的直链状DNA的量、提高目的超螺旋产物的收率的效果。

RCR法II中使用的反应溶液可以进一步含有RecG型解旋酶或单链DNA特异性核酸外切酶。优选反应溶液可以进一步含有RecG型解旋酶和单链DNA特异性核酸外切酶。通过反应溶液中存在选自由RecG型解旋酶和单链DNA特异性核酸外切酶组成的组的1种以上，从而具有减少扩增反应中产生的低分子副扩增产物的量、提高目的超螺旋产物的收率的效果。

RCR法II中使用的反应溶液可以进一步含有直链状DNA特异性核酸外切酶或单链DNA特异性核酸外切酶。优选反应溶液可以进一步含有直链状DNA特异性核酸外切酶和单链DNA特异性核酸外切酶。通过反应溶液中存在选自由直链状DNA特异性核酸外切酶和单链DNA特异性核酸外切酶组成的组的1种以上，从而具有减少扩增反应中由于双链切割等而产生的直链状DNA的量、提高目的超螺旋产物的收率的效果。

直链状DNA特异性核酸外切酶是从直链状DNA的5’末端或3’末端开始依次进行水解的酶。直链状DNA特异性核酸外切酶只要具有从直链状DNA的5’末端或3’末端开始依次进行水解的活性，则对其种类、生物学来源没有特别限制。例如，可以使用RecBCD、λ核酸外切酶、核酸外切酶III、核酸外切酶VIII、T5核酸外切酶、T7核酸外切酶和Plasmid-SafeTMATP-Dependent DNase(epicentre)等。优选的直链状DNA特异性核酸外切酶为RecBCD。在反应溶液中，直链状DNA核酸外切酶相对于反应溶液的总体积可以在0.001U/μL～1.0U/μL、优选在0.005U/μL～1.0U/μL、0.01U/μL～1.0U/μL、0.05U/μL～1.0U/μL、0.08U/μL～1.0U/μL、或0.1U/μL～1.0U/μL的范围内含有，但不限定于此。关于直链状DNA核酸外切酶的酶活单位(U)，是将在37℃、30分钟的反应中，使直链状DNA的1nmol脱氧核糖核苷酸为酸可溶性所需的酶量作为1U的单位。

RecG型解旋酶是被认为使延伸反应结束时复制叉彼此碰撞而产生的次生DNA结构解开的解旋酶的酶。RecG型解旋酶只要是具有与大肠杆菌来源的RecG同样的活性的酶，则对其生物学来源没有特别限制，例如，可以适当使用大肠杆菌来源的RecG。作为单体，在反应溶液中，大肠杆菌来源的RecG相对于反应溶液的总体积可以在100nM(nmol/L)～800nM(nmol/L)的范围、优选在100nM～500nM、100nM～400nM、100nM～300nM的范围内含有，可以更优选含有60nM，但不限定于此。RecG型解旋酶可以在对于上述大肠杆菌来源的RecG确定的浓度范围内，作为酶活单位，在相应的浓度范围内使用。

单链DNA特异性核酸外切酶是对单链DNA的5’末端或3’末端的核苷酸依次进行水解的酶。单链DNA特异性核酸外切酶只要具有对单链DNA的5’末端或3’末端的核苷酸依次进行水解的活性，则对其种类、生物学来源没有特别限制。例如，可以使用核酸外切酶I(exoI)、RecJ、核酸外切酶T等。优选的单链DNA特异性核酸外切酶为exo I。在反应溶液中，单链DNA特异性核酸外切酶相对于反应溶液的总体积可以在0.1U/μL～1.0U/μL的范围、优选在0.15U/μL～1.0U/μL、0.2U/μL～1.0U/μL、或0.2U/μL～0.5U/μL的范围内含有，但不限定于此。关于exo I的酶活单位(U)是，将在37℃、30分钟的反应中，使单链DNA的10nmol脱氧核糖核苷酸为酸可溶性所需的酶量作为1U的单位。关于RecJ的酶活单位(U)是，将在37℃、30分钟的反应中，使单链DNA的0.05nmol脱氧核糖核苷酸为酸可溶性所需的酶量作为1U的单位。

RCR法II中使用的反应溶液可以进一步含有铵盐。作为铵盐的例子，可列举硫酸铵、氯化铵和乙酸铵。特别优选的铵盐为硫酸铵或乙酸铵。在反应溶液中，铵盐相对于反应溶液的总体积可以在0.1mM(mmol/L)～100mM(mmol/L)的范围、优选在0.1mM～50mM、1mM～50mM、1mM～20mM的范围内含有，可以更优选含有4mM，但不限定于此。

作为第二酶群之一，使用大肠杆菌来源的DNA连接酶作为具有DNA连接酶活性的酶的情况下，反应溶液中含有作为其辅因子的NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)。在反应溶液中，NAD相对于反应溶液的总体积可以在0.01mM(mmol/L)～1.0mM(mmol/L)的范围、优选在0.1mM～1.0mM、0.1mM～0.5mM的范围内含有，可以更优选含有0.25mM，但不限定于此。

RCR法II中使用的反应溶液可以进一步含有还原剂。作为优选的还原剂的例子，可列举DTT、β-巯基乙醇(2-巯基乙醇)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)和谷胱甘肽。优选的还原剂为DTT。在反应溶液中，还原剂相对于反应溶液的总体积可以以1.0mM(mmol/L)～15.0mM(mmol/L)的浓度、优选以2.0mM～10.0mM、4.0mM～8.0mM的浓度含有。

RCR法II中使用的反应溶液还可以含有用于使ATP再生的酶和底物。作为ATP再生体系的酶与底物的组合，可列举肌酸激酶与磷酸肌酸和丙酮酸激酶与磷酸烯醇丙酮酸。作为ATP再生体系的酶，可列举肌激酶。优选的ATP再生体系的酶与底物的组合为肌酸激酶和磷酸肌酸。

关于反应溶液中所含的第一、第二和第三酶群，如上述“2.第一、第二和第三酶群”一项中所述。

某一方式中，RCR法II中使用的第一酶群可以包含具有DnaA活性的酶、1种以上拟核蛋白、具有DNA旋转酶活性的酶或酶群、单链DNA结合蛋白(single-strand bindingprotein(SSB))、具有DnaB型解旋酶活性的酶、具有DNA解旋酶载体(loader)活性的酶、具有DNA引物酶活性的酶、具有DNA夹活性的酶和具有DNA聚合酶III*活性的酶或酶群的组合。其中，1种以上拟核蛋白可以为IHF或HU，具有DNA旋转酶活性的酶或酶群可以为由GyrA和GyrB构成的复合体，具有DnaB型解旋酶活性的酶可以为DnaB解旋酶，具有DNA解旋酶载体(loader)活性的酶可以为DnaC解旋酶载体(loader)，具有DNA引物酶活性的酶可以为DnaG引物酶，具有DNA夹活性的酶可以为DnaN夹，而且，具有DNA聚合酶III*活性的酶或酶群可以为包含DnaX、HolA、HolB、HolC、HolD、DnaE、DnaQ和HolE中的任意个的酶或酶群。

另一方式中，RCR法II中使用的第二酶群可以含有具有DNA聚合酶I活性的酶和具有DNA连接酶活性的酶的组合。或者，第二酶群可以含有具有DNA聚合酶I活性的酶、具有DNA连接酶活性的酶和具有RNaseH活性的酶的组合。

此外，另一方式中，RCR法II中使用的第三酶群可以含有选自由具有拓扑异构酶III活性的酶和具有拓扑异构酶IV活性的酶组成的组的1种以上酶。或者，第三酶群可以含有具有拓扑异构酶III活性的酶和具有RecQ型解旋酶活性的酶的组合。又或者，第三酶群可以为具有拓扑异构酶III活性的酶、具有RecQ型解旋酶活性的酶和具有拓扑异构酶IV活性的酶的组合。

某一方式中，工序(II-2)可以在油包水型乳浊液内进行。油包水型乳浊液可以通过在工序(II-1)中形成的反应混合物中添加矿物油和表面活性剂并混合来制备。本领域技术人员可以适当选择矿物油和表面活性剂的种类和量。

RCR法II可以在工序(II-2)之后进一步包括用不含第一至第三酶群的反应溶液稀释五倍以上后进行再保温的工序。通过酶群的稀释，新的复制起始受到抑制，另一方面，进行中的复制延伸、环连体形成、分离反应利用残留酶的效果继续进行。此外，反应中出现缺口等而产生的副产物也可在该过程中利用残留连接酶等的效果被修复。因此，特异性诱导从扩增中间体、副产物向终产物的转移，可以期待目的超螺旋结构环状DNA收率的提高。

RCR法II可以在工序(II-2)之后进一步包括利用选自由直链状DNA特异性核酸外切酶和单链DNA特异性核酸外切酶组成的组的1种以上核酸外切酶进行处理的工序。通过利用选自由直链状DNA特异性核酸外切酶和单链DNA特异性核酸外切酶组成的组的1种以上核酸外切酶进行处理，能够将作为扩增反应中产生的副产物的直链状DNA分解除去。选自由直链状DNA特异性核酸外切酶和单链DNA特异性核酸外切酶组成的组的1种以上核酸外切酶的种类和使用量可以如上所述。利用选自由直链状DNA特异性核酸外切酶和单链DNA特异性核酸外切酶组成的组的1种以上核酸外切酶进行的处理例如可以在25℃～40℃进行30分钟～3小时。

RCR法II可以在工序(II-2)之后进一步包括利用间隙修复酶进行处理的工序。间隙修复酶是对作为双链DNA中1个或多个连续的核苷酸缺失的状态的间隙、或双链DNA中相邻核苷酸间的磷酸二酯键断裂的状态的缺口进行修复、形成完整的双链超螺旋DNA的酶群。通过利用间隙修复酶进行处理，从而具有对扩增反应中作为副产物产生的具有间隙或缺口的DNA进行修复、提高目的超螺旋产物的收率的效果。

间隙修复酶只要是能够修复双链DNA的间隙或缺口的酶群，则对其种类、生物学来源没有特别限制。例如，可以使用核酸外切酶III、DNA聚合酶I、DNA连接酶、具有DNA旋转酶活性的酶或酶群的组合。具有核酸外切酶III活性的酶可以以5mU/μL～100mU/μL的浓度使用，但不限定于此。关于核酸外切酶III的酶活单位(U)是，将在37℃、30分钟的反应中，使双链DNA的1nmol脱氧核糖核苷酸为酸可溶性所需的酶量作为1U的单位。DNA聚合酶I、DNA连接酶、具有DNA旋转酶活性的酶或酶群可以分别以前述第一或第二酶群中确定的浓度使用，但不限定于此。利用间隙修复酶进行的处理例如可以在25℃～40℃进行5分钟～120分钟、优选为10分钟～60分钟。

RCR法II可以在工序(II-2)之后根据目的包括对环状DNA的扩增产物进行纯化的工序。环状DNA的纯化可以使用本领域技术人员可利用的方法适当实施。

使用RCR法II扩增的环状DNA可以将反应后的反应混合物直接、或者适当纯化而得的物质用于转化等后续目的。

＜RCR法III＞

一个实施方式中，本发明的方法包括以下的工序：

工序(III-1)：形成作为模板的环状DNA和反应溶液的反应混合物，所述反应溶液含有：

催化环状DNA的复制的第一酶群、

催化冈崎片段连接反应而合成形成环连体的2个姊妹环状DNA的第二酶群、和

催化2个姊妹环状DNA的分离反应的第三酶群；以及

工序(III-2)：使工序(III-1)中形成的反应混合物反应，

其中，该环状DNA包含可与具有DnaA活性的酶结合的复制起始序列(origin ofchromosome(oriC))，而且，进一步包含选自由相对于oriC分别向外侧插入的1对ter序列和XerCD识别的碱基序列组成的组的1种以上序列；

其中，该环状DNA具有ter序列的情况下，前述工序(III-1)的反应溶液进一步含有具有与ter序列结合、抑制复制活性的蛋白，而且，该环状DNA具有XerCD识别的碱基序列的情况下，前述工序(III-1)的反应溶液进一步含有XerCD蛋白(参照专利文献7)。

RCR法III对环状DNA进行复制或扩增。本说明书中，对环状DNA进行复制的意思是，产生与作为模板的环状DNA相同的分子。环状DNA的复制可以通过下述结果来确认：相对于反应开始时作为模板的环状DNA的量，反应后的反应物中环状DNA的量増加。优选环状DNA的复制是指，相对于反应开始时环状DNA的量，反应物中环状DNA的量增加至少2倍、3倍、5倍、7倍、9倍。对环状DNA进行扩增的意思是，环状DNA的复制进行，反应物中环状DNA的量相对于反应开始时作为模板的环状DNA的量指数增加。因此，环状DNA的扩增是环状DNA复制的一个方式。本说明书中，环状DNA的扩增是指，相对于反应开始时作为模板的环状DNA的量，反应物中环状DNA的量增加至少10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、或10000倍。

关于与反应溶液混合的环状DNA，如上述“1.环状DNA”一项中所述。每个反应中使用的模板DNA的量没有特别限制，例如，相对于反应开始时反应溶液的总体积，可以以10ng/μL以下、5ng/μL以下、1ng/μL以下、0.8ng/μL以下、0.5ng/μL以下、0.1ng/μL以下、75pg/μL以下、50pg/μL以下、14pg/μL以下、5pg/μL以下、1pg/μL以下、0.67pg/μL以下、0.5pg/μL以下、50fg/μL以下、7.5fg/μL以下、5fg/μL以下、0.5fg/μL以下的浓度存在于反应溶液中。进一步，反应开始时，也可以每个反应以1分子环状DNA为模板而存在，用于复制或扩增。

RCR法III中使用的作为模板的环状DNA包含选自由相对于oriC分别向外侧插入的1对ter序列和XerCD识别的碱基序列组成的组的1种以上序列。该环状DNA具有ter序列的情况下，工序(III-1)的反应溶液进一步含有具有与ter序列结合、抑制复制活性的蛋白，而且，该环状DNA具有XerCD识别的碱基序列的情况下，工序(III-1)的反应溶液进一步含有XerCD蛋白。

选自由具有与ter序列结合、抑制复制活性的蛋白和XerCD组成的组的1种以上蛋白可以使用市售产品，也可以使用从微生物等提取并根据需要纯化而得的物质。酶从微生物的提取和纯化可以使用本领域技术人员可利用的方法适当实施。

DNA上的ter序列和具有与ter序列结合、抑制复制活性的蛋白的组合是进行复制终止的机制。该机制在多种细菌中有发现，例如，大肠杆菌中作为Tus-ter系统(Hiasa,H.,and Marians,K.J.,J.Biol.Chem.,1994,269:26959-26968；Neylon,C.,等,微生物学与分子生物学评论(Microbiol.Mol.Biol.Rev.)2005年9月第501-526页)、芽孢杆菌属细菌中作为RTP-ter系统(Vivian,等,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)2007,370:481-491)是已知的。RCR法III中，通过利用该机制，能够抑制作为副产物的DNA多聚体的生成。对于DNA上的ter序列和具有与ter序列结合、抑制复制活性的蛋白的组合，其生物学来源没有特别限制。

优选的方式中，RCR法III使用ter序列与Tus蛋白的组合。在与Tus蛋白的组合中使用的ter序列可以为包含5’-GN[A/G][T/A]GTTGTAAC[T/G]A-3’(序列编号23)、更优选为5’-G[T/G]A[T/A]GTTGTAAC[T/G]A-3’(序列编号24)、5’-GTATGTTGTAACTA-3’(序列编号25)、5’-AGTATGTTGTAACTAAAG-3’(序列编号26)、5’-GGATGTTGTAACTA-3’(序列编号27)、5’-GTATGTTGTAACGA-3’(序列编号28)、5’-GGATGTTGTAACTA-3’(序列编号29)、5’-GGAAGTTGTAACGA-3’(序列编号30)、或5’-GTAAGTTGTAACGA-3’(序列编号31)的序列。Tus蛋白的来源没有特别限定，优选为大肠杆菌来源的Tus蛋白。在反应溶液中，Tus蛋白相对于反应溶液的总体积可以在1nM(nmol/L)～200nM(nmol/L)的范围内含有，可以优选在2nM～200nM、2nM～100nM、5nM～200nM、5nM～100nM、10nM～100nM、20nM～100nM、20nM～80nM的范围内含有，但不限定于此。

另一优选的方式中，RCR法III使用ter序列与RTP蛋白的组合。在与RTP蛋白的组合中使用的ter序列为包含5’-AC[T/A][A/G]ANNNNN[C/T]NATGTACNAAAT-3’(序列编号32)、优选为5’-ACTAATT[A/G]A[A/T]C[T/C]ATGTACTAAAT-3’(序列编号33)、5’-ACTAATT[A/G]A[A/T]C[T/C]ATGTACTAAATTTTCA-3’(序列编号34)、5’-GAACTAATTAAACTATGTACTAAATTTTCA-3’(序列编号35)、或5’-ATACTAATTGATCCATGTACTAAATTTTCA-3’(序列编号36)的、23～30个碱基长度的序列。选择包含序列编号10～12的序列、具有23～30个碱基的长度的序列作为ter序列的情况下，该序列可以相对于序列编号13或14具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％的序列同源性。RTP蛋白的来源没有特别限定，优选为芽孢杆菌属细菌来源的RTP蛋白、更优选为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的RTP蛋白。在反应溶液中，Tus蛋白相对于反应溶液的总体积可以在1nM(nmol/L)～200nM(nmol/L)的范围内含有，可以优选在2nM～200nM、2nM～100nM、5nM～200nM、5nM～100nM、10nM～100nM、20nM～100nM、20nM～80nM的范围内含有，但不限定于此。

关于ter序列，“相对于oriC向外侧插入”的意思是，在具有与ter序列结合、抑制复制活性的蛋白的组合的作用下，按照对于朝向oriC外侧的方向的复制允许进行复制，而对于朝向oriC进入的方向的复制则不允许复制而停止的方向插入ter序列。因此，关于ter序列，“相对于oriC分别向外侧插入的1对”的意思是，一方在oriC 5’侧插入有包含序列编号1～14所示序列的任一个的序列，另一方在oriC 3’侧插入有包含序列编号1～14所示序列的互补序列的序列的状态。

ter序列只要相对于oriC分别向外侧插入1对，则可以存在于任何位置。例如，1对ter序列可以相对于oriC存在于对极的区域，也可以存在于oriC两侧附近或相邻区域。存在于oriC两侧附近或相邻区域的情况下，可以将oriC和1对ter序列作为功能盒进行制备，因此存在oriC和1对ter序列向DNA的导入变得简便、作为模板的环状DNA的制备成本降低的优点。

DNA上的XerCD识别序列与XerCD蛋白的组合在进行DNA多聚体分离的机制中发挥功能(Ip,S.C.Y.,等,EMBO J.,2003,22:6399-6407)。XerCD蛋白是XerC和XerD的复合体。作为XerCD蛋白识别的序列，已知dif序列、cer序列、psi序列(Colloms,等,EMBO J.,1996,15(5):1172-1181；Arciszewska,L.K.,等,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.),2000,299:391-403)。本实施方式的方法中，通过利用该机制，能够抑制作为副产物的DNA多聚体的生成。对于DNA上的XerCD识别序列与XerCD蛋白的组合，其生物学来源没有特别限制。此外，XerCD的促进因子是已知的，例如，dif的功能被FtsK蛋白促进(Ip,S.C.Y.,等,EMBO J.,2003,22:6399-6407)。一个方式中，RCR法III中的反应溶液中可以含有FtsK蛋白。

XerCD识别的序列可以为包含5’-GGTGCG[C/T][A/G][T/C]AANNNNNNTTATG[T/G]TAAA[T/C]-3’(序列编号37)、5’-GGTGCG[C/T]A[T/C]AANNNNNNTTATG[T/G]TAAAT-3’(序列编号38)、5’-GGTGCGC[A/G][T/C]AANNNNNNTTATGTTAAA[T/C]-3’(序列编号39)、5’-GGTGCG[C/T][A/G]CAANNNNNNTTATG[T/G]TAAA[T/C]-3’(序列编号40)、5’-GGTGCGCATAANNNNNNTTATGTTAAAT-3’(序列编号41)、5’-GGTGCGTACAANNNNNNTTATGGTAAAT-3’(序列编号42)、5’-GGTGCGCGCAANNNNNNTTATGTTAAAC-3’(序列编号43)、5’-GGTGCGCATAATGTATATTATGTTAAAT-3’(序列编号44/dif序列)、5’-GGTGCGTACAAGGGATGTTATGGTAAAT-3’(序列编号45/cer序列)、或5’-GGTGCGCGCAAGATCCATTATGTTAAAC-3’(序列编号46/psi序列)、或它们中任一个的互补序列的序列。序列编号15～24的第1～11位碱基部分为XerC结合部位，序列编号15～24的第18～28位碱基部分为XerD结合部位。序列编号15～21的第12～17位碱基部分(NNNNNN所示的6碱基部分)不是XerC或XerD的结合区域，因此序列没有特别限定。优选序列编号15～21的第12～17位碱基(NNNNNN所示的6碱基部分)的序列可以相对于序列编号22～24的第12～17位碱基的序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％的序列同源性。

XerCD蛋白优选为大肠杆菌来源的XerCD蛋白。在反应溶液中，XerCD蛋白相对于反应溶液的总体积可以在1nM(nmol/L)～200nM(nmol/L)的范围内含有，可以优选在5nM～200nM、5nM～150nM、10nM～200nM、10nM～150nM、20nM～200nM、20nM～150nM、20nM～100nM的范围内含有，但不限定于此。

XerCD识别序列可以存在于环状DNA上的任何位置。例如，XerCD识别序列可以相对于oriC存在于对极的区域，也可以存在于oriC附近或相邻区域。存在于oriC附近或相邻区域的情况下，可以将oriC和XerCD识别的序列作为功能盒进行制备，因此具有oriC和XerCD识别的序列向DNA的导入变得简便、作为模板的环状DNA的制备成本降低的优点。

本说明书中，2个碱基序列的同源性％可以通过目测检查和数学计算来确定。此外，也可以使用电脑程序来确定同源性％。作为这样的序列比对电脑程序，例如可列举可从美国国家医学图书馆的网站：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html利用的BLASTN程序(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-10)：版本2.2.7、或WU-BLAST2.0算法等。关于WU-BLAST2.0的标准默认参数的设定可以使用以下的互联网网站：http://blast.wustl.edu记载的数据。

关于反应溶液中所含的第一、第二和第三酶群，如上述“2.第一、第二和第三酶群”一项中所述。

某一方式中，RCR法III中使用的第一酶群可以含有具有DnaA活性的酶、1种以上拟核蛋白、具有DNA旋转酶活性的酶或酶群、单链DNA结合蛋白(single-strand bindingprotein(SSB))、具有DnaB型解旋酶活性的酶、具有DNA解旋酶载体(loader)活性的酶、具有DNA引物酶活性的酶、具有DNA夹活性的酶和具有DNA聚合酶III*活性的酶或酶群的组合。其中，1种以上拟核蛋白可以为IHF或HU，具有DNA旋转酶活性的酶或酶群可以为由GyrA和GyrB构成的复合体，具有DnaB型解旋酶活性的酶可以为DnaB解旋酶，具有DNA解旋酶载体(loader)活性的酶可以为DnaC解旋酶载体(loader)，具有DNA引物酶活性的酶可以为DnaG引物酶，具有DNA夹活性的酶可以为DnaN夹，而且，具有DNA聚合酶III*活性的酶或酶群可以为包含DnaX、HolA、HolB、HolC、HolD、DnaE、DnaQ和HolE中的任意种的酶或酶群。

另一方式中，RCR法III中使用的第二酶群可以含有具有DNA聚合酶I活性的酶和具有DNA连接酶活性的酶的组合。或者，第二酶群可以含有具有DNA聚合酶I活性的酶、具有DNA连接酶活性的酶和具有RNaseH活性的酶的组合。

此外，另一方式中，RCR法III中使用的第三酶群可以含有选自由具有拓扑异构酶III活性的酶和具有拓扑异构酶IV活性的酶组成的组的1种以上酶。或者，第三酶群可以含有具有拓扑异构酶III活性的酶和具有RecQ型解旋酶活性的酶的组合。又或者，第三酶群可以为具有拓扑异构酶III活性的酶、具有RecQ型解旋酶活性的酶和具有拓扑异构酶IV活性的酶的组合。

反应溶液可以含有缓冲液、ATP、GTP、CTP、UTP、dNTP、镁离子源和碱金属离子源。

反应溶液所含的缓冲液只要是适合在pH7～9、优选为pH8使用的缓冲液，就没有特别限制。可列举例如Tris-HCl、Hepes-KOH、磷酸缓冲液、MOPS-NaOH、Tricine-HCl等。优选的缓冲液为Tris-HCl。本领域技术人员可以适当选择缓冲液的浓度，没有特别限定，在Tris-HCl的情况下，例如，相对于反应溶液的总体积，可以选择10mM(mmol/L)～100mM(mmol/L)、10mM～50mM、20mM的浓度。

ATP的意思是三磷酸腺苷。反应开始时，反应溶液中所含的ATP的浓度例如相对于反应溶液的总体积可以在0.1mM(mmol/L)～3mM(mmol/L)的范围内，可以优选在0.1mM～2mM、0.1mM～1.5mM、0.5mM～1.5mM的范围内，可以更优选为1mM。

GTP、CTP和UTP的意思分别为三磷酸鸟苷、三磷酸胞苷和三磷酸尿苷。反应开始时，反应溶液中所含的GTP、CTP和UTP的浓度各自独立地例如相对于反应溶液的总体积可以在0.1mM(mmol/L)～3.0mM(mmol/L)的范围内，可以优选在0.5mM～3.0mM、0.5mM～2.0mM的范围内。

dNTP是三磷酸脱氧腺苷(dATP)、三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)、三磷酸脱氧胞苷(dCTP)和三磷酸脱氧胸苷(dTTP)的总称。反应开始时，反应溶液中所含的dNTP的浓度例如相对于反应溶液的总体积可以在0.01mM(mmol/L)～1mM(mmol/L)的范围内，可以优选在0.05mM～1mM、0.1mM～1mM的范围内，可以更优选在0.25mM～1mM的范围内。

镁离子源是在反应溶液中产生镁离子(Mg

碱金属离子源是在反应溶液中产生碱金属离子的物质。作为碱金属离子，可列举例如钠离子(Na

反应溶液可以进一步含有蛋白的非特异性吸附抑制剂或核酸的非特异性吸附抑制剂。优选反应溶液可以进一步含有蛋白的非特异性吸附抑制剂和核酸的非特异性吸附抑制剂。通过反应溶液中存在选自由蛋白的非特异性吸附抑制剂和核酸的非特异性吸附抑制剂组成的组的1种以上非特异性吸附抑制剂，能够抑制选自由蛋白彼此和蛋白与环状DNA组成的组的1种以上非特异性吸附、蛋白和环状DNA对容器表面的附着，可以期待反应效率的提高。

蛋白的非特异性吸附抑制剂是与本实施方式的方法中的复制或扩增反应没有关系的蛋白。作为这样的蛋白，可列举例如牛血清白蛋白(BSA)、溶菌酶、明胶、肝素和酪蛋白等。在反应溶液中，蛋白的非特异性吸附抑制剂相对于反应溶液的总体积可以在0.02mg/mL～2.0mg/mL的范围、优选在0.1mg/mL～2.0mg/mL、0.2mg/mL～2.0mg/mL、0.5mg/mL～2.0mg/mL的范围内含有，可以更优选含有0.5mg/mL，但不限定于此。

核酸的非特异性吸附抑制剂是与RCR法III中的复制或扩增反应没有关系的核酸分子或核酸类似因子。作为这样的核酸分子或核酸类似因子，可列举例如tRNA(转运RNA)、rRNA(核糖体RNA)、mRNA(信使RNA)、糖原、肝素、寡聚DNA、poly(I-C)(聚肌苷-聚胞苷)、poly(dI-dC)(聚脱氧肌苷-聚脱氧胞苷)、poly(A)(聚腺嘌呤)和poly(dA)(聚脱氧腺嘌呤)等。

在反应溶液中，核酸的非特异性吸附抑制剂相对于反应溶液的总体积可以在1ng/μL～500ng/μL的范围、优选在10ng/μL～500ng/μL、10ng/μL～200ng/μL、10ng/μL～100ng/μL的范围内含有，可以更优选含有50ng/μL，但不限定于此。兼顾在先申请，选择tRNA作为核酸的非特异性吸附抑制剂的情况下，可以从tRNA的浓度中将50ng/μL排除。

反应溶液可以进一步含有直链状DNA特异性核酸外切酶或RecG型解旋酶。优选反应溶液可以进一步含有直链状DNA特异性核酸外切酶和RecG型解旋酶。通过反应溶液中存在选自由直链状DNA特异性核酸外切酶和RecG型解旋酶组成的组的1种以上，能够减少复制或扩增反应中由于双链切割等而产生的直链状DNA的量，期待目的超螺旋产物的收率提高。

直链状DNA特异性核酸外切酶是从直链状DNA的5’末端或3’末端开始依次进行水解的酶。直链状DNA特异性核酸外切酶只要是具有从直链状DNA的5’末端或3’末端开始进行依次水解的活性的物质，则对其种类、生物学来源没有特别限制。例如，可以使用RecBCD、λ核酸外切酶、核酸外切酶III、核酸外切酶VIII、T5核酸外切酶、T7核酸外切酶和Plasmid-SafeTM ATP-Dependent DNase(epicentre)等。优选的直链状DNA特异性核酸外切酶为RecBCD。在反应溶液中，直链状DNA核酸外切酶相对于反应溶液的总体积可以在0.01U/μL～1.0U/μL的范围、优选在0.08U/μL～1.0U/μL、或0.1U/μL～1.0U/μL的范围内含有，但不限定于此。关于直链状DNA核酸外切酶的酶活单位(U)是，将在37℃、30分钟的反应中，使直链状DNA的1nmol脱氧核糖核苷酸为酸可溶性所需的酶量作为1U的单位。

RecG型解旋酶是被认为消除在延伸反应终止时复制叉彼此碰撞而产生的次生DNA结构的解旋酶的酶。RecG型解旋酶只要是具有与大肠杆菌来源的RecG同样的活性的酶，则对其生物学来源没有特别限制，例如，可以适当使用大肠杆菌来源的RecG。大肠杆菌来源的RecG作为单体在反应溶液中，相对于反应溶液的总体积可以在100nM(nmol/L)～800nM(nmol/L)的范围、优选在100nM～500nM、100nM～400nM、100nM～300nM的范围内含有，可以更优选含有60nM，但不限定于此。RecG型解旋酶可以在对于上述大肠杆菌来源的RecG确定的浓度范围内，作为酶活单位，在相应的浓度范围内使用。

反应溶液可以进一步含有铵盐。作为铵盐的例子，可列举硫酸铵、氯化铵和乙酸铵。特别优选的铵盐为硫酸铵。在反应溶液中，铵盐相对于反应溶液的总体积可以在0.1mM(mmol/L)～100mM的范围、优选在0.1mM～50mM、1mM～50mM、1mM～20mM的范围内含有，可以更优选含有4mM，但不限定于此。

作为第二酶群之一，使用大肠杆菌来源的DNA连接酶作为具有DNA连接酶活性的酶的情况下，反应溶液中含有作为其辅因子的NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)。在反应溶液中，NAD相对于反应溶液的总体积可以在0.01mM(mmol/L)～1.0mM的范围、优选在0.1mM～1.0mM、0.1mM～0.5mM的范围内含有，可以更优选含有0.25mM，但不限定于此。

RCR法III中使用的反应溶液可以进一步含有还原剂。作为优选的还原剂的例子，可列举DTT、β-巯基乙醇、谷胱甘肽。优选的还原剂为DTT。

RCR法III中使用的反应溶液还可以含有用于使ATP再生的酶和底物。作为ATP再生体系的酶与底物的组合，可列举肌酸激酶与磷酸肌酸和丙酮酸激酶与磷酸烯醇丙酮酸。作为ATP再生体系的酶，可列举肌激酶。优选的ATP再生体系的酶与底物的组合为肌酸激酶与磷酸肌酸。

上述工序(III-2)是使工序(III-1)中形成的反应混合物反应的工序。工序(III-2)例如可以为在15℃～80℃、15℃～50℃、15℃～40℃的温度范围内使反应混合物反应的工序。优选工序(III-2)可以为在等温条件下保温的工序。作为等温条件，只要是DNA复制反应能够进行的条件，就没有特别限制，例如，可以设为处于作为DNA聚合酶的最适温度的20℃～80℃范围内的一定的温度，可以设为处于25℃～50℃的范围的一定的温度，可以设为处于25℃～40℃的范围内的一定的温度，可以设为30℃～33℃左右。本说明书中，术语“在等温条件下保温”、“等温反应”的意思是反应中保持在上述温度范围内。保温时间可以根据环状DNA的复制产物或扩增产物的目的量适当设定，例如，可以设为1～24小时，可以设为16～21小时。

或者，作为上述工序(III-2)，可以包括将工序(III-1)中形成的反应混合物在重复30℃以上的温育和27℃以下的温育的温度循环下进行温育的工序。30℃以上的温育只要在包含oriC的环状DNA的复制能够起始的温度范围内，就没有特别限定，例如可以为30℃～80℃、30℃～50℃、30℃～40℃、37℃。30℃以上的温育没有特别限定，每个循环可以为10秒～10分钟，可以为1分钟。27℃以下的温育只要是复制起始受到抑制、DNA的延伸反应进行的温度，就没有特别限定，例如可以为10℃～27℃、16℃～25℃、24℃。27℃以下的温育没有特别限定，优选根据扩增的环状DNA的长度来设定，例如，可以设为每个循环每1000个碱基为1秒～10秒。温度循环的循环数没有特别限定，可以为10个循环～50个循环、20个循环～45个循环、25个循环～45个循环、40个循环。

RCR法III可以在将上述反应混合物在等温条件下保温的工序之后包括根据目的对环状DNA的复制产物或扩增产物进行纯化的工序。环状DNA的纯化可以使用本领域技术人员可利用的方法适当实施。

使用RCR法III复制或扩增的环状DNA可以将反应后的反应混合物直接、或者适当纯化而得的物质用于转化等后续目的。

＜RCR法IV＞

与XerCD和dif的组合同样地，使用Cre与其识别序列loxP的组合能够诱导DNA多聚体的分离也是已知的(Ip,S.C.Y.,等,EMBO J.,2003,22:6399-6407)。本发明人等发现，使用DNA多聚体分离酶与其识别序列的组合代替RCR法III中的XerCD与dif的组合，也能够抑制作为副产物的DNA多聚体的生成。

一个实施方式中，本发明的方法包括以下的工序：

工序(IV-1)：形成作为模板的环状DNA和反应溶液的反应混合物，所述反应溶液含有：

催化环状DNA的复制的第一酶群、

催化冈崎片段连接反应而合成形成环连体的2个姊妹环状DNA的第二酶群、和

催化2个姊妹环状DNA的分离反应的第三酶群、的反应溶液的反应混合物的工序；以及

工序(IV-2)：使工序(IV-1)中形成的反应混合物反应，

其中，该环状DNA包含可与具有DnaA活性的酶结合的复制起始序列(origin ofchromosome(oriC))，而且进一步包含选自由相对于oriC分别向外侧插入的1对ter序列和DNA多聚体分离酶识别的碱基序列组成的组的1种以上序列，

其中，该环状DNA具有ter序列的情况下，前述工序(IV-1)的反应溶液进一步含有具有与ter序列结合、抑制复制活性的蛋白；而且，该环状DNA具有DNA多聚体分离酶识别的碱基序列的情况下，前述工序(IV-1)的反应溶液进一步含有DNA多聚体分离酶(参照专利文献7)。

即，RCR法IV是下述方法：将RCR法III中的“XerCD”的范围扩展至“DNA多聚体分离酶”、将“XerCD识别的碱基序列”的范围扩展至“DNA多聚体分离酶识别的碱基序列”。因此，在＜RCR法III＞一项中记载的对于RCR法III各构成的说明对于RCR法IV也是适用的。

DNA多聚体分离酶是能够通过使基因重组发生来诱导DNA多聚体的分离的酶。能够识别特定的碱基序列、使基因重组在该碱基序列的部位发生的位置特异性重组酶可以作为DNA多聚体分离酶使用。将被DNA多聚体分离酶识别的特定碱基序列记载为“DNA多聚体分离酶识别的碱基序列”。通过利用DNA多聚体分离酶和DNA多聚体分离酶识别的碱基序列的组合进行的基因重组，能够诱导DNA多聚体的分离。RCR法IV中，通过利用该机制，能够抑制作为副产物的DNA多聚体的生成。DNA多聚体分离酶可以使用市售产品，也可以从微生物等提取、根据需要使用生成的物质。酶从微生物的提取和纯化可以使用本领域技术人员可利用的方法适当实施。

DNA多聚体分离酶与该DNA多聚体分离酶识别的碱基序列的组合可列举XerCD与dif序列、Cre与loxP序列(Siegel,R.W.等,FEBS Lett.,2001,499(1-2):147-153，Araki,K.等,Nucleic Acids Res.:1997,25(4):868-872)、出芽酵母(Saccharomyces verevisiae)来源的重组酶FLP与FRT序列(Broach,J.R.等,Cell,1982,29(1):227-234)、细菌噬菌体D6来源的重组酶DreO与rox序列(Anastassiadis,K.等,Dis.Model.Mech.,2009,2:508-515)、鲁氏酵母(Zygosacchromyces rouxii)来源的重组酶R与RS序列(Araki,H.等,J.Mol.Biol.,1985,182(2):191-203)、丝氨酸重组酶家族(例如Gin、γδ、Tn3和Hin)与它们的识别序列(Smith,M.C.等,Mol.Microbiol.,2002,44:299)，但不限定为这些组合。

关于XerCD与dif序列，如＜RCR法III＞一项所述。

对于Cre和loxP序列的组合，其生物学来源没有特别限制。Cre优选为细菌噬菌体P1来源的Cre蛋白。在反应溶液中，Cre相对于反应溶液的总体积可以在0.01mU/μL～200mU/μL的范围内含有，可以优选在0.1mU/μL～150mU/μL、0.1mU/μL～100mU/μL、0.5mU/μL～100mU/μL、0.5mU/μL～80mU/μL、0.1mU/μL～50mU/μL、1mU/μL～50mU/μL、1mU/μL～30mU/μL的范围内含有，但不限定于此。

Cre识别的loxP序列可以为包含作为loxP共有序列的5’-ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3’(序列编号47)、或作为突变loxP序列(小写字母部分为相对于共有序列的突变碱基)的5’-ATAACTTCGTATAGtATACATTATACGAAGTTAT-3’(序列编号48/lox511)、5’-ATAACTTCGTATAGgATACtTTATACGAAGTTAT-3’(序列编号49/lox2272)、5’-ATAACTTCGTATAtacctttcTATACGAAGTTAT-3’(序列编号50/loxFAS)、5’-ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAcggta-3’(序列编号51/lox RE)、5’-taccgTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3’(序列编号52/lox LE)、或它们中任一个的互补序列的序列。

在反应溶液中，出芽酵母(Saccharomyces verevisiae)来源的重组酶FLP相对于反应溶液的总体积可以在1nM(nmol/L)～200nM(nmol/L)的范围内含有，可以优选在5nM～200nM、5nM～150nM、10nM～200nM、10nM～150nM、20nM～200nM、20nM～150nM、20nM～100nM的范围内含有，但不限定于此。FLP识别的FRT序列可以为包含5’-GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC-3’(序列编号53)、或其互补序列的序列。

在反应溶液中，细菌噬菌体D6来源的重组酶DreO相对于反应溶液的总体积可以在1nM(nmol/L)～200nM(nmol/L)的范围内含有，可以优选在5nM～200nM、5nM～150nM、10nM～200nM、10nM～150nM、20nM～200nM、20nM～150nM、20nM～100nM的范围内含有，但不限定于此。DreO识别的rox序列可以为包含5’-TAACTTTAAATAATGCCAATTATTTAAAGTTA-3’(序列编号54)、或其互补序列的序列。

在反应溶液中，鲁氏酵母(Zygosacchromyces rouxii)来源的重组酶R相对于反应溶液的总体积可以在1nM(nmol/L)～200nM(nmol/L)的范围内含有，可以优选在5nM～200nM、5nM～150nM、10nM～200nM、10nM～150nM、20nM～200nM、20nM～150nM、20nM～100nM的范围内含有，但不限定于此。酶R识别的RS序列可以为包含Araki,H.等(J.Mol.Biol.,1985,182(2):191-203)公开的序列或其互补序列的序列。

在反应溶液中，丝氨酸重组酶家族(γδ、Tn3、Gin和Hin)相对于反应溶液的总体积可以在1nM(nmol/L)～200nM(nmol/L)的范围内含有，可以优选在5nM～200nM、5nM～150nM、10nM～200nM、10nM～150nM、20nM～200nM、20nM～150nM、20nM～100nM的范围内含有，但不限定于此。γδ、Tn3与它们的识别序列res可以为包含Grindley N.D.F.等(Cell,1982,30:19-27)公开的序列或其互补序列的序列。Gin与其识别序列可以为包含Kahmann.R.等(Cell,1985,41:771-780)公开的序列或其互补序列的序列。Hin与其识别序列可以为包含Glasgow.A.C.等(J.Biol.Chem.,1989,264:10072-10082)公开的序列或其互补序列的序列。

DNA多聚体分离酶识别的序列可以存在于环状DNA的任意位置。例如，DNA多聚体分离酶识别的序列可以存在于oriC附近或相邻区域，也可以存在于相对于oriC为对极的区域。

＜RCR法V＞

一个实施方式中，本发明的方法包括以下的工序：

工序(V-1)：在缓冲液中添加oriC转座子和转座酶来形成oriC转座体，使oriC转座体与不含oriC的环状DNA在缓冲液中反应来进行转移反应，由此制备包含oriC的环状DNA，

其中，oriC转座子是包含可与具有DnaA活性的酶结合的复制起始序列(origin ofchromosome(oriC))的线状DNA，其两个末端包含外末端(Outside end，OE)序列；

工序(V-2)：形成工序(V-1)中得到的包含oriC的环状DNA与反应溶液的反应混合物，所述反应溶液含有：

催化环状DNA的复制的第一酶群、

催化冈崎片段连接反应而合成形成环连体的2个姊妹环状DNA的第二酶群、和

催化2个姊妹环状DNA的分离反应的第三酶群；以及

工序(V-3)：使工序(V-2)中形成的反应混合物反应(参照专利文献7)。

不受理论限制，RCR法V是下述方法：利用转座子，在不含oriC的环状DNA中导入oriC，从而制备包含oriC的环状DNA，对该包含oriC的环状DNA进行复制或扩增。关于环状DNA的复制和扩增的定义如关于RCR法III所述。

关于与反应溶液混合的包含oriC的环状DNA，如上述“1.环状DNA”一项中所述。每个反应中使用的包含oriC的环状DNA的量如关于RCR法III中的模板DNA的量所述。

此外，关于反应溶液中所含的酶群、反应溶液中可含有的其他成分的说明与RCR法III是同样的。进一步，上述工序(V-3)与RCR法III中的工序(V-2)同样进行。关于进一步包括对环状DNA的复制产物或扩增产物进行纯化的工序以及使用RCR法V复制或扩增的环状DNA的利用也是与RCR法III同样的。

oriC转座子两端的OE序列只要是本领域技术人员已知的识别转座酶、可作为OE序列利用的序列，就可以为任何序列。优选的方式中，OE序列包含序列编号55(5’-CTGTCTCTTATACACATCT-3’)所示的序列或其互补序列，工序(1)的线状DNA的5’末端插入有包含序列编号55所示的序列的OE序列，该线状DNA的3’末端插入有包含序列编号55所示的序列的互补序列的OE序列。

上述工序(V-1)中，oriC转座体的形成中使用的oriC转座子的浓度相对于反应溶液的总体积可以为20nM(nmol/L)～200nM(nmol/L)，可以优选为40nM～160nM。

转座酶只要是识别OE序列、形成转座体、使转座子DNA转移至环状DNA中的酶，则对其生物学来源没有特别限制，例如可以适当使用大肠杆菌来源的转座酶。特别优选的是高活性Tn5突变(E54K、L372P)蛋白(Goryshin,I.Y.和Reznikoff,W.S.,J.Biol.Chem.,1998,273:7367-7374)。转座酶可以使用市售产品，也可以使用从微生物等提取并根据需要纯化而得的物质。酶从微生物的提取和纯化可以使用本领域技术人员可利用的方法适当实施。使用高活性Tn5突变(E54K、L372P)蛋白作为转座酶的情况下，上述工序(V-1)中，oriC转座体的形成中使用的浓度相对于反应溶液的总体积可以为50nM(nmol/L)～200nM(nmol/L)，可以优选为80nM～150nM。

工序(V-1)中使用的缓冲液只要是适合在pH6～9、优选为pH7.5使用的缓冲液，就没有特别限制。可列举例如Tris-乙酸(Tris-OAc)、Tris-HCl、Hepes-KOH、磷酸缓冲液、MOPS-NaOH、Tricine-HCl等。优选的缓冲液为Tris-OAc或Tris-HCl。本领域技术人员可以适当选择缓冲液的浓度，没有特别限定，为Tris-OAc或Tris-HCl的情况下，例如，相对于反应溶液的总体积，可以选择10mM(mmol/L)～100mM(mmol/L)、10mM～50mM、20mM的浓度。

工序(V-1)中形成oriC转座体的工序通过在30℃左右的温度下保温30分钟左右来进行。

工序(V-1)的转移反应在转座酶的最适温度、例如37℃进行。本领域技术人员可以适当选择进行转移反应的时间，例如可以为15分钟左右。此外，工序(V-1)的转移反应中可以添加tRNA。工序(V-1)的转移反应中添加tRNA的浓度例如相对于反应溶液的总体积可以选择10ng/μL～200ng/μL、30ng/μL～100ng/μL、50ng/μL的浓度。

一个方式中，工序(V-2)的包含oriC的环状DNA可以进一步包括选自由相对于oriC分别向外侧插入的1对ter序列和XerCD、Cre等DNA多聚体分离酶识别的碱基序列组成的组的1种以上序列。这种情况下，该环状DNA具有ter序列的情况下，前述工序(V-2)的反应溶液进一步含有具有与ter序列结合来抑制复制活性的蛋白，而且，该环状DNA具有XerCD、Cre等DNA多聚体分离酶识别的碱基序列的情况下，前述工序(V-2)的反应溶液进一步含有XerCD、Cre等DNA多聚体分离酶。

或者，另一方式中，以使选自由相对于oriC分别向外侧插入的1对ter序列和XerCD、Cre等DNA多聚体分离酶识别的碱基序列组成的组的1种以上序列包含在oriC转座子的一部分的方式制备，对于选自由1对ter序列和XerCD、Cre等DNA多聚体分离酶识别的碱基序列组成的组的1种以上序列，也可以利用转座子导入环状DNA。即，该方式中，工序(V-1)的线状DNA进一步包含选自由相对于oriC分别向外侧插入的1对ter序列和XerCD、Cre等DNA多聚体分离酶识别的碱基序列组成的组的1种以上序列，而且，该线状DNA具有ter序列的情况下，前述工序(V-2)的反应溶液进一步含有具有与ter序列结合来抑制复制活性的蛋白，而且，该环状DNA具有XerCD、Cre等DNA多聚体分离酶识别的碱基序列的情况下，前述工序(V-2)的反应溶液进一步含有XerCD蛋白。

其中，关于选自由相对于oriC分别向外侧插入的1对ter序列和XerCD、Cre等DNA多聚体分离酶识别的碱基序列组成的组的1种以上序列、以及选自由具有与ter序列结合来抑制复制活性的蛋白和XerCD、Cre等DNA多聚体分离酶组成的组的1种以上的定义和说明如关于RCR法III或RCR法IV所述。

一个方式中，RCR法V可以进一步包括工序(V-4)：从工序(V-3)的反应物中复制或扩增的环状DNA将oriC转座子除去。

将oriC转座子除去的工序可以包括相对于反应溶液的总体积利用0.1nM(nmol/L)～30nM(nmol/L)、优选为1nM～20nM、更优选为3nM～10nM的转座酶进行处理、以及利用ExoIII那样的直链状双链DNA依赖性单链DNA核酸外切酶进行DNA末端的单链化处理。利用转座酶的处理中使用的缓冲液可以使用工序(V-1)中使用的缓冲液。利用单链DNA核酸外切酶的处理中使用的缓冲液只要是单链DNA核酸外切酶起作用的条件，就可以使用任何组成的缓冲液。

此外，将oriC转座子除去的工序可以进一步包括利用对应于oriC转座子的序列所含的限制酶部位的限制酶的处理。该处理的目的在于对oriC转座子进行特异性切割。因此，这种情况下，选择对应于oriC转座子中包含、但复制/扩增的环状DNA中oriC转座子区域以外的区域不包含的限制酶部位的限制酶。oriC转座子所含的区域特异性双链切割可以使用CRISPR-Cas9来代替限制酶。这种情况下，在向导RNA中指定oriC转座子所含的区域特异性序列。

另一实施方式中，本发明的工序(2)可以通过滚环扩增(以下也称为“RCA法”(Rolling Circle Amplification))来进行。

RCA法是使用具有链替换活性的DNA聚合酶以及第一和第二引物扩增环状DNA的方法。RCA法可以通过常规方法来进行，例如，可以按照以下的步骤来进行。首先，使第一引物与环状DNA杂交，以此为起始点，利用具有链替换活性的DNA聚合酶进行延伸反应。具有链替换活性的DNA聚合酶即使到达环状DNA的聚合酶反应起始点，也会一边将已经合成的链剥离一边进行合成。结果，作为扩增产物，得到原来的一圈环状DNA的DNA序列重复连接而成的单链DNA。使第二引物与该单链DNA杂交。1个单链DNA上可以杂交多个第二引物。如果由多个第二引物，利用具有链替换活性的DNA聚合酶进行延伸反应，则由在上游杂交的第二引物合成的DNA一边使由在下游杂交的第二引物合成的DNA剥离一边进行互补链的合成。第一引物与形成单链的由第二引物合成的DNA杂交，发生新的复制反应。这样，原来的环状DNA的序列指数扩增，得到原来的环状DNA的序列重复连接而成的DNA多聚体。将其用适当的DNA切割酶切割，用DNA连接酶环化，从而得到单个的原来的环状DNA的复制产物。单个的原来的环状DNA的复制产物也可以通过利用Cre-loxP等位置特异性重组系统使DNA多聚体环化而得到。

“第一引物”是结合于作为对象的环状DNA的引物，“第二引物”是结合于与第一引物所结合的环状DNA互补的序列的引物。作为第一和第二引物，可以使用随机引物。引物的长度通常可以在6个碱基～9个碱基左右。

作为具有链替换活性的DNA聚合酶，可以使用公知的酶，可列举例如Phi29细菌噬菌体DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Csa DNA聚合酶、96-7DNA聚合酶等。也可以使用市售的酶。反应条件可以根据使用的DNA聚合酶适当设定。

II.用于在无细胞体系中对DNA进行编辑的试剂盒

本发明提供一种试剂盒，其包括用于在无细胞体系中，在DNA的目标部位导入缺失、替换或添加所需的成分和用于在无细胞体系中扩增导入缺失、替换或添加的DNA所需的成分。

用于在DNA的目标部位导入缺失、替换或添加所需的成分可以根据为了实施本发明的方法而使用的技术的不同而不同，可列举例如包含希望的突变(例如替换、缺失或添加)的单链DNA(例如化学合成的寡聚核苷酸)、DNA聚合酶等。此外，使用RA法的情况下，作为本发明的试剂盒所含的成分，可列举例如RecA家族重组酶蛋白、核酸外切酶、三磷酸核苷或三磷酸脱氧核苷的再生酶及其底物、三磷酸核苷、三磷酸脱氧核苷、镁离子源、碱金属离子源、二甲基亚砜、四甲基氯化铵、聚乙二醇、二硫苏糖醇以及缓冲液。

用于在无细胞体系中扩增导入缺失、替换或添加的DNA所需的成分可以根据为了实施本发明的方法而使用的技术的不同而不同。例如，使用RCR法的情况下，作为本发明的试剂盒所含的成分，可列举例如选自由复制起始蛋白、1种以上拟核蛋白、具有DNA旋转酶活性的酶或酶群、单链DNA结合蛋白(single-strand binding protein(SSB))、具有DNA解旋酶活性的酶(例如具有DnaB型解旋酶活性的酶)、具有DNA解旋酶载体(loader)活性的酶、具有DNA引物酶活性的酶、具有DNA夹活性的酶和具有DNA聚合酶III*活性的酶或酶群组成的组的酶或酶群中的1种以上。

本发明的试剂盒可以根据为了实施本发明的方法而使用的技术，包括反应缓冲液或其浓缩物等补加的构成品。作为补加的构成品，可列举例如在上述RCR法I～V的实施中必需的成分。

本发明的试剂盒可以进一步包括用于对未导入缺失、替换或添加的DNA进行特异性切割的人工DNA切割酶。

本发明的试剂盒还可以包括记载了用于使用该试剂盒实施本发明的方法的实验方案的文件。该实验方案也可以记载在收纳试剂盒的容器的表面。

实施例

以下，基于实施例具体地对本发明进行说明。需说明的是，本发明不受下述实施例记载的范围的限定。

[实施例1]CRISPR-Cas9的序列特异性的确认

使用9.5kb的质粒(pOri8)或205kb的质粒(pMSR227)，确认利用CRISPR-Cas9进行的切割的序列特异性。pOri8(图2A)和pMSR227(图3A)是Su’etsugu等核酸研究(NucleicAcids Res.)2017年11月，16；45(20):11525-11534中记载的质粒。

将10ng/μL的pOri8或pMSR227、100nM gRNA_Km(按照IDT公司Alt-R(注册商标)CRISPR-Cas9系统制备的向导RNA，识别序列：UGGUUAAUUGGUUGUAACAC(序列编号1))、20nMCas9(Alt-R(注册商标)S.p.HiFi Cas9 Nuclease 3NLS，IDT公司)、0.8U/μL鼠源RNase抑制剂(RNase inhibitor murine，M0314，New England Biolabs公司)和R8缓冲液(以混合物的合计为10μL的方式添加)(组成见表2)混合，在30℃温育30分钟。加入10U限制酶SacI(pOri8的情况下)或XhoI(pMSR227的情况下)，在37℃温育1小时。需说明的是，反应液中各成分的浓度是相对于反应溶液的总体积的浓度。进行0.5％琼脂糖凝胶电泳，通过SYBR green I染色对DNA片段进行检测。

如图2B所示，卡那霉素抗性基因下游具有识别序列的gRNA_Km依赖性地，pOri8的超螺旋DNA被切割而直链化。SacI处理的结果是，正如预料的那样，通过9.5kb片段的切割，产生了5.6kb和3.8kb的片段。

此外，如图3B所示，Cas9和gRNA_Km依赖性地，pMSR227的超螺旋DNA被切割而直链化。XhoI处理的结果是，正如预料的那样，7.6kb片段消失。确认到用XhoI对7.6kb片段切割而产生的6.8kb片段与另一XhoI片段重合，条带变粗。

[实施例2]CRISPR-RCR

对于在RA反应后的DNA扩增反应中，是否通过在CRISPR-Cas9存在下进行RCR，能够抑制没有改变的模板DNA的扩增，特异性扩增目的连接产物进行确认(图4)。

首先，通过以下的反应将模板DNA(pOri8或pMSR227)用Cas9切割，直链化。将10ng/μL pOri8(9.5kb)或pMSR227(205kb)、100nM gRNA_Km、20nM Cas9、0.8U/μL RNaseinhibitor murine和R8缓冲液(以混合物的合计为5μL的方式添加)混合，在30℃温育30分钟。需说明的是，反应液中各成分的浓度是相对于反应液的总体积的浓度。

接下来，通过以下的RA反应，使Cas9切割片段与lacZ片段(通过下述方法制备)连接。将含有5ng Cas9切割片段的上述Cas9切割反应液(0.5μL)、lacZ片段(pOri8的情况下为1.7ng，pMSR227的情况下为0.09ng)、50ng/μL tRNA(R8759，西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司)、RA反应液(组成如下，以混合物的合计为5μL的方式添加)混合，在42℃温育1小时，然后在65℃温育2分钟后在冰上静置。需说明的是，反应液中各成分的浓度是相对于反应液的总体积的浓度。

lacZ片段的制备：以pPKOZ(Su’etsugu等Nucleic Acids Res.2017年11月16；45(20):11525-11534)为模板，使用引物SUE1510和SUE1511进行PCR，制备lacZ前体片段。以lacZ前体片段为模板，使用引物SUE1638和SUE1639进行PCR，制备具有与卡那霉素抗性基因下游的CRISPR-Cas9切割末端的60个碱基对(pOri8和pMSR227中共有的序列)相同的末端的lacZ片段。

[表1]

引物序列:将相同末端序列用大写字母表示

RA反应液的组成：1μM的野生型RecA(通过包括聚乙烯亚胺沉淀、硫酸铵沉淀、亲和柱色谱的工序，从RecA的大肠杆菌表达菌株纯化、制备。)、80mU/μL的核酸外切酶III(2170A，TAKARA Bio公司)、1U/μL的核酸外切酶I(M0293，New England Biolabs公司)、20mM的Tris-HCl(pH 8.0)、4mM的DTT、1mM的乙酸镁、50mM的谷氨酸钾、100μM的ATP、150mM的四甲基氯化铵(TMAC)、5质量％的PEG8000、10体积％的DMSO、20ng/μL的肌酸激酶(10127566001，西格玛奥德里奇公司)、4mM的磷酸肌酸。需说明的是，RA反应液中各成分的浓度是相对于RA反应液的总体积的浓度。

对于RA反应产物，如下所述进行RCR扩增反应。将RCR反应液ver.2(组成如下，需说明的是，RCR反应液ver.2中的各成分的浓度是相对于RCR反应液ver.2的总体积的浓度。以混合物的合计为4.5μL的方式添加)、100nM gRNA_Km和1nM Cas9混合，在30℃预温育30分钟。需说明的是，反应液中的gRNA_Km和Cas9的浓度是相对于反应液的总体积的浓度。在不存在CRISPR-Cas9时进行反应的情况下，不添加100nM gRNA_Km和1nM Cas9，加入等量RCR反应液ver.2。接下来，加入0.5μL RA反应产物，将在37℃温育1分钟和在24℃温育30分钟的循环进行40次，用R8缓冲液稀释5倍，进一步在30℃温育30分钟。将1μL RCR产物用于0.5％琼脂糖凝胶电泳，通过SYBR Green I染色进行检测。

[表2]

RCR反应液ver.2

表中，SSB表示大肠杆菌来源SSB，IHF表示大肠杆菌来源IhfA和IhfB的复合体，DnaG表示大肠杆菌来源DnaG，Clamp表示(大肠杆菌来源DnaN)，PolIII*表示大肠杆菌来源的作为由DnaX、HolA、HolB、HolC、HolD、DnaE、DnaQ和HolE构成的复合体的DNA聚合酶III*复合体，Dna B表示大肠杆菌来源DnaB，DnaC表示大肠杆菌来源DnaC，DnaA表示大肠杆菌来源DnaA，RNaseH表示大肠杆菌来源RNaseH，连接酶表示大肠杆菌来源DNA连接酶，PolI表示大肠杆菌来源DNA聚合酶I，GyrA表示大肠杆菌来源GyrA，GyrB表示大肠杆菌来源GyrB，TopoIV表示大肠杆菌来源的ParC和ParE的复合体，Topo III表示大肠杆菌来源拓扑异构酶III，RecQ表示大肠杆菌来源RecQ，RecG表示大肠杆菌来源RecG，RecJ表示大肠杆菌来源RecJ，ExoI表示大肠杆菌来源ExoI，ExoIII表示大肠杆菌来源ExoIII。

SSB通过包括硫酸铵沉淀和离子交换柱色谱的工序，由SSB的大肠杆菌表达菌株纯化、制备。

IHF通过包括硫酸铵沉淀和亲和柱色谱的工序，由IhfA和IhfB的大肠杆菌共表达菌株纯化、制备。

DnaG通过包括硫酸铵沉淀、阴离子交换柱色谱和凝胶过滤柱色谱的工序，由DnaG的大肠杆菌表达菌株纯化、制备。

夹(Clamp)通过包括硫酸铵沉淀、阴离子交换柱色谱的工序，由DnaN(Clamp)的大肠杆菌表达菌株纯化、制备。

PolIII*通过包括硫酸铵沉淀、亲和柱色谱和凝胶过滤柱色谱的工序，由DnaX、HolA、HolB、HolC、HolD、DnaE、DnaQ和HolE的大肠杆菌共表达菌株纯化、制备。

DnaB、DnaC通过包括硫酸铵沉淀、亲和柱色谱和凝胶过滤柱色谱的工序，由DnaB和DnaC的大肠杆菌共表达菌株纯化、制备。

DnaA通过包括硫酸铵沉淀、透析沉淀和凝胶过滤柱色谱的工序，由DnaA的大肠杆菌表达菌株纯化、制备。

GyrA、GyrB通过包括硫酸铵沉淀、亲和柱色谱和凝胶过滤柱色谱的工序，由GyrA的大肠杆菌表达菌株与GyrB的大肠杆菌表达菌株的混合物纯化、制备。

Topo IV通过包括硫酸铵沉淀、亲和柱色谱和凝胶过滤柱色谱的工序，由ParC的大肠杆菌表达菌株和ParE的大肠杆菌表达菌株的混合物纯化、制备。

Topo III通过包括硫酸铵沉淀和亲和柱色谱的工序，由Topo III的大肠杆菌表达菌株纯化、制备。

RecQ通过包括硫酸铵沉淀、亲和柱色谱和凝胶过滤柱色谱的工序，由RecQ的大肠杆菌表达菌株纯化、制备。

RecG通过包括硫酸铵沉淀、亲和柱色谱的工序，由RecG的大肠杆菌表达菌株纯化、制备。

RecJ使用市售的酶(M0264，New England Biolabs公司)。

ExoI使用市售的酶(参照前述RA反应液的组成)。

ExoIII使用市售的酶(参照前述RA反应液的组成)。

RNaseH、连接酶、PolI使用市售的大肠杆菌来源的酶(宝生物株式会社)。

此外，通过将RCR产物转化至大肠杆菌、进行菌落的蓝白判断，从而调查RCR产物中的lacZ插入产物的比例。关于pOri8，将1μL RCR产物用TE缓冲液稀释10倍，使用其中的1μL，通过化学法转化大肠杆菌菌株DH5α。关于pMSR227，将1μL RCR产物用TE缓冲液稀释10倍，使用其中的2μL，通过电穿孔法转化大肠杆菌菌株HST08。将转化后的大肠杆菌涂布在相对于LB平板的总体积含有50μg/mL卡那霉素、0.1mM(mmol/L)IPTG、40μg/mL X-gal的LB平板上，在37℃过夜培养。对蓝色菌落的数量相对于总菌落数的比例进行计数。

将结果示于图5。在pOri8的情况下，作为目的lacZ插入产物的13kb超螺旋DNA RA依赖性地RCR扩增。改变前的9.5kb超螺旋DNA的扩增在gRNA和Cas9存在下受到抑制。转化菌落的蓝白判断结果中，不存在gRNA+Cas9时低于6％的蓝色菌落的比例(图中的“Bluecolony”)在gRNA+Cas9存在下也上升至95％。需说明的是，图中，“投入(Input)”表示的是未进行RCR扩增的样品。

此外，在pMSR227的情况下，通过gRNA+Cas9存在下的RCR，被认为是目的lacZ插入产物的208kb超螺旋DNA得到扩增。此外，转化菌落的蓝白判断结果中，不存在gRNA+Cas9时为0％的蓝色菌落的比例上升至13个菌落中的12菌落，确认高效获得了目的lacZ插入产物。

进一步，从由对pMSR227(205kb)进行lacZ(3.3kb)插入改变的样品得到的蓝色菌落提取质粒，进行限制酶XhoI切割产生的结构确认(图6A)。正如预料的那样，改变前观察到的7.6kb的片段消失，11kb附近的条带变浓，确认为lacZ插入产物(图6B)。

[实施例3]长链DNA的无细胞合成

使用RCR扩增法和RA连接法，使2个长链环状DNA连接，进行更长的环状DNA的扩增(图7)。

首先，通过以下方法分别将pOri80(85kb)和pOri93Cm(94kb)用CRISPR-Cas9在特定部位进行切割，直链化。将10ng/μL pOri80(85kb)或pOri93Cm(94kb)、100nM gRNA_Km(pOri80的情况下)或gRNA_007(pOri93Cm的情况下，按照IDT公司Alt-R(注册商标)CRISPR-Cas9系统制备的向导RNA，识别序列：CCUUUAGUUACAACAUACUC(序列编号2))、20nM Cas9、0.8U/μL鼠源RNase抑制剂和R8缓冲液(以混合物的合计为5μL的方式添加)混合，在30℃温育30分钟。需说明的是，反应液中各成分的浓度是相对于反应液的总体积的浓度。

其中，pOri93Cm通过以下方法制备。通过RA，使大肠杆菌株(DGF-298WΔ100::revΔ234::SC)基因组DNA的XbaI消化产物中93kb的基因组片段与包含oriC和氯霉素抗性基因的连接用片段(Cm-oriC片段，1.3kb，序列编号11)连接，形成环状。Cm-oriC片段两个末端的60个碱基对的序列分别与93kb的基因组片段的两个末端为同源序列。对环状DNA进行RCR扩增后，转化大肠杆菌，将从得到的大肠杆菌菌落纯化的超螺旋质粒作为pOri93Cm。

使用lacZ接头(3.4kb)和Am接头(1.1kb)，如下所述使得到的2个长链DNA片段进行RA反应，进行连接。将5ng(0.5μL)pOri80 Cas9切割片段、5ng(0.5μL)pOri93Cm Cas9切割片段、lacZ接头(3.4kb，27pg)、Am接头(1.1kb，86ng)、50ng/μL tRNA、RA反应液(参照实施例2，以混合物的合计为5μL的方式添加)混合，在42℃温育3小时、然后在65℃温育2分钟，然后在冰上静置。需说明的是，反应液中各成分的浓度是相对于反应液的总体积的浓度。

其中，各接头两个末端的60个碱基对的序列与2个长链DNA片段的两个末端为同源序列，利用RA，4个片段连接环化，形成全长183kb的DNA(图7)。

lacZ接头是以pPKOZ为模板、使用引物SUE175和SUE1823进行PCR而制备的。

Am接头是以pUC4K质粒(GE Healthcare)为模板、使用引物SUE1753和SUE1822进行PCR而制备的。

连接环化后，如下所述进行RCR扩增反应。将RCR反应液ver.2(以混合物的合计为4.5μL的方式添加)、100nM gRNA_Km、100nM gRNA_007和2nM Cas9混合，在30℃预温育30分钟。需说明的是，反应液中的gRNA_Km、gRNA_007和Cas9的浓度是相对于反应液的总体积的浓度。在不存在CRISPR-Cas9时进行反应的情况下，不添加100nM gRNA_Km、100nM gRNA_007和2nM Cas9，加入等量RCR反应液ver.2。接下来，加入0.5μL RA反应产物，将在37℃温育1分钟和在24℃温育30分钟的循环进行40次，用R8缓冲液稀释5倍，在30℃进一步温育30分钟。将1μL RCR产物用于0.5％琼脂糖凝胶电泳，通过SYBR Green I染色进行检测。

此外，通过将RCR产物转化至大肠杆菌、进行菌落的蓝白判断，调查RCR产物中的目的连接产物的比例。将1μL RCR产物用TE缓冲液稀释10倍，使用其中的2μL，通过电穿孔法转化大肠杆菌菌株HST08。将转化后的大肠杆菌涂布在相对于LB平板的总体积含有12.5μg/mL氯霉素、0.1mM IPTG、40μg/mL X-gal的LB平板上，在37℃过夜培养。对蓝色菌落的数量相对于总菌落数的比例进行计数(Blue colony)。

将结果示于图8。在不存在gRNA和Cas9时进行RCR的情况下，主要扩增的是改变前的94kb和85kb的超螺旋DNA。而在gRNA和Cas9存在下进行RCR的情况下，94kb和85kb的DNA扩增受到抑制，观察到大小与作为对照进行RCR扩增的205kb超螺旋DNA(pMSR227)接近的DNA扩增。需说明的是，图中，“投入(Input)”表示的是RCR扩增前的样品。

使用该扩增产物转化大肠杆菌，通过蓝白判断检测氯霉素抗性菌落中具有lacZ基因的菌落，结果，21个菌落全部为目的蓝色菌落(图中的“Cm平板上的蓝色菌落(Bluecolony on Cm plate)”)。

选择得到的蓝色菌落中的8个，从其中提取质粒，利用琼脂糖凝胶电泳确认大小，结果，全部为接近预测的205kb超螺旋DNA的大小(图9)。

进一步将得到的质粒中的1个(命名为pOri183)用限制酶SacI切割，通过进行脉冲场凝胶电泳确认其结构(图10)。得到与由碱基序列预测的切割图谱(条带右侧所示大小)大体一致的结果。需说明的是，作为大小标准，不仅同时进行梯度标记(Ladder marker)的电泳，而且同时进行结构已知的pMSR227超螺旋(SC)产物和其XhoI切割产物的电泳。

[实施例4]与RCR结合的碱基替换导入方法的构建

首先，调查是否可将使用寡聚DNA的碱基替换导入方法应用于RCR。

将实验体系示于图11B和12。lacZ突变pPKOZ(pPKOZins和pPKOZmis，图11A)以pPKOZ(8.8kb)为模板，通过QuikChange PCR法来制备。

pPKOZins的制备中，使用SUE818和SUE819作为引物。pPKOZins是lacZ编码区域具有一个碱基的插入的质粒(图12)。由于移码突变，野生型lacZ不表达，因此用pPKOZins转化的大肠杆菌的菌落在蓝白判断中不呈蓝色(图11B)。

pPKOZmis的制备中，使用SUE1415和SUE1416作为引物。pPKOZmis是lacZ编码区域具有一个碱基的替换的质粒(图12)。由于无义突变，野生型lacZ不表达，因此用pPKOZmis转化的大肠杆菌的菌落在蓝白判断中不呈蓝色(图11B)。

作为用于使这些突变型lacZ恢复野生型的寡聚DNA，使用SUE1354～SUE1357。

[表3]

引物序列:将替换(插入)碱基用大写字母表示

以具有lacZ移码突变的pPKOZins为模板，如下所述，在20～60mer的改变用寡聚DNA存在下进行RCR反应。将RCR反应液ver.1(组成如下，需说明的是，RCR反应液ver.1中的各成分的浓度是相对于RCR反应液ver.1的总体积的浓度，以混合物的合计为5μL的方式添加)、1或3μM改变用寡聚DNA(20～60mer)和75pg/μL pPKOZins混合，在30℃温育18小时。需说明的是，反应液中各成分的浓度是相对于反应液的总体积的浓度。将1μL RCR产物用于0.5％琼脂糖凝胶电泳，通过SYBR Green I染色进行检测。

[表4]

RCR反应液ver.1(不含促进因子)

RCR反应液ver.1的各成分与RCR反应液ver.2是同样的。

此外，通过将RCR产物转化至大肠杆菌、进行菌落的蓝白判断，调查RCR产物中的lacZ突变变为野生型的产物的比例。使用0.25μL RCR产物，通过化学法转化大肠杆菌菌株DH5α。将转化后的大肠杆菌涂布在含有25μg/mL卡那霉素、0.1mM IPTG、40μg/mL X-gal的LB平板上，在37℃过夜培养。对蓝色菌落相对于总菌落数的数量进行计数。

将结果示于图13A和图13B。除了加入3μM的40mer或60mer改变用寡聚DNA的情况以外，均观察到充分的扩增(图13A)。图中，“投入(Input)”是加入3.8ng模板DNA。

此外，进行大肠杆菌转化菌落的蓝白判断，结果确认到，加入了1μM 60mer改变用寡聚物的样品中，lacZ突变最高以5.5％的效率变成野生型(图13B)。

[实施例5]寡聚DNA 60mer浓度研究(ins/mis)

为了改善改变效率，进行寡聚DNA的使用浓度的研究。

通过以下方法，以pPKOZins或pPKOZmis为模板，在不同浓度的60mer的改变用寡聚DNA存在下进行RCR反应。将RCR反应液ver.1(以混合物的合计为5μL的方式添加)、0～3μM60mer的改变用寡聚DNA(SUE1357)、75pg/μL pPKOZins或14pg/μL pPKOZmis混合，在30℃温育19小时。将1μL RCR产物用于0.5％琼脂糖凝胶电泳，通过SYBR Green I染色进行检测。

此外，通过将RCR产物转化至大肠杆菌、进行菌落的蓝白判断，调查RCR产物中的lacZ突变变为野生型的产物的比例。使用0.25μL的RCR产物，通过化学法转化大肠杆菌菌株DH5α。将转化后的大肠杆菌涂布在相对于LB平板的总体积含有25μg/mL卡那霉素、0.1mMIPTG、40μg/mL X-gal的LB平板上，在37℃过夜培养。对蓝色菌落相对于总菌落数的数量进行计数。

将结果示于图14A和图14B。图14A中，“投入(Input)”是加入3.8ng pPKOZins、0.72ng pPKOZmis。大肠杆菌转化菌落的蓝白判断结果确认到，pPKOZins或pPKOZmis中的任一个在加入了0.3μM的改变用寡聚DNA的样品中lacZ突变均以最高20％以上的效率变成野生型(图14B)。

[实施例6]使用CRISPR-Cas9的ROGE的高效化

在与实施例5同样的实验体系中，通过在CRISPR-Cas9存在下进行RCR，研究lacZ突变变成野生型的效率是否提高。

如下所述，以pPKOZins为模板，在0.3μM的60mer的改变用寡聚DNA存在下进行RCR反应。将RCR反应液ver.1(以混合物的合计为5μL的方式添加)、0.3μM 60mer的改变用寡聚DNA(SUE1357)、0～20nM Cas9、100nM gRNA_Zins(按照IDT公司Alt-R(注册商标)CRISPR-Cas9系统制备的向导RNA，识别序列：ACCAUGAUUACGGAUUCACU(序列编号20)、7.5fg/μLpPKOZins混合，在30℃温育21小时。需说明的是，反应液中各成分的浓度是相对于反应液的总体积的浓度。用R8缓冲液稀释5倍，在30℃进一步温育30分钟。将2.5μL RCR产物用于0.5％琼脂糖凝胶电泳，通过SYBR Green I染色进行检测。

其中，gRNA_Zins是特异性识别改变前的lacZins序列的向导RNA。

此外，通过将RCR产物转化至大肠杆菌、进行菌落的蓝白判断，调查RCR产物中的lacZ突变变为野生型的产物的比例。使用0.25μL RCR产物，通过化学法转化大肠杆菌菌株DH5α。将转化后的大肠杆菌涂布在相对于LB平板的总体积含有25μg/mL卡那霉素、0.1mMIPTG、40μg/mL X-gal的LB平板上，在37℃过夜培养。对蓝色菌落相对于总菌落数的数量进行计数。

将结果示于图15A和图15B。不存在改变用寡聚DNA时，通过添加Cas9和gRNA_Zins这两者，利用RCR进行的超螺旋DNA的扩增受到显著抑制(图15A)。而在改变用寡聚DNA的存在下，即使添加CRISPR-Cas9，也可检测到扩增的超螺旋DNA产物(图15A)。此外，转化菌落的蓝白判断结果确认，通过Cas9和gRNA_Zins的添加，在改变用寡聚DNA的存在下，几乎全部扩增产物都变成了lacZ野生型(图15B)。

[实施例7]长链DNA ROGE

在与实施例5同样的实验体系中，研究是否可将使用寡聚DNA的碱基替换导入方法应用于长链DNA的RCR。

如下所述，以具有lacZins突变的101kb的含有oriC的环状DNA(pOri93Zins)(图16A)为模板进行RCR反应。将RCR反应液ver.1(以混合物的合计为5μL的方式添加)、0～3μM60mer的改变用寡聚DNA(SUE1357)、3ng/μLλDNA(Lambda DNA)、0.67pM pOri93Zins混合，在33℃温育18小时后，用R8缓冲液稀释5倍，在30℃进一步温育30分钟。需说明的是，反应液中各成分的浓度是相对于反应液的总体积的浓度。将2.5μL RCR产物用于0.5％琼脂糖凝胶电泳，通过SYBR Green I染色进行检测。

其中，pOri93Zins通过以下方法制备。通过RA，使大肠杆菌株(DGF-298WΔ100::revΔ234::SC)的基因组DNA的XbaI消化产物中93kb的基因组片段与包含oriC、卡那霉素抗性基因和lacZins突变基因的连接用片段(KOZins片段)连接环化。KOZins片段(8.6kb)是，以pKOZins为模板，使用引物SUE1745和SUE1746，通过PCR制备的。KOZins片段两个末端的序列分别与93kb的基因组片段的两个末端为同源序列。通过RCR对RA后的环状DNA进行扩增后，转化至大肠杆菌，将从得到的大肠杆菌菌落纯化的超螺旋质粒作为pOri93Zins。

[表5]

引物序列:将相同末端序列用大写字母表示

此外，通过将RCR产物转化至大肠杆菌、进行菌落的蓝白判断，调查RCR产物中的lacZ突变变为野生型的产物的比例。使用0.2μL的RCR产物，通过电穿孔法转化大肠杆菌菌株HST08。将转化后的大肠杆菌涂布在相对于LB平板的总体积含有25μg/mL卡那霉素、0.1mMIPTG、40μg/mL X-gal的LB平板上，在37℃过夜培养。对蓝色菌落相对于总菌落数的数量进行计数。

将结果示于图16B和图16C。改变用寡聚DNA的浓度为1μM以上的情况下，确认到扩增反应的抑制(图16B)。需说明的是，图16B中，“投入(Input)”是加入0.02ng模板DNA。

此外，转化菌落的蓝白判断结果表明，在0.3μM的改变用寡聚DNA存在下，5.4％的扩增产物中，lacZins突变变为lacZ野生型(图16C)。

[实施例8]使用CRISPR-Cas9的长链DNA ROGE的高效化

在与实施例6同样的实验体系中，研究利用CRISPR-Cas9的改变效率的提高是否可应用于长链DNA的RCR。

以进行了将不需要的直链状DNA除去的处理的pOri93Zins环状DNA为模板，如下所述，在0.3μM的60mer的改变用寡聚DNA存在下进行RCR反应。

将RCR反应液ver.1(以混合物的合计为5μL的方式添加)、0.3μM 60mer改变用寡聚DNA(SUE1357)、3ng/μLλDNA(Lambda DNA)、10nM Cas9、100nM gRNA_Zins(按照IDT公司Alt-R(注册商标)CRISPR-Cas9系统制备的向导RNA，识别序列：ACCAUGAUUACGGAUUCACU(序列编号20)、1pM pOri93Zins混合。需说明的是，反应液中各成分的浓度是相对于反应液的总体积的浓度。接下来，按37℃1分钟→24℃30分钟的温度循环温育40个循环后，用R8缓冲液稀释5倍，在30℃进一步温育30分钟。将2.5μL RCR产物用于0.5％琼脂糖凝胶电泳，通过SYBRGreen I染色进行检测。

此外，通过将RCR产物转化至大肠杆菌、进行菌落的蓝白判断，调查RCR产物中的lacZ突变变为野生型的产物的比例。使用0.2μL RCR产物，通过电穿孔法转化大肠杆菌菌株HST08。将转化后的大肠杆菌涂布在相对于LB平板的总体积含有25μg/mL卡那霉素、0.1mMIPTG、40μg/mL X-gal的LB平板上，在37℃过夜培养。对蓝色菌落相对于总菌落数的数量进行计数。

将结果示于图17A和图17B。不存在改变用寡聚DNA时，通过添加Cas9和gRNA_Zins这两者，利用RCR进行的超螺旋DNA的扩增受到显著抑制(图17A)。而在改变用寡聚DNA存在下，即使添加CRISPR-Cas9，也可检测到扩增的超螺旋DNA产物(图17A)。

此外，转化菌落的蓝白判断结果确认，通过Cas9和gRNA_Zins的添加，在改变用寡聚DNA存在下，几乎全部扩增产物变成了lacZ野生型(图17B)。

[实施例9]多个碱基替换和插入

在与实施例5同样的实验体系中，研究是否能使用改变用寡聚DNA对多个碱基进行替换或插入。

多个碱基替换中，以pPKOZins为模板，使用利用3个碱基的替换形成同义密码子的改变用寡聚DNA。pPKOZins具有lacZ编码区域一个碱基的插入导致的移码突变，大肠杆菌菌落呈白色。改变用寡聚物的3个碱基替换部位附近包含使该1个碱基插入恢复野生型序列的序列。预测由于改变而呈野生型(蓝色大肠杆菌菌落)的质粒同时导入了3个碱基的替换(图18A)。

另一方面，多个碱基插入中，以pPKOZ为模板，使用通过4个碱基的插入产生EcoRI识别序列的改变用寡聚物(图18B)。通过4个碱基的插入导入移码突变，lacZ基因不合成，因此预测大肠杆菌的菌落呈白色。需说明的是，pPKOZ已经具有1处EcoRI位点(图18F)，因此，由于4个碱基的插入，质粒具有2处EcoRI位点(图18G)。

以pPKOZins或pPKOZ为模板，如下所述在不同浓度的改变用寡聚DNA存在下进行RCR反应。将RCR反应液ver.1(以混合物的合计为5μL的方式添加)、0μM～0.6μM 60mer改变用寡聚DNA(SUE4386或SUE4387)、50pg/μL pPKOZins或pPKOZ混合。需说明的是，反应液中各成分的浓度是相对于反应液的总体积的浓度。接下来，将反应液在33℃温育18小时后，用R8缓冲液稀释5倍，在30℃进一步温育30分钟。将2.5μL RCR产物用于0.5％琼脂糖凝胶电泳，通过SYBR Green I染色进行检测。

[表6]

引物序列:将相同末端序列用大写字母表示

此外，通过将RCR产物转化至大肠杆菌、进行菌落的蓝白判断，使用pPKOZins的情况下，调查蓝色菌落的比例；使用pPKOZ的情况下，调查白色菌落的比例。使用0.25μL RCR产物，通过化学法转化大肠杆菌菌株DH5α。将转化后的大肠杆菌涂布在相对于LB平板的总体积含有25μg/mL卡那霉素、0.1mM IPTG、40μg/mL X-gal的LB平板上，在37℃过夜培养。对蓝色菌落或白色菌落相对于总菌落数的数量进行计数。

将结果示于图18C、图18D和图18E。大肠杆菌转化菌落的蓝白判断结果确认，不管具有pPKOZins或pPKOZ中的哪一个，在加入了0.3μM改变用寡聚DNA的样品中，lacZ均以最高的效率(分别为7.3％、3.6％)改变(图18D和图18E)。

为了确认实际已变为目的序列，对从以pPKOZins为模板的改变实验中的蓝色菌落得到的4个质粒进行序列分析，结果，全部导入了作为目的的3个碱基的替换。

此外，对于从以pPKOZ为模板的4个碱基插入实验中的白色菌落得到的7个质粒，通过以下那样的限制酶处理，确认到4个碱基的插入。将10×H buffer(以混合物的合计为20μL的方式添加)、0.75U/μL EcoRI、质粒各2μL混合，在37℃温育1小时。对于从预测为未改变的蓝色菌落得到的质粒，也进行同样的限制酶处理。将4μL限制酶处理产物用于0.5％琼脂糖凝胶电泳，通过SYBR Green I染色进行检测。

将结果示于图18H。进行了限制酶处理的7个改变质粒中，全部如预料的那样，检测到2处切割产生的2个片段，确认变成了作为目的的4个碱基插入序列。未改变的质粒(wt)中仅检测到1处切割(图18H)。

[实施例10]多处同时碱基替换

利用紫色杆菌素的生物合成通路，进行以下那样的试验。紫色杆菌素是利用5个基因产物(vioA、vioB、vioC、vioD、vioE)基于色氨酸产生的次生代谢产物。在大肠杆菌中，5个基因全部功能齐备的情况下，菌落呈紫色(图19B)。vioC缺失则产生紫色杆菌素生物合成中间产物的菌落呈黑褐色(图19B)。此外，vioA缺失或vioA、vioC双重缺失则不合成呈色产物，菌落保持白色(图19B)。利用这样的菌落颜色变化，对于vioA、vioC双重缺失突变质粒，通过对vioA和vioC这2处分开的区域同时进行碱基替换，尝试以紫色菌落出现为指标，检测vioA、vioC是否恢复为野生型质粒。

所用的质粒pK3OV_insAC在vioA和vioC的编码区域分别有一个碱基的插入(图19A)。该pK3OV_insAC是通过以pK3OV为模板、连续两次实施与RCR反应结合的1个碱基插入而制备的。第一次，使用SUE4384(序列编号64)作为寡聚DNA，在vioC中进行1个碱基的插入，从产生的黑褐色菌落制备质粒pK3OV_insC，接着，第二次，以pK3OV_insC为模板，使用SUE4579(序列编号63)在vioA中导入1个碱基的插入，从生成的白色菌落制备质粒pK3OV_insAC。由于移码突变，vioA和vioC没有表达，因此用pK3OV_insAC转化的大肠杆菌的菌落为白色，不呈色。

pK3OV通过下述方法制备：通过RA反应，使pETM6-vioABECD(Jones等,Sci.Rep.(2015)5,11301)的编码vioABECD基因的DNA区域与包含序列编号67所示oriC、卡那霉素抗性基因和LacI的3.5kb的DNA片段连接环化。

作为使该突变型vioA和vioC恢复野生型的寡聚DNA，使用SUE4577(序列编号65)和SUE4381(序列编号66)(图19C和图19D)。

以在vioA和vioC中具有移码突变的pK3OV_insAC为模板，如下所述进行RCR反应。将RCR反应液ver.1(以混合物的合计为5μL的方式添加)、0.15μM60mer改变用寡聚DNA(SUE4577和SUE4381)以及50pg/μL pK3OV_insAC混合，在33℃温育6小时、12小时或18小时。需说明的是，反应液中各成分的浓度是相对于反应液的总体积的浓度。

[表7]

引物序列:将相同末端序列用大写字母表示

然后，将RCR产物转化至大肠杆菌，通过进行菌落的颜色判断，调查RCR产物中的vioA和vioC突变为变成野生型的产物的比例。直接使用1μL RCR产物，通过化学法转化大肠杆菌BL21 Star(DE3)菌株(Thermo Fisher Scientific公司)。将转化后的大肠杆菌涂布在相对于LB平板的总体积含有25μg/mL卡那霉素和10μM IPTG的LB平板上，在30℃过夜培养。对紫菌落相对于总菌落数的数量进行计数。

将结果示于图19E。在各时间内用RCR产物转化大肠杆菌，结果以0.3％～0.7％左右的效率检测到紫色的菌落。由此确认到，vioA突变和vioC突变这两处同时变成了野生型(图19E)。

产业可利用性

根据本实施方式的方法，可以提供不使用细胞的、扩增DNA编辑产物、特别是长链DNA编辑产物的方法等。

序列表自由文本

序列编号1：gRNA_Km

序列编号2：gRNA_007

序列编号3：SUE1510

序列编号4：SUE1511

序列编号5：SUE1638

序列编号6：SUE1639

序列编号7：SUE1753

序列编号8：SUE1756

序列编号9：SUE1822

序列编号10：SUE1823

序列编号11：Cm-oriC片段

序列编号12：SUE818

序列编号13：SUE819

序列编号14：SUE1415

序列编号15：SUE1416

序列编号16：SUE1354

序列编号17：SUE1355

序列编号18：SUE1356

序列编号19：SUE1357

序列编号20：gRNA_Zins

序列编号21：SUE1745

序列编号22：SUE1746

序列编号23：ter序列(共有序列)

序列编号24：ter序列(共有序列)

序列编号25：ter序列(terA、B、D、E或H)

序列编号26：ter序列(terA、B、D、E或H)

序列编号27：ter序列(terC)

序列编号28：ter序列(terF)

序列编号29：ter序列(terG)

序列编号30：ter序列(terI)

序列编号31：ter序列(tarJ)

序列编号32：ter序列(芽孢杆菌，共有序列)

序列编号33：ter序列(枯草芽孢杆菌，共有序列)

序列编号34：ter序列(枯草芽孢杆菌，共有序列)

序列编号35：ter序列(terVII)

序列编号36：ter序列(terIX)

序列编号37：被XerCD识别的序列(共有序列)

序列编号38：被XerCD识别的序列(共有序列，dif和cer)

序列编号39：被XerCD识别的序列(共有序列，dif和psi)

序列编号40：被XerCD识别的序列(共有序列，cer和psi)

序列编号41：dif序列

序列编号42：cer序列

序列编号43：psi序列

序列编号44：dif序列

序列编号45：cer序列

序列编号46：psi序列

序列编号47：loxP共有序列

序列编号48：lox511序列

序列编号49：lox2272序列

序列编号50：loxFAS序列

序列编号51：lox RE序列

序列编号52：lox LE序列

序列编号53：FRT序列

序列编号54：rox序列

序列编号55：外末端(Outside End，OE)序列

序列编号56：SUE4386

序列编号57：SUE4387

序列编号58：lacZ wt起始密码子下游的部分序列

序列编号59：lacZ ins起始密码子下游的部分序列

序列编号60：lacZ mis起始密码子下游的部分序列

序列编号61：pPKOZins起始密码子附近的部分序列

序列编号62：pPKOZ起始密码子附近的部分序列

序列编号63：SUE4579

序列编号64：SUE4384

序列编号65：SUE4577

序列编号66：SUE4381

序列编号67：pK3OV制作用DNA片段(3.5kb)

序列编号68：vioA ins

序列编号69：vioC ins