一种用于同时检测猫细小病毒和猫艾滋病毒的荧光定量PCR检测引物、探针和试剂盒

摘要

本发明公开一种用于同时检测猫细小病毒和猫艾滋病毒的荧光定量PCR检测引物、探针和试剂盒。通过将猫细小病毒NS1基因序列和猫艾滋病毒pol基因序列进行比对后，发现二者基因序列无交叉，同源性较低。因此根据二者序列设计特异性的探针和引物，通过荧光定量PCR扩增对猫细小病毒和猫艾滋病毒进行诊断。并且将该引物和探针制备成试剂盒用于同时检测猫细小病毒和猫艾滋病毒。本发明全程只需要2h左右，时间较短，并且该试剂盒操作简单，灵敏度高，特异性较好，并且能同时检测到猫细小病毒和猫艾滋病毒，能避免对其中一种病毒检测的遗漏。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及猫细小病毒和猫艾滋病毒的荧光定量PCR检测引物、探针和试剂盒。

背景技术

猫细小病毒又被称为猫泛白细胞减少症病毒、猫瘟病毒或猫传染性肠炎病毒，主要以高热、呕吐、白细胞严重减少和肠炎为特征，是危害猫科动物的主要疾病之一。1982年欧美科学家发现猫细小病毒，并于1957年Bilin首次分离出该病毒，随后于1964年Johnson从一头疑似患有猫传染性肠炎症状的豹脾脏中同样分离出了该病毒。猫细小病毒主要侵染胃肠道组织的黏膜上皮细胞，造成细胞的病变和死亡，由该病毒引起的猫泛白细胞减少症的临床表现有多种，可分为特急性型、急性型、亚急性型和不显性型。特急性型为突然死亡，无临床症状；急性型为24h内死亡；亚急性型在一周左右死亡，伴随发热、呕吐、厌食和脱水等症状。通过一系列病原学研究，证明了猫细小病毒在自然条件下容易感染猫科和鼬科等多种动物，其中水貂最为易感。由猫细小病毒引起的猫泛白细胞传染症现今在世界各地均有分布。目前，针对猫细小病毒的预防主要是疫苗的接种，包括灭活病毒疫苗和减毒活疫苗。其中，灭活病毒疫苗的安全性较高，但是不如减毒活疫苗的临床效果好。针对预防该病毒的疫苗在欧洲的一些国家已商品化，但是针对该病毒的诊断试剂却参差不齐。因此，建立一种快速、准确的用于检测猫细小病毒的方法显得尤为重要。

猫艾滋病毒属于属反转录病毒，慢病毒。1987年，该病毒在美国加利福尼亚首次从免疫力低下的猫中被分离。其具有严格的宿主性，只感染猫，并经由咬伤而感染。该病毒的感染阶段包括急性期、无症状带毒期、持续性淋巴腺病、艾滋病相关复合症和FAIDS阶段。FIV可以感染CD4+、CD8+、T细胞、B细胞和巨噬细胞，自从1985年以来，在世界范围内较为流行且具有较强的突变性。针对其治疗方式，目前无有效疫苗，主要是控制继发感染和缓解临床症状。因此，建立一种快速准确检测猫艾滋病毒的方法尤为重要，可为临床诊断和治疗提供技术支持。

发明内容

本发明目的是在于针对现有技术的不足，提供一种同时检测猫细小病毒和猫艾滋病毒的荧光定量PCR引物、探针和试剂盒。通过将猫细小病毒NS1基因序列和猫艾滋病毒pol基因序列进行比对后，发现二者基因序列无交叉，同源性较低。因此根据二者序列设计特异性的探针和引物，通过荧光定量PCR扩增对猫细小病毒和猫艾滋病毒进行诊断。并且将该引物和探针制备成试剂盒用于同时检测猫细小病毒和猫艾滋病毒。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

第一方面，本发明提供了一种猫细小病毒和猫艾滋病毒的荧光定量PCR检测引物组，包括上游引物和下游引物。

针对猫细小病毒的荧光定量PCR检测上游引物和下游引物，序列分别如下：

上游引物：5’-GGCAAGCAATCCTCAGAGTC-3’，如SEQ ID NO.1所示；

下游引物：5’-GAGTACTCCACGGTTCCAGT-3’，如SEQ ID NO.2所示；

针对猫艾滋病毒的荧光定量PCR检测上游引物和下游引物，序列如下：

上游引物：5’-ACATTCCAGAACAGCCCACT-3’，如SEQ ID NO.3所示；

上游引物：5’-TGTACTTCCAGTCGAGCTTCT-3’，如SEQ ID NO.4所示；

第二方面，本发明提供了一种猫细小病毒和猫艾滋病毒的荧光定量PCR检测探针，其序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

针对猫细小病毒的荧光定量PCR检测探针，序列如下：

5’-HEX-ACTCCGGACGTAGTGGACCTTGC-BHQ-3’，如SEQ ID NO.5所示；

针对猫艾滋病毒的荧光定量PCR检测探针，序列如下：

5’-FAM-TGGGCTAGCCAAGCTATTCCAGACTTG-TAMRA-3’，如SEQ ID NO.6所示；

优选地，所述探针5’端结合荧光报告基团，3’端结合荧光淬灭基团，所用于检测猫细小病毒的探针其荧光报告基团类型为HEX，荧光淬灭基团类型为BHQ，所用于检测猫艾滋病毒的探针其荧光报告基团类型为FAM，荧光淬灭基团类型为TAMRA。

在qPCR扩增过程中，当探针完整时，其荧光基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；当扩增开始时，在Taq酶的5'-3'外切酶的作用下，探针被酶切降解，荧光基团和淬灭基团分离开来，因此荧光监测系统可以检测到荧光信号。荧光定量PCR仪根据接收的荧光信号扩增曲线，从而对猫细小病毒和猫艾滋病毒的核酸进行检测来诊断疾病。根据是否出现S型扩增曲线实现定性检测，其次根据不同稀释级标准品的Ct值和浓度绘制标准曲线，以样本Ct值计算出样本浓度实现定量检测。

第三方面，本发明提供了一种用于同时检测猫细小病毒和猫艾滋病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包括以上序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的引物和如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的探针。

一种同时检测猫细小病毒和猫艾滋病毒的荧光定量试剂盒还包括2×PremixExTaq Probe qPCR、阳性对照和阴性对照；其中2×Premix ExTaq Probe qPCR包括TakaraEx TaqHS、Mg

除此之外，所述的荧光定量检测试剂盒还包括核酸提取试剂；其中核酸提取试剂包括Proteinase K、BufferAL、BufferAW1、BufferAW2和BufferAE。

第四方面，本发明提供了一种非诊断目的的用于同时检测猫细小病毒和猫艾滋病毒的荧光定量PCR检测方法，主要操作步骤包括：核酸提取和qPCR扩增。

(1)核酸提取：使用QIAamp DNAMini Kit提取DNA；具体操作步骤为：

样品中依次加入20μL蛋白酶K、200μL缓冲液AL，涡旋振荡15s混匀；70℃孵育10min，离心后加入200μL无水乙醇，漩涡15s后离心，将上清液加入到含有QIAamp Minispin column的收集管中，以8000r/min的速度离心1min，弃去上清；将QIAamp Mini spincolumn置于新收集管中，加入500μL缓冲液AW1，以8000r/min的速度离心1min，弃去上清；再将QIAamp Mini spin column置于新收集管中，加入500μL缓冲液AW2，以14000r/min的速度离心1min，弃去上清；将QIAamp Mini spin column置于新收集管中，全速离心1min；将QIAamp Mini spin column置于新收集管中，加入200μL缓冲液AE，室温孵育1min，以8000r/min的速度离心1min以洗脱DNA；将提取的DNA保存于-80℃。

(2)qPCR扩增：

反应总体积为20μL，其中包括DNA模板2μL，2×Premix ExTaq Probe qPCR 10μL，上述SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的引物和如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的探针各0.5μL(浓度为10μmol/L)，ddH

若HEX通道和FAM通道Ct值＜35，且均出现S型扩增曲线，则表明样本均含有猫细小病毒和猫艾滋病毒；若HEX通道Ct值＜35且出现S型扩增曲线，但FAM通道无Ct值且不出现S型扩增曲线，表明样本仅含猫细小病毒；若FAM通道Ct值＜35且出现S型扩增曲线，但HEX通道无Ct值且不出现S型扩增曲线，表明样本仅含猫艾滋病毒；若HEX通道和FAM通道均无Ct值且无S型扩增曲线，表明样本中无猫细小病毒和猫艾滋病毒，若HEX通道和FAM通道任一Ct值＞35且出现S型扩增曲线，则需要重复检测，结果相同时表明含有猫细小病毒或猫艾滋病毒。

本发明荧光定量PCR实验从核酸提取到qPCR扩增检测，全程只需要2h左右，时间较短，并且该试剂盒操作简单，最低检测限可达4.32×10

附图说明

图1为实施例1检测样本的qPCR扩增曲线图。

图2为实施例3猫细小病毒和猫艾滋病毒的荧光定量PCR检测试剂盒的特异性检测结果示意图；其中，含猫细小病毒和猫艾滋病毒目的序列的阳性样本经PCR扩增后出现典型的S型扩增曲线，其余样本无S型扩增曲线出现，表明该试剂盒特异性较好。

图3为实施例4猫细小病毒的荧光定量PCR检测试剂盒的标准曲线；其中阳性重组质粒用ddH

图4为实施例5猫细小病毒和猫艾滋病毒的荧光定量PCR检测试剂盒的灵敏性检测结果示意图；其中阳性重组质粒用ddH

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的分析。

实施例1：荧光定量PCR方法检测猫细小病毒和猫艾滋病毒

通过将猫细小病毒NS1基因和猫艾滋病毒pol基因的核酸序列进行序列比对后，发现二者无同源性，序列无交叉。然后将其序列分别通过Primer Premier 5和BeaconDesigner设计引物和探针，并通过上海生工生物工程股份有限公司合成。所述的用于检测猫细小病毒的上游引物、下游引物序列、探针序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.5所示。所述的用于检测猫艾滋病毒的上游引物、下游引物序列、探针序列分别如SEQID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6所示。

SEQ ID NO.1：5’-GGCAAGCAATCCTCAGAGTC-3’

SEQ ID NO.2：5’-GAGTACTCCACGGTTCCAGT-3’

SEQ ID NO.3：5’-ACTCCGGACGTAGTGGACCTTGC-3’

SEQ ID NO.4：5’-TGTACTTCCAGTCGAGCTTCT-3’

SEQ ID NO.5：5’-HEM-ACTCCGGACGTAGTGGACCTTGC-BHQ-3’

SEQ ID NO.6：5’-FAM-TGGGCTAGCCAAGCTATTCCAGACTTG-TAMRA-3’

使用上述的引物和探针进行荧光定量PCR扩增，通过扩增曲线快速准确地检测猫细小病毒和猫艾滋病毒。具体的荧光定量PCR方法如下：

(1)提取DNA：使用QIAamp DNA Mini Kit提取DNA；具体操作步骤为：样品中加入20μL Proteinase K，然后加入200μL BufferAL，涡旋振荡15s混匀。70℃孵育10min，将试管快速离心，加入200μL无水乙醇，漩涡15s后离心，用吸管将混合液移取到含有QIAamp Minispin column的收集管，以8000r/min的速度离心1min，弃去上清。将QIAamp Mini spincolumn置于新的2ml收集管中，加入500μL Buffer AW1，以8000r/min的速度离心1min，弃去上清。将QIAamp Mini spin column置于新的2mL收集管中，加入500μL Buffer AW2，以14000r/min的速度离心1min，弃去上清。将QIAamp Mini spin column置于新的2mL收集管中，全速离心1min。将QIAamp Mini spin column置于新的1.5mL收集管中，加入200μLBuffer AE，室温孵育1min。以8000r/min的速度离心1min以洗脱DNA。将提取的DNA保存于-80℃。

(2)DNA扩增体系：反应总体积为20μL，其中包括DNA模板2μL，2×Premix ExTaqProbe qPCR 10μL，上、下游引物和探针各0.5μL(浓度为10μmol/L)，ddH

(3)qPCR扩增条件：以95℃预热30s，95℃变性10s，60℃退火20s为一个循环周期，共40个循环周期。

(4)结果判定：若HEX通道和FAM通道Ct值＜35，且均出现S型扩增曲线，则表明样本均含有猫细小病毒和猫艾滋病毒；若HEX通道Ct值＜35且出现S型扩增曲线，但FAM通道无Ct值且不出现S型扩增曲线，表明样本仅含猫细小病毒；若FAM通道Ct值＜35且出现S型扩增曲线，但HEX通道无Ct值且不出现S型扩增曲线，表明样本仅含猫艾滋病毒；若双检测通道均无Ct值且无S型扩增曲线，表明样本中无猫细小病毒和猫艾滋病毒；若任一Ct值＞35且出现S型扩增曲线，则需要重复检测，结果相同表明含有猫细小病毒或猫艾滋病毒。

实施例2：检测猫细小病毒和猫艾滋病毒的荧光定量PCR检测试剂盒

一种荧光定量PCR检测猫细小病毒和猫艾滋病毒的试剂盒包括核酸提取试剂和qPCR检测试剂。其中核酸提取试剂包括包括Proteinase K、Buffer AL、Buffer AW1、BufferAW2和Buffer AE。qPCR检测试剂包括2×Premix ExTaq Probe qPCR 10μL(含有Takara ExTaqHS，Mg

实施例3：采用实施例1体系进行的特异性检验

取含猫细小病毒和猫艾滋病毒目的基因扩增序列的质粒为阳性对照，以猫杯状病毒疫苗株、猫疱疹病毒疫苗株作为实验组，提取DNA，以特异性的探针和引物进行qPCR扩增。其中步骤包括：(1)DNA提取：通过QIAamp DNA Mini Kit进行提取后置于-80℃备用。(2)qPCR扩增：扩增体积为20uL，包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的引物和如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的探针各0.5uL(浓度为10μmol/L)，2×Premix ExTaq Probe qPCR 10uL，ddH

检测结果如图2显示，阳性对照在HEX和FAM通道的Ct值＜35，并出现S型扩增曲线，表明含猫细小病毒和猫艾滋病毒，其余两种病毒疫苗均无Ct值和S型扩增曲线，表明该体系特异性良好。

实施例4：采用实施例1中PCR扩增条件建立的标准曲线

以含有猫细小病毒和猫艾滋病毒目的序列的质粒为模板，以SEQ ID NO.1～SEQID NO.4所示的上游和下游引物进行PCR扩增，目的基因扩增序列与质粒连接得到阳性重组质粒后，将阳性重组质粒导入大肠杆菌，挑选阳性克隆，提取阳性重组质粒，PCR和测序鉴别阳性重组质粒。用分光光度计测定阳性重组质粒浓度，用ddH

实施例5：采用实施例1中PCR扩增条件进行的灵敏度检验

目的基因扩增序列与质粒连接得到阳性重组质粒后，将阳性重组质粒导入大肠杆菌，挑选阳性克隆，提取阳性重组质粒，PCR和测序鉴别阳性重组质粒。用分光光度计测定阳性重组质粒浓度，用ddH

上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 杭州奥泰生物技术股份有限公司

<120> 一种用于同时检测猫细小病毒和猫艾滋病毒的荧光定量PCR检测引物、探针和试剂盒

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

ggcaagcaat cctcagagtc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

gagtactcca cggttccagt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

actccggacg tagtggacct 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 4

tgtacttcca gtcgagcttc t 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 5

actccggacg tagtggacct tgc 23

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 6

tgggctagcc aagctattcc agacttg 27